Изучение характера контаминации сырого молока бактериями рода Campylobacter с использованием традиционных микробиологических методов и количественного ПЦР-анализа

Резюме

Гастроэнтероколиты, вызванные бактериями рода Campylobacter, представляют собой наиболее распространенные острые инфекционные зоонозные заболевания с пищевым путем передачи. Одним из важных факторов передачи инфекции является контаминированная молочная продукция, поэтому оценка загрязненности молочного сырья кампилобактерами необходима для разработки эффективных мер подавления роста возбудителя и обеспечения безопасности продуктов.

Цель исследования - изучение микробного фона образцов сырого молока и характера контаминации их термофильными бактериями рода Campylobacter.

Материал и методы. Исследовано 60 проб сырого молока из центральных областей РФ и 48 экспериментально зараженных кампилобактериями образцов молочного сырья. Для оценки микробной контаминации молока определяли количество посторонней микрофлоры, включая колиформные бактерии (БГКП). Выявление и определение количества бактерий рода Campylobacter проводили культуральными методами в сопоставлении с количественным анализом методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализ). Для ПЦР использовали праймеры, детектирующие видоспецифическую последовательность 16s рРНК C. jejuni, наличие гена цитолетального токсина cdtB и гена инвазии ciaB.

Результаты и обсуждение. Значительная часть исследованных проб сырого молока (31,6%) характеризовалась высокими уровнями микробной контаминации, превышающими 106 КОЕ/см3. Грамотрицательные бактерии являются доминирующим видом бактериальной микрофлоры, их уровни были сопоставимы с выявленными величинами общего количества микроорганизмов. БГКП обнаружены во всех исследованных образцах, их количество в 90% образцов достигало 105 КОЕ/см3, а в отдельных пробах - 107КОЕ/см3. Частота обнаружения Campylobacter spp. в сыром молоке составила 8,3%, а их количество колебалось в пределах от 0,1 до 100 КОЕ/см3 (в среднем 2,0x10 КОЕ/см3). Все выделенные штаммы кампилобактеров по комплексу фенотипических признаков были идентифицированы как вид C. jejuni. Проведен сравнительный анализ загрязненности сырого молока кампилобактерами методом ПЦР-РВ. Большинство проб (свыше 60%) были позитивными по наличию родоспецифической геномной последовательности 16SрРНК, при этом они характеризовались наиболее высокими значениями общей бактериальной обсемененности и количества БГКП. Применение мультипраймерного подхода (одновременное тестирование на наличие 16SрРНК и гена цитолетального токсина cdtB C. jejuni) уменьшало число позитивных случаев обнаружения ДНК кампилобактеров до 16,6%, что позволяет предполагать большую информативность гена cdtB в отношении выявления жизнеспособных, в том числе некультивируемых, клеток, обладающих токсигенностью. Ориентировочная оценка результатов в количественном формате свидетельствовала о высоких выявляемых уровнях бактерий рода Campylobacter - 104-106-5 геномных эквивалентов/см3, что указывает на возможное наличие жизнеспособных клеток Campylobacter в исследуемом материале со значительно большей частотой, чем установлена при культуральном посеве.

Заключение. Микробиологические методы посева при низких уровнях контаминации кампилобактерами не обеспечивают их достоверного выявления вследствие массивного загрязнения сырья посторонней микрофлорой. Campylobacter spp. обнаружены культуральным методом в 8,3% случаев, тогда как применение мультипраймерного ПЦР-анализа с генами cdtB и ciaB позволяет увеличить в 2 раза выявление C. jejuni в пробах сырого молока.

