Идентификация рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах, произведенных из гибридных генно-инженерно-модифицированных растений

РезюмеВ статье представлена оценка метода количественного определения трасформационных событий MON 863ЧMON 810 с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции в пищевых продуктах, произведенных из гибридной генно-инженерно-модифицированной кукурузы MON 810ЧMON 863. Подтвержден предел количественного определения целевой рекомбинантной ДНК (0,1%). Точность количественного определения метода, установленная путем измерения систематической погрешности, и относительное стандартное отклонение результатов в условиях их повторяемости были в пределах 25% для каждого уровня ГМО, что соответствует требованиям, предъявляемым к методам количественного определения рекомбинантной ДНК.

Ключевые слова:пищевые продукты, генетически модифицированные организмы (ГМО), генетически модифицированные гибридные растения, рекомбинантная ДНК, полимеразная цепная реакция

Вопр. питания. - 2012. - № 1. - С. 44-48.

Рост мирового производства генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в последние годы в значительной степени происходит за счет зерновых культур, являющихся носителями нескольких генетических конструкций или одной, содержащей несколько смысловых генов (stacked events) [11]. Такие культуры к началу 2011 г. выращивали в 11 странах мира; они составляли 22% мировых посевных площадей, занятых ГМО [11].

Для мониторинга производства и оборота ГМО в большинстве стран мирового сообщества в законодательном порядке введено требование обязательного этикетирования пищевой продукции, содержащей ГМО или произведенной из ГМО [5, 13, 14]. Разработаны, стандартизированы и внедрены в практику методы идентификации и количественного определения рекомбинантной ДНК, являющейся мишенью для обнаружения ГМО [1-3, 7, 9, 16]. Выход на мировой продовольственный рынок пищевой продукции, произведенной из генно-инженерно-модифицированных культур с комбинированными признаками, потребовал разработки новых методических подходов, обеспечивающих определение нескольких трансформационных событий и смысловых генов. Для этих целей используют мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с электрофоретической или гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов и ген-чип-технологии [8, 10, 12, 15].

Целью настоящей работы была оценка применения мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов в реальном времени с использованием праймеров на трансформационные события* MON810 и MON863 для количественного определения рекомбинантной ДНК, характерной для генетически модифицированной кукурузы, и трансформационное событие* MON810ЧMON863, являющейся гибридным растением с комбинированными признаками.

Таблица 1. Структура праймеров и зондов, используемых для исследования рекомбинантной ДНК

Материал и методы

Гибрид MON 810ЧMON 863 получен путем традиционного скрещивания 2-х ГМО: кукурузы, устойчивой к жесткокрылым насекомым, в том числе к жуку диабротика (Diabrotica spp.), трансформационное событие MON863, и кукурузы, устойчивой к чешуекрылым насекомым, в том числе к зерновому точильщику (Ostrinia nubilalis), трансформационное событие MON810.

Учитывая возможность применения методов количественного определения рекомбинантной ДНК с праймерами, специфичными для трансформационных событий MON810 и MON863, для анализа гибридной линии MON810ЧMON863 использовали методы, которые соответствовали методам определения правильности и прецизионности стандартого метода измерения [4]. Проведено исследование образцов муки, полученной из зерна кукурузы линий MON810 и MON863, а также образцов муки, полученной из гибрида MON810ЧMON863. Тестируемая кукурузная мука содержала до 10,0% целевой ДНК. Для оценки специфичности метода исследовали образцы муки кукурузы линий NK 603 и сои линии 40-3-2. Каждый анализ проводили в 6 повторах. При приготовлении образцов кукурузной муки и построении калибровочных прямых были использованы следующие сертифицированные стандартные образцы, изготовленные в Институте стандартных материалов и измерений (Бельгия), - ERM-BF413b, ERM-BF 413d, ERM-BF 413f (линия MON 810); ERM-BF 416b, ERM-BF 416c, ERM-BF 416d (линия MON 863); ERM-BF 415d (линия NK 603); ERM-BF410dk (линия 40-3-2); ERM-BF 417b, ERM-BF 417c и ERM-BF 417d (гибрид MON810ЧMON863) [6].

ДНК из 50 мкг каждого образца выделяли стандартным методом с использованием сорбента и набора реагентов "ДНК-сорб-С" (производство ФГУН "ЦНИИЭ Роспотребнадзора", Москва). Для определения относительного содержания рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линий MON810 и MON863, использовали мультиплексную ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов в реальном времени. Анализ включал 2 реакции с зондами TagMan, специфичными для трансформационных событий MON 810 и MON 863. В качестве эндогенного контроля использовали ДНК генов, присутствующих в геноме всех линий кукурузы: ген алкогольдегидрогеназы-1 (Adh1) и ген, кодирующий синтез высокомобильной группы белков (hmg). Структура праймерных систем представлена в табл. 1. Для каждой праймерной системы использовали отдельную реакционную смесь. Состав реакционной смеси представлен в табл. 2. Реакция проходила при следующих температурных параметрах: 95°С - 15 мин, далее 40 циклов: 95 °С - 10 сек, 59°С - 60 сек. Для проведения амплификации использовали амплификатор "RotorGene-6000" (Германия).

