Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов

РезюмеПредставлены результаты оценки репродуктивной функции крыс на модели раздельного и сочетанного воздействия дефицита пантотената кальция (витамина B5) и интоксикации кадмием (Cd2+). Исследования выполнены на крысах Вистар, всего в работе было использовано 280 взрослых животных и 890 крысят. Репродуктивную функцию оценивали по фертильности родительских животных и характеру пренатального и постнатального развития их потомства. Показано, что раздельное и сочетанное воздействие дефицита пантотената кальция и интоксикации кадмием в период ссаживания и беременности не влияло на фертильность и плодовитость крыс, пред- и постимплантационную гибель эмбрионов, выживаемость потомства, а также не вызывало развития аномалий скелета и внутренних органов. Вместе с тем в пренатальном периоде онтогенеза данное воздействие проявлялось снижением массы тела и роста плодов, в постнатальном - отставанием развития крысят по всем изученным морфофункциональным показателям, а также увеличением числа мертворожденных в потомстве.

Ключевые слова:репродуктивная функция крыс, пренатальное развитие потомства, постнатальное развитие потомства, дефицит пантотената кальция, кадмий, интоксикация

Вопр. питания. - 2012. - № 1. - С. 33-43.

Репродуктивная функция осуществляется как сложноорганизованная последовательность физиологических процессов, протекающих в организмах родительских особей и их потомства. Сложность феномена репродукции делает его уязвимым для неблагоприятных воздействий на любом этапе реализации функции, поэтому изучение репродуктивной токсичности служит одним из информативных критериев при гигиенической оценке факторов окружающей среды, в частности, новых источников пищевых веществ [7-9]. Существенным ограничением использования методов оценки репродуктивной токсичности являются их продолжительность и трудоемкость. Однако высокая информативность данных, обеспечивающая запас прочности и безопасности изучаемого объект а, в том числе для здоровья последующих поко- лений, - важный аргумент в пользу проведения таких исследо ваний.

Комплексная оценка репродуктивной функции включает изучение большого числа параметров, причем каждый из них имеет широкий диапазон физиологических колебаний [4, 25, 33]. Неоднородное распределение значений некоторых показателей может привести к затруднениям в интерпретации результатов, особенно в условиях воздействий малой интенсивности. Действительно, распознавание реакции организма в диапазоне физиологической адаптации - псевдоадаптации (компенсированного скрыт ого патологического процесса) [3, 12] - весьма сложная задача даже для современной лаборатории, поэтому моделирование дополнительной нагрузки, снижающей адаптационный потенциал и, соответственно, исключающей возможность компенсации патологического процесса, является перспективным инструментом повышения диагн остической достоверности результатов эксперимента.

Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является использование рациона, дефицитного по содержанию витаминов [31]. Для целей данного исследования была выбрана модель дефицита пантотената кальция (витамин B5), биологическая роль которого хорошо изучена: пантотеновая кислота как составляющая кофермента А, участвует в метаболизме жирных кислот, стеролов и других компонентов, синтезируемых из изотерпеноидов, в реакциях синтеза и посттрансляционных модификациях (терминальное ацетилирование, ацилирование) белковых молекул и др. [14]. Дефицит пантотената кальция и связанные с ним метаболические нарушения приводят к снижению адаптационных возможностей организма [19, 31] и, как следствие, повышают чувствительность к токсическому воздействию.

В качестве токсического фактора был выбран кадмий (Cd2+) - один из наиболее изученных токсических агентов, чье действие на репродуктивную функцию подробно охарактеризовано [2, 5, 20]. На основании данных о характере поражения репродуктивной функции в зависимости от дозы и времени экспозиции [5] была использована заведомо действующая доза кадмия - 10 мг на 1 кг массы тела (в пересчете на Cd2+); крысы получали кадмий в период ссаживания и беременности.

Целью настоящей работы было выявление наиболее чувствительных показателей репродуктивной функции крыс в условиях раздельного и сочетанного воздействия алиментарного и токсического факторов.