Ключевые слова:бактерии рода Campylobacter, сырое молоко, ПЦР-анализ, микробная контаминация

Для цитирования: Ефимочкина Н.Р., Стеценко В.В., Маркова Ю.М., Быкова И.Б., Пичугина ТВ., Полянина А.С., Минаева Л.П., Шевелева С.А. Изучение характера контаминации сырого молока бактериями рода Campylobacter с использованием традиционных микробиологических методов и количественного ПЦР-анализа // Вопр. питания. 2019. Т 88, № 5. С. 17-23. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10049

Изучение источников и частоты выделения патогенных микроорганизмов, а также условий их выживания и развития в пищевых продуктах имеет большое значение для обеспечения безопасности потребителей. Из числа бактериальных пищевых инфекций заболевания, вызываемые возбудителями рода Campylobacter, наиболее широко распространены и труднопреодолимы в системе обеспечения безопасности пищевых продуктов и профилактики кампилобактериоза [1-3]. Достоверное выявление источников контаминации кампилобактерами необходимо для создания методов контроля этих микроорганизмов в пище, разработки эффективных технологических режимов подавления роста или уничтожения контаминантов, обеспечения заданного микробиологического качества продуктов.

Учитывая широкую распространенность в природе бактерий рода Campylobacter и разнообразие источников контаминации, большое внимание на современном этапе уделяется частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах, в том числе на поверхностях оборудования и инвентаря предприятий пищевой промышленности. Несмотря на то что основным путем попадания кампилобактеров в организм человека является употребление зараженных мясных продуктов (особенно мяса птиц), одним из важных факторов передачи инфекции остается употребление контаминированного непастеризованного молока или выработанных из него молочных продуктов [4-8].

Микроорганизмы попадают в пищу как из внутренних, так и из внешних источников, с которыми продукт может контактировать в течение всего периода изготовления и до момента употребления. Источниками контаминации продуктов животного происхождения являются кожа, волосы и шерсть, слизистые оболочки, желудочно-кишечный и урогенитальный тракт, дыхательные пути, протоки молочной железы и сосковых каналов вымени молочных животных. Заболевания животных и птиц (кишечные инфекции, воспаления дыхательных путей и уринарной системы, маститы коров) способствуют увеличению частоты выделения бактериальных патогенов. Нарушение санитарных требований при забое животных приводит к загрязнению поверхностей туш и органов животных сальмонеллами, кампилобактерами и листериями [9]. При этом уровень контаминации непереработанной животноводческой продукции находится в прямой зависимости от интенсивности заражения и степени бактерионосительства птиц и животных.

Рассматривая основные источники животного происхождения, следует признать, что наиболее вероятной причиной распространения патогенов является фекальный путь заражения животного сырья, воды, почвы и других объектов внешней среды, из которых микроорганизмы могут попадать в пищевые продукты [10]. С фекальной контаминацией связывают широкое распространение в окружающей среде патогенных зоонозных бактерий Campylobacter jejuni. Фекальным загрязнением в ряде случаев объясняют попадание кампилобактеров в сырое молоко (табл. 1). Следует отметить, что частота загрязнения молока C. jejuni превышает аналогичные показатели для других патогенов.

Тем не менее условия попадания бактерий рода Campylobacter в сырое молоко и характер контаминации этими патогенами молочного сырья, используемого для производства различных видов пищевой продукции, изучены недостаточно [12, 13]. Поэтому цель данной работы - изучение микробного фона различных образцов сырого молока и выявление возможного присутствия в них кампилобактеров.

Исследования сырого молока включали выявление и подсчет количества термофильных кампилобактеров, определение общей бактериальной обсемененности и уровней контаминации грамотрицательными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae, включая бактерии группы кишечных палочек (БГКП). В задачи исследования также входила оценка видовой принадлежности выделенных штаммов Campylobacter spp.

Материал и методы

В работе исследовано 60 проб сырого молока из центральных областей РФ и 48 экспериментально зараженных образцов молочного сырья.

Исследования проводили в соответствии с ГОСТ 32901-2013 "Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа", МУК 4.2.2321-08 "Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах" и ГОСТ ISO 10272-1-2013 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения". Для посевов проб молока на наличие бактерий рода Campylobacter использовали питательные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, в том числе бульон Болтона, агар Престона с кровью, модифицированный угольный агар с дезоксихолатом натрия (агар mCCD) и кровяной агар. Пересев на поверхность агаризованных селективных сред и инкубирование проводили в микроаэрофильной атмосфере (10% СО2, 5% О2, 85% N2) при температуре 41,5±0,5 °С. Выросшие на поверхности селективного агара типичные колонии идентифицировали, тестируя их по совокупности культуральных, морфологических и биохимических признаков, определяющих принадлежность к бактериям рода Campylobacter.