Таблица 2. Состав реакционной смеси для проведения количественного анализа целевой ДНК, общая схема

Результаты и обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что методом ПЦР с гибридизационнофлюоресцентной детекцией и использованием праймеров на трансформационные события, рекомбинантная ДНК, характерная для кукурузы линий MON810 и MON863, количественно определяется во всех образцах муки, полученной из гибридной кукурузы MON810ЧMON863 (табл. 3, 4). Количественная идентификация целевой ДНК в образцах муки из гибридной кукурузы, содержащей 0,1% ГМО, подтверждает предел количественного определения оцениваемых методов [18]. Отсутствие положительного результата при анализе образцов муки, произведенной из кукурузы линии NK 603 и сои линии 40-3-2, свидетельствует о специфичности методов трансформационным событиям MON810 и MON863.

Относительное стандартное отклонение повторяемости результатов при тестировании образцов муки, полученных из зерна кукурузы линий MON 810, MON 863 и гибрида MON 810ЧMON 863 не превышало 25% при всех уровнях ГМО (табл. 3, 4).

Таблица 3. Сравнение точности и прецизионности метода количественного определения MON 810 при исследовании образцов муки из зерна кукурузы линии MON810 и гибридной кукурузы MON 810ЧMON863

Таблица 4. Сравнение точности и прецизионности метода количественного определения MON863 при исследовании образцов муки из зерна кукурузы линии MON863 и гибридной кукурузы MON810ЧMON863

Эти результаты свидетельствуют о соответствии прецизионности [4] требованиям, предъявляемым к методам количественного определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах [17]. Следует также отметить близость значений стандартного отклонения повторяемости при анализе муки из гибридной кукурузы и кукурузы линий MON810 и MON863.

Анализ систематической погрешности результатов показал ее увеличение при тестировании образцов муки из гибридной кукурузы по сравнению с результатами тестирования образцов из зерна кукурузы конкретных линий (см. табл. 3, 4.) Вместе с тем это увеличение не превысило 25% для всех уровней ГМО, что находится в соответствии с требованиями, предъявляемыми к методам количественного определения ГМО [17]. Полученные данные согласуются с результатами исследований гибридных сортов кукурузы с комбинированными признаками, проведенными в лабораториях европейских научных центров [17, 18].

Таким образом, результаты анализа пищевых продуктов, произведенных из конкретных линий ГМО MON810 и MON863 и гибридной линии, позволяют сделать следующий вывод. По результатам сравнения показателей точности, презиционности, пределу количественного определения, специфичности методов ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией и использованием праймеров на трансформационные события эти методы можно применять для количественного определения рекомбинантной ДНК, содержащейся в пищевой продукции, произведенной из гибридных генно-инженерно-модифицированных растений с комбинированными признаками.

Литература

1. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения. ГОСТ Р 52173-2003. - М.: Госстандарт России, 2004. - 11 с.

2. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа. ГОСТ Р 52174-2003. - М.: Госстандарт России, 2004. - 14 с.

3. Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. МУК 4.2.2304-07. Сборник методических указаний. Ч. 1. - Роспотребнадзор, 2008. - 83 с.

4. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений. ГОСТ ИСО 5725-4-2002. - M.: Госстандарт России, 2002. - 32 с.

5. Федеральный закон Российской Федерации от 25 октября 2007 г. N 234-ФЗ "О внесении изменений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей”" и часть вторую Гражданского кодекса Российской Федерации. Сertified Reference Materials 2011. The Institute for Reference Materials and Measurements, JRC. EС. цитировано по http://irmm.jrc.ec.europa.eu.

6. Compendium of reference methods for GMO analysis. JRC Reference reports, European Network of GMO Laboratories. - 2011. - 259 p.

7. Dinon A.Z., Rins T. W., Dijk J.P. et al. // Anal. Bioanal. Chem. - 2011. - Vol. 400. - P. 1433-1442.

8. Foodstuffs - Methods of analysis for genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods. Reference N ISO 21570:2005(E). - Geneva: ISO, 2005. - 94 р.

9. Gasparic M.B., Tengs T., La Paz J.L. et al. // Anal. Bioanal. Chem. - 2010. - Vol. 396. - P. 2023-2029.

10. Global Status of Commercialized Biotech. GM Crops:2010. ISAAA Brief 42-2010. Цит. по: http://www.isaaa.org.

11. Kim Su-Y., Kim J., Lee H. et al. // Food Sci. Biotechnol. - 2010. - Vol. 19,N. 4. - P. 1029-1033.

12. Labeling Standard for Genetically Modified Foods. Notification N 517 of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of March 31. - 2000. Цит. по: http://faolex.fao.org/docs/pdf/jap27575.pdf.

13. Regulation (EC) N 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed // Official Journal of the European Union. - 2003. - L. 268. - Р. 1-26.

14. Shrestha H.K., Hwu K-K., Chang M.-C. // Afr. J. Biotechnol. - 2010. - Vol. 9, N 34. - P. 5581-5589.

15. Sun H.C. // Anal. Bioanal. Chem. - 2011. - Vol. 401. - P. 6 47- 6 5 5 .

16. Verification of Performances of MON 863 and MON 810 Event-specific Methods on the Hybrid MON 863 x MON 810 using Real-Time PCR. Сommunity reference laboratory for GM food and feed, 2006. Цит. по: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu.

17. Xu W., Yun Y., Luo Y., Bai W. et al. // J. Agric. Food Chem. - 2009. - Vol. 57, N 2. - P. 395-402.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»