Материал и методы

Исследования выполнены на крысах Вистар; было использовано 280 взрослых животных (200 самок и 80 самцов) и 890 крысят. Исходная линия крыс (самцы и самки, возраст - 30-35 дней) получена из питомника лабораторных животных "Столбовая" РАМН. Животные были произвольно разделены на 4 группы - контрольную и 3 опытных (по 50 самок и 20 самцов в каждой группе). На протяжении всего срока эксперимента (за исключением периода ссаживания и беременности) крысы всех групп получали полусинтетический казеиновый рацион (табл. 1). Животных опытных групп в период ссаживания и беременности подвергали раздельному и сочетанному воздействию алиментарного и токсического факторов: крысы 1-й опытной группы получали рацион с дефицитом пантотената кальция (табл. 2), 2-й группы получали с питьевой водой сульфат кадмия (из расчета 10 мг Cd2+ на 1 кг массы тела), 3-й группы - 10 мг/кг Cd2+ на фоне рациона с дефицитом витамина В5.

Для оплодотворения самок подсаживали к самцам в соотношении 2:1 на 7 сут. В период спаривания возраст крыс составлял 105-110 дней. В течение эксперимента вели наблюдение за поедаемостью корма, массой тела и общим состоянием животных.

Репродуктивную функцию оценивали по фертильности родительских животных и характеру пренатального и постнатального развития потомства. Фертильность (способность к оплодотворению) определяли по эффективности спаривания самок и самцов, выраженной в процентном отношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Так как самок ссаживали с самцами в соотношении 2:1, беременность обеих или одной самки подтверждала фертильность самца; если ни одна из самок не забеременела, самец считался нефертильным, а обе самки - потенциально фертильными.

Таблица 2. Смесь водорастворимых витаминов

Для изучения пренатального развития потомства по 8-13 беременных самок из каждой группы подвергали эвтаназии (умерщвлению) на 20-й день беременности; эвтаназию проводили в соответствии с приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 "Об утверждении правил лабораторной практики"; в рогах матки подсчитывали количество желтых тел, количество мест резорбции и мест имплантации, определяли число живых и мертвых плодов, вычисляли предымплантационную (по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке) и постимплантационную гибель (по разности между количеством мест имплантации в матке и количеством живых плодов). Плоды извлекали, проводили макроскопический осмотр, определяли массу и краниокаудальный размер [11]. После осмотра, измерения и взвешивания плоды каждого помета делили на 3 группы: у плодов 1-й группы выделяли и взвешивали внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие), плоды 2-й группы фиксировали в жидкости Буэна и использовали для изучения внутренних органов по методу J. Wilson [11, 32], плоды 3-й группы фиксировали в 96° этаноле и использовали для изучения состояния скелета по методу A. Dawson [11, 15].

Постнатальное развитие потомства оценивали в течение 1-го месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (масса тела и краниокаудальный размер), общему физическому развитию (сроки отлипания ушных раковин, по явления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, опускания семенников, открытия влагалища). Массу тела и краниокаудальный размер крысят измеряли на 2, 5, 10, 15, 20 и 25-е сутки их жизни. Также определяли среднюю величину помета, соотношение самцов и самок, вычисляли выживаемость с 0-го по 5-й день жизни (отношение числа крысят, дожив - ших до 5-го дня, к числу родившихся живыми), а также с 6-го по 25-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня). Исследования выполнены в соответствии с требованиями, изложенными в методических указаниях [6, 11], а также с учетом рекомендаций международных организаций [19, 28].

Результаты приведены в виде М±m и min-max, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка, min и max - соответственно минимальное и максимальное значения измеряемой величины, а также в долях (%) или абсолютных числах.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ SPSS 17.0. Характер распределения значений определяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помощью критерия Левена. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметрический аналог для независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [10, 27].

В соответствии со структурой исследования сравнивали количественные признаки у плодов и крысят опытных групп по сравнению с соответствующими количественными признаками у животных контрольной группы.

Результаты и обсуждение

Общее состояние животных было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению, скорости роста крысы; опытные группы по этим показателям не отличались от контрольной; поедаемость корма составляла 11,7-22,7 г/сут (для самцов) и 13,1-19,6 г /сут (для самок). Еженедельный прирост массы тела крыс всех групп в возрасте 30-93 дней был характерен для животных данного вида и возраста [16, 22, 29].