Детекцию и количественное определение бактерий рода Campylobacter методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили по ГОСТ Р 57989-2017 "Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции". Для постановки ПЦР использовали праймеры, детектирующие видоспецифическую последовательность 16s рРНК для C. jejuni, наличие гена субъединицы В цитолетального токсина cdtB и гена инвазии ciaB. Экстракцию геномной ДНК проводили с использованием автоматизированной системы NucliSens easyMag (BioMerieux, Франция). Для количественного определения C. jejuni построены калибровочные кривые с использованием данных тестирования в качестве калибраторов 10-кратных разведений 4 тест-штаммов C. jejuni (см. рисунок).

Оценивали число копий ДНК кампилобактеров в исследуемых пробах методом количественной ПЦР-РВ. Кривые амплификации анализировали с помощью программного обеспечения системы ABI PRISM 7500 RealTime PCR (Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific, США).

Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15-94 "Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов", БГКП - по ГОСТ 31747-2012 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)".

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакетов программ Excel и SPSS 18.0.

Результаты и обсуждение

Анализ экспериментальных данных показал, что значительная часть (31,6%) исследованных проб сырого молока характеризуется высокими уровнями бактериального загрязнения - 106 КОЕ/см3 и более (табл. 2). Оценка контаминации молока колиформными бактериями свидетельствует о том, что эта группа микроорганизмов является доминирующей, ее уровни сопоставимы с общим количеством КМАФАнМ. БГКП обнаружены в 100% проб, при этом содержание колиформ в исследованных образцах молока достигало 107 КОЕ/см3 (в среднем - lg2,9±0,2, медиана - lg3,0). На фоне столь высокой микробной загрязненности число положительных проб, в которых были выявлены бактерии рода Campylobacter, составляло 8,3%, что указывает на достаточно высокую частоту их обнаружения в сыром молоке. Количество Campylobacter spp. в исследованных пробах колебалось в пределах от 0,1 до 100 КОЕ/см3 (в среднем 2,0х101 КОЕ/см3). Выделенные штаммы кампилобактеров по комплексу фенотипических признаков были идентифицированы как вид C. jejuni.

При изучении микробного фона исследованных образцов сырого молока одновременно проводили сравнительный анализ загрязненности их кампилобактерами методом ПЦР-РВ. Большинство проб (свыше 60%) были позитивными по наличию геномной последовательности 16s рРНК, при этом они характеризовались наиболее высокими значениями общей бактериальной обсемененности и количества БГКП.

По результатам ПЦР с родоспецифическими праймерами на Campylobacter spp. частота обнаружения кампилобактеров в загрязненных пробах молока превышала этот показатель при тестировании проб микробиологическим методом в 7,4 раза. По-видимому, культуральный метод не позволял выявить присутствие возбудителя на фоне массивной контаминации посторонней микрофлорой, тогда как количество некультивируемых или нежизнеспособных форм, выявляемых ПЦР, достигало высоких значений. Ориентировочная оценка результатов в количественном формате свидетельствовала о выявляемых уровнях 104-106,5 геномных эквивалентов/см3, что указывает на возможное наличие жизнеспособных клеток Campylobacter в исследуемом материале.

Применение мультипраймерного подхода (одновременное тестирование на наличие 16s рРНК и гена cdtB C. jejuni) уменьшало количество позитивных случаев обнаружения ДНК кампилобактеров до 16,6%, что позволяет предполагать большую информативность гена cdtB в отношении выявления жизнеспособных, в том числе некультивируемых, клеток, обладающих токси-генностью.

Для экспериментального подтверждения полученных результатов проведены исследования по выявлению C. jejuni в модельных системах с использованием молока, искусственно контаминированного тест-штаммом № 11168 10-кратно убывающими концентрациями микробной суспензии (от 107 до 10 клеток/см3). В качестве тестируемых объектов контаминации использовали стерильное молоко и пробы нативного молока-сырья с высоким уровнем КМАФАнМ и обильным обсеменением БГКП (табл. 3).

При контаминации высокими дозами (106 клеток/см3) тест-штамма C. jejuni установлено, что выявление живых (колониеобразующих) клеток в большей степени коррелирует с результатами ПЦР-анализа с праймерами на гены cdtB и ciaB, тогда как геномная последовательность 16s рРНК позволяет обнаруживать присутствие не только жизнеспособных клеток, но, возможно, и инактивированные или некультивируемые формы бактерий. При малых концентрациях инокулированного возбудителя (102103 клеток/см3) положительные результаты ПЦР регистрировали только при тестировании с родоспецифическими праймерами 16s рРНК, тогда как культуральный метод не позволял выявить C. jejuni при этих уровнях контаминации. Открываемость проб в сыром зараженном молоке была практически на порядок ниже по сравнению с контаминированным стерильным молоком при тестировании всеми методами, что может быть связано с бактериостатическими свойствами молока (обусловленными наличием лактопероксидазной системы, лизоцима, лактоферрина, иммунных антител, макрофагов и др.) и различными формами межпопуляционного взаимодействия представителей посторонней микрофлоры.

Таким образом, с учетом необходимости выявления некультивируемых форм кампилобактеров в смешанных микробных ассоциациях показана возможность применения метода ПЦР, который позволяет обойти основную трудность, связанную с тестированием таких бактерий, особенно находящихся в метаболически неактивном состоянии.

Заключение

С применением культуральных и молекулярно-генетических методов прямой детекции на основе ПЦР-анализа проведено изучение характера микробной контаминации сырого коровьего молока и частоты обнаружения в нем термофильных бактерий рода Campylobacter.

Показано, что микробиологические методы посева при низких уровнях контаминации возбудителей кампилобактериоза не обеспечивают их достоверного выявления вследствие массивного загрязнения сырья посторонней микрофлорой, оказывающего влияние на результаты тестирования. Положительные результаты на наличие Campylobacter spp. получены только в 8,3% случаев, тогда как применение мультипраймерного ПЦР-анализа с генами cdtB и ciaB позволяет увеличить в 2 раза обнаружение C. jejuni в пробах сырого молока.

Показана возможность применения ПЦР как наиболее адекватного метода, который позволяет обойти основную трудность, связанную с тестированием труднокультивируемых патогенов, находящихся в метаболически неактивном состоянии, обеспечивая возможность замены размножения бактерий амплификацией специфических фрагментов ДНК.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Литература

1. Vidal A.B., Davies R.H., Rodgers J.D., Ridley A., Clifton-Hadley F. Epidemiology and control of Campylobacter in modern broiler production // Campylobacter Ecology and Evolution / ed. S.K. Sheppard. Norfolk, 2014. P. 287-313.

2. Thepault A., Meric G., Rivoal K., Pascoe B., Mageiros L., Touzain F. et al. Genome-wide identification of host-segregating epidemiological markers for source attribution in Campylobacter jejuni // Appl. Environ. Microbiol. 2017. Vol. 83, N 7. Article ID e03085-16. doi: 10.1128/AEM.03085-16

3. Cody A.J., Bray J.E., Jolley K.A., McCarthy N.D., Maiden M.C.J. Core genomemultilocus sequence typing scheme for stable, comparative analyses of Campylobacter jejuni and C. coli human disease isolates // J. Clin. Microbiol. 2017. Vol. 55, N 7. P. 2086-2097. URL: https://doi.org/10.1128/JCM.00080-17

4. Revez J., Zhang J., Schott T., Kivisto R., Rossi M., Hanninen M.-L. Genomic variation between Campylobacter jejuni isolates associated with milk-borne-disease outbreaks // J. Clin. Microbiol. 2014. Vol. 52, N 8. P. 2782-2786. doi: 10.1128/JCM.00931-14

5. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н., Пискарева И.И. Загрязненность пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. Т. 75, № 6. С. 38-43.

6. European Food Safety Authority (EFSA). Analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, 2008, Part A: Campylobacter and Salmonella prevalence estimates // EFSA J. 2010. Vol. 8. URL: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2010.1503

7. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M., Waddell L., O’Connor A.M., Wills R.W. et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken carcasses during processing: a systematic review // Poult. Sci. 2010. Vol. 89, N 5. P. 1070-1084.