Эффективность спаривания крыс во всех группах соответствовала ожидаемой при данных условиях эксперимента: у самок этот показатель составлял 80-83%; у самцов контрольной группы, а также 1-й и 3-й опытных групп - 100%, а у животных 2-й опытной группы - 93% (табл. 3). Таким образом, фертильность животных родитель ского поколения соответствовала оптимальному уровню, так как при ссаживании на период одного эстрального цикла эффективность спаривания здоровых животных может варьировать в диапазоне 50-95% [24, 25].

При макроскопическом исследовании внутренних органов беременных самок не выявлено значимых различий между животными контрольной и опытных групп: количество желтых тел и мест имплантации, количество резорбций, живых и мертвых плодов, а также пред- и постимплантационная гибель эмбрионов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс Вистар (табл. 4).

Обследование плодов по методу J. Wilson [11, 32] не выявило аномалий развития внутренних органов (рис. 1). Формирование основных анатомических систем - нервной (головной, спинной мозг), сенсорной (глазные яблоки, обонятельные луковицы), сердечно-сосудистой (сердце), дыхательной (трахея, легкие, бронхи), пищеварительной (слюнные железы, язык, пищевод, желудок, кишечник, печень), мочевыделительной (почки, мочевой пузырь), половой (внутренние половые органы), локомоторной (череп, позвоночник, диафрагма) - у плодов контрольной и опытных групп протекало без особенностей. Вместе с тем оценка зоометрических параметров выявила ряд различий между плодами контрольной и опытных групп: масса тела и краниокаудальный размер плодов животных опытных групп были ниже, а масса внутренних органов (печени, почек, легких) выше, чем у плодов контрольной группы (табл. 5).

Обзорные исследования скелета по методу A. Dawson [11, 15] не выявили аномалий разви- тия скелета плодов контрольной и опытных групп (рис. 2). Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа (рис. 3) плодов 1-3-й опытных групп бы ла несколько ниже, чем в контрольной группе: соответственно на 1-3 (p>0,05), 3-7 и 5-8% (p<0,05) (табл. 6).

Постнатальное развитие потомства характеризовалось высокой выживаемостью крысят в контрольной и опытных группах: в период с 0-го по 5-й день жизни выживаемость потомства составляла 94-99%, с 6-го по 25-й дни - 98-99% (табл. 7). Следует отметить, что при расчете выживаемости не учитывали пометы, уничтоженные материнскими животными 1-й и 3-й опытных групп; всего было уничтожено соответственно 3 (13%) и 7 (32%) пометов. Высокий уровень каннибализма в этих группах, по-видимому, обусловлен физиологической необходимостью восполнения дефицита пантотената кальция, вероятно, достигшей критического уровня в конце беременности. Действительно, у крыс каннибализм является существенным популяционным механизмом стратегии саморегуляции [1]. Однако в данном случае не было оснований полагать, что самки целенаправленно элиминировали нездоровое потомство: отсутствие аномалий развития и высокая выживаемость во всех группах свидетельствуют о высоком жизненном потенциале крысят.

Средняя величина пометов у крыс опытных групп соответствовала нижней границе нормы для данного показателя у крыс Вистар [13, 17, 21, 23, 25, 26, 30], однако была несколько ниже, чем у крыс контрольной группы: в 1-й и 3-й опытных группах - на 17%, во 2-й - на 10% (p>0,05). Поскольку среднюю величину помета рассчитывали без учета мертворожденных крысят, полученные результаты, очевидно, обусловлены не пониженной плодовитостью самок, а высоким количеством мертворожденных в потомстве опытных групп.