8. Ефимочкина Н.Р. Оценка роли бактерий рода Campylobacter в возникновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 6. С. 5-18.

9. Ефимочкина Н.Р. Микробиология пищевых продуктов и современные методы детекции патогенов. М. : Изд-во РАМН, 2013. 517 с.

10. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 3. P. 237-257.

11. Jayarao B.M. WHO Surveillance Program for Control of Food Borne Infections and Intoxications in Europe. Newsletter, 2001. N 75.

12. Artursson K., Schelin J., Lambertz S.T., Hansson I., Engvall E.O. Foodborne pathogens in unpasteurized milk in Sweden // Int. J. Food Microbiol. 2018. Vol. 284. P. 120-127. URL: https:// doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.05.015

13. Del Collo L.P., Karns J.S., Biswas B., Lombard J.E., Haley B.J., Kristensen R.C. et al. Prevalence, antimicrobial resistance, and molecular characterization of Campylobacter spp. in bulk tank milk and milk filters from US dairies // J. Dairy Sci. 2016. Vol. 100. P. 3470-3479. URL: https://doi.org/10.3168/jds.2016-12084

References

1. Vidal A.B., Davies R.H., Rodgers J.D., Ridley A., Clifton-Hadley F. 7. Epidemiology and control of Campylobacter in modern broiler production. In: Sheppard S.K. (ed.). Campylobacter Ecology and Evolution. Norfolk, 2014: 287-313.

2. Thepault A., Meric G., Rivoal K., Pascoe B., Mageiros L., Touzain F., et al. Genome-wide identification of host-segregating epidemiological markers for source attribution in Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol. 2017; 83 (7): e03085-16. doi: 10.1128/AEM.03085-16

3. Cody A.J., Bray J.E., Jolley K.A., McCarthy N.D., Maiden M.C.J. Core genomemultilocus sequence typing scheme for stable, comparative analyses of Campylobacter jejuni and C. coli human disease isolates. J Clin Microbiol. 2017; 55 (7): 2086-97. URL: https:// doi.org/10.1128/JCM.00080-17

4. Revez J., Zhang J., Schott T., Kivisto R., Rossi M., Hanninen M.-L. Genomic variation between Campylobacter jejuni isolates associated with milk-borne-disease outbreaks. J Clin Microbiol. 2014; 52 (8): 2782-6. doi: 10.1128/JCM.00931-14

5. Sheveleva S.A., Shurysheva Zh.N., Piskareva I.I. Contamination of food by bacteria of the genus Campylobacter. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2006; 75 (6): 38-43. (in Russian)

6. European Food Safety Authority (EFSA). Analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, 2008, Part A: Campylobacter and Salmonella prevalence estimates. EFSA J. 2010; 8. URL: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2010.1503

7. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M., Waddell L., O’Connor A.M., Wills R.W., et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken carcasses during processing: a systematic review. Poult Sci. 2010; 89 (5): 1070-84.

8. Efimochkina N.R. Evaluation of the role of Campylobacter spp. in the occurrence of foodborne diseases and modern methods to detect the pathogen. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (6): 5-18. (in Russian)

9. Efimochkina N.R. Food Microbiology and Modern Methods of Detection of Foodborne Pathogens. Moscow: Izdatel’stvo RAMN, 2013: 517 p. (in Russian)

10. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int J Food Microbiol. 2007; 117 (3): 237-57.

11. Jayarao B.M. WHO Surveillance Program for Control of Food Borne Infections and Intoxications in Europe. Newsletter, 2001; 75.

12. Artursson K., Schelin J., Lambertz S.T., Hansson I., Engvall E.O. Foodborne pathogens in unpasteurized milk in Sweden. Int J Food Microbiol. 2018; 284: 120-7. URL: https://doi.org/10.1016/j.jfoodmicro.2018.05.015

13. Del Collo L.P., Karns J.S., Biswas B., Lombard J.E., Haley B.J., Kristensen R.C., et al. Prevalence, antimicrobial resistance, and molecular characterization of Campylobacter spp. in bulk tank milk and milk filters from US dairies. J Dairy Sci. 2016; 100: 3470-9. URL: https://doi.org/10.3168/jds.2016-12084