Таблица 3. Эффективность спаривания крыс

Рис. 1. Обследование внутренних органов плодов по методу J.G. Wilson:

1-й разрез - нижняя челюсть, язык, передние отделы твердого нёба и носовой полости; 2-й - глазные яблоки и обонятельные луковицы; 3-й разрез - кора больших полушарий головного мозга, боковых и третьего желудочка; 4-й разрез - мозжечок, четвертый желудочек и продолговатый мозг; 5-й разрез - гортань, пищевод, позвоночник, спинной мозг и слюнные железы; 6-й разрез - пищевод, трахея, спинной мозг; 7-й разрез - сердце, легкие, бронхи, спинной мозг; 8-й разрез - печень (а), диафрагма (б); 9-й разрез - почки, печень, кишечник, желудок (в), после удаления петель кишечника и печени - почки, мочеточники, мочевой пузырь, прямая кишка, внутренние половые органы (г)

Рис. 2. Обзорное исследование скелета плодов по методу A.B. Dawson

Рис. 3. Исследование скелета плодов по методу A.B. Dawson:

а) измерение длины нижней челюсти; б) измерение длины плечевой, лучевой и локтевой костей; в) измерение длины бедренной, большеберцовой и малоберцовой костей

Таблица 4. Пренатальное развитие потомства

Соотношение самцов и самок в опытных группах несколько отличалось от такового в контроле, но находилось в пределах физиологических колебаний, характерных для данной линии крыс [13, 17, 21, 23, 25, 26, 30]. Комплексная оценка постнатального онтогенеза потомства крыс в течение 1-го месяца жизни выявила значительное отставание развития крысят опытных групп от контрольной по всем изученным морфофункциональным показателям (табл. 8-9). Так, в период со 2-го по 10-й день жизни масса тела потомства в 1-й и 3-й опытных группах была более чем на 20% (p<0,05) ниже, чем в контрольной группе, в период с 15-го по 25-й день жизни - более чем на 13% (p<0,05), краниокаудальный размер - соответственно на 10 и 6% (p<0,05). Во 2-й опытной группе отличия от контроля были менее выражены: отставание массы тела за весь период наблюдения не превышало 5-9% (p<0,05), краниокаудального размера - 2-4% (p<0,05). Задержка физического развития крысят в 1-й и 3-й опытных группах в среднем составляла 1,5-2 дня, во 2-й - 1 день (p<0,05) (табл. 10).

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что раздельное и сочетанное действие алиментарного и токсического факторов в период ссаживания и беременности не влияет на фертильность и плодовитость крыс, пред- и постимплантационную гибель эмбрионов, выживаемость потомства, а также не вызывает развития аномалий скелета и внутренних органов.

Вместе с тем в пренатальном периоде онтогенеза отрицательное действие этих факторов проявляется снижением массы тела и роста плодов, в постнатальном - отставанием развития крысят по всем изученным показателям, а также увеличением числа мертворожденных в потомстве. Выявленные изменения были наиболее выражены у животных 3-й группы, в меньшей степени - в 1-й и во 2-й группах.

Таким образом, использованная экспериментальная модель позволила выявить наиболее чувствительные показатели, свидетельствующие о репродуктивной токсичности исследуемого объекта: это морфофункциональные критерии постнатального онтогенеза потомства (динамика зоометрических показателей, физическое развитие), традиционно применяемые при оценке репродуктивной функции. Дефицит пантотеновой кислоты в рационе ведет к снижению адаптационного потенциала беременных крыс, поэтому данная модель может быть использована в гигиенических исследованиях с целью выявления токсических свойств малотоксичных компонентов, в частности новых источников пищи.

Таблица 5. Зоометрические показатели плодов на 20-й день пренатального развития

Таблица 6. Длина участков оссификации в закладках костей плодов

Таблица 7. Постнатальное развитие потомства

Таблица 8. Динамика массы тела крысят

Таблица 9. Динамика роста крысят

Таблица 10. Физическое развитие крысят

Литература

1. Арутюнян Л.С., Дулицкий А.И. Каннибализм и генеративная активность - ключевые популяционные адаптации серой крысы (Rattus Norvegicus Berk.) по использованию пищевого ресурса во время сезонных пессимумов // Ученые записки ТНУ. - 2004. - Т. 17, № 56. - С. 192-197.

2. Волкова Н.А., Карплюк И.А. // Вопр. питания. - 1990. - № 1. - С. 74-76.

3. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. - М.: Медицина, 1986. - 280 с.

4. Куценко С.А. // Рос. биомед. журн. - 2003. - Т. 4. - С. 188-284.

5. Литвинов Н.Н., Казачков В.И., Астахова Л.Ф. // Вопр. питания. - 1989. - № 4. - С. 86-88.

6. Медико-биологическая оценка безопасности генноинженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: Методические указания МУ 2.3.2.2306-07. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 21 с.

7. Принципы оценки безопасности пищевых добавок и контаминантов в продуктах питания. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 70. - Женева: МПХБ/ВОЗ, 1991. - 160 с.

8. Принципы оценки риска для потомства в связи с воздействием химических веществ в период беременности. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 30. - Женева: МПХБ/ВОЗ, 1988. - 156 с.

9. Принципы токсикологической оценки остаточных количеств пестицидов в пище. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 104. - Женева: МПХБ/ВОЗ, 1992. - 144 с.

10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских дан-ных. Применение пакета прикладных программ Statistica. - М.: Медиа Сфера, 2006. - 312 с.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.

12. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии, при оценке опасности химических соединений. - М.: Медицина, 1975. - 328 с.

13. Aoyama H., Kikuta M., Shirasaka N. et al. // Congenital Anomalies. - 2002. - Vol. 42. - P. 194-201.

14. Caballero B. Encyclopedia of Human Nutrition. 2nd ed. - Amsterdam: Elsevier Science, 2005. - 2000 p.

15. Dawson A .B. // Stain Technol. - 1926. - Vol. 1. - P. 123-124.

16. Derelanko M.J., Hollinger M.A. Handbook of Toxicology. 2nd ed. - USA: CRC Press, 2001. - 1414 p.

17. Ema M., Itami T., Kawasaki H. // J. Appl. Toxicol. - 1992. - Vol. 12, N 3. - P. 179-183.

18. FDA/CFSAN/OFAS. 2004 (update). Redbook 2000, Toxicological principles for the safety assessment of food ingredients. Food and Drug Admin/Center for Food Safety and Applied Nutrition/Office of Food Additive Safety. - Washington, DC. - 134 р.

19. Frisancho R.A. Human Adaptation and Accommodation. - Michigan: University of Michigan Press, 1993. - 532 p.

20. Goyer R., Klaassen C., Waalkes M. Metal toxicology. - Michigan: Academic Press, 1995. - 525 p.

21. Griffiths J.C., Borzelleca J.F., Cyr J.S. // Food Chem. Toxicol. - 2007. - Vol. 45. - P. 388-395.

22. Hood R.D. Developmental and Reproductive Toxicology: A Practical Approach. 2nd ed. - USA: CRC Press, 2006. - 1168 p.

23. Liberati T.A., Roe B.J., Feuston M.H. // Drug Chem. Toxicol. - 2002. - Vol. 25, N 1. - P. 109-130.

24. Mandl A.M. // J. Exp. Biol. - 1951. - Vol. 28. - P. 576-584.

25. Marty M.S., Allen B., Chapin R.E. et al. // Br. Defects Res. (Pt B). - 2009. - Vol. 86. - P. 470-489.

26. Noda T. // J. Health Sci. - 2001. - Vol. 47, N 6. - P. 544-551.

27. Norusis M.J. SPSS statistics 17.0 guide to data analysis. - Upper Saddle River: Prentice Hall, 2009. - 672 p.

28. OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development). Draft guidance document on reproductive toxicity testing and assessment. - Paris: OECD, 2004. - 68 p.

29. Pullen A.H. // J. Anat. - 1976. - Vol. 121. - P. 371-383.

30. Saito F.H., Damasceno D.C., Kempinas W.G. et al. // Diabetol. Metab. Syndr. - 2010. - Vol. 2, N 26. - P. 1-8.

31. Thimann K.V. Vitamins and Hormones. - London: Academic Press, 1980. - Vol. 37. - 353 p.

32. Wilson J.G. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1965. - Vol. 123. - P. 2 19 - 2 2 7.

33. Witorsch R.J. Reproductive Toxicology. - New York: Raven Press, 1995. - 335 p.