Cердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) представляют большую проблему для современного здравоохранения ввиду их значительного вклада в структуру смертности [1]. Одним из наиболее распространенных ССЗ является ишемическая болезнь сердца (ИБС), в основе которой лежит атеросклеротическое поражение сосудов сердца. Совокупность процессов, способствующих дестабилизации атеросклеротической бляшки, приводит к развитию острого инфаркта миокарда.
Важным фактором риска развития заболеваний сердца и сосудов является нерациональное питание с преобладанием насыщенных жиров, сахара, мясных субпродуктов и соли [2]. Ввиду этого Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и Американская ассоциация кардиологов рекомендуют увеличить в рационе количество овощей и фруктов, оливкового масла, бобовых, цельнозерновых и морепродуктов, снизить потребление красного мяса и переработанных мясных изделий, продуктов с высоким содержанием холестерина, сахара и соли [3].
В 2011 г был выделен новый потенциальный фактор сердечно-сосудистого риска - повышенный уровень триметиламин-N-оксида (ТМАО). Увеличение его уровня в крови было связано с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями, т.е. с развитием инфаркта миокарда, острого нарушения мозгового кровообращения [4].
Согласно предложенной гипотезе, данное вещество способно ускорять процессы накопления липидов в макрофагах и пенистых клетках артерий, а также усиливать агрегацию тромбоцитов. ТМАО синтезируется в печени посредством окисления триметиламина (ТМА) с участием фермента флавинмонооксигеназы 3. Субстратами для формирования ТМА служат фосфатидил-холин и L-карнитин, поступающие в избытке при употреблении красного мяса, яиц, молочных продуктов, сыра, морепродуктов, бобовых [5, 6].
Указанные вещества преобразуются в ТМА под действием микрофлоры кишечника, преимущественно толстой кишки. Выделены как определенные ТМА-образующие бактерии (Enterobacteriaceae, Clostridia-ceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae и др.), так и способность к передаче генов ферментов (ТМА-лиаз), участвующих в синтезе ТМА, среди некоторых бактерий, изначально не обладающих указанными свойствами [7].
Таким образом, возникло предположение о возможности предотвращения развития и прогрессирования ССЗ с помощью диеты. Изучение влияния тех или иных продуктов на формирование ТМАО до настоящего момента в основном проводилось на животных или здоровых добровольцах и дало противоречивые результаты.
Так, добавление в корм крыс фосфатидилхолина и L-карнитина наравне с жирной пищей приводило к повышению концентрации ТМАО [8]. Кормление мышей пищей, схожей по составу с западной диетой, содержащей большое количество жира, быстрых углеводов, красного мяса, также привело к увеличению уровня ТМАО [9]. Клинические исследования с участием вегетарианцев и людей, употребляющих пищу животного происхождения, продемонстрировали, что у последних концентрация ТМАО в крови значительно выше [10]. У пациентов с метаболическим синдромом в отсутствие ССЗ аналогичные результаты получены при повышенном содержании жирной пищи в диете [11]. S. Rohrmann и соавт. продемонстрировали, что среди здоровой популяции людей больше всего на повышение уровня ТМАО влияют молочные продукты, в то время как красное мясо, рыба и многие другие не повлияли существенно на концентрацию данного метаболита [12].
A. Malinowska и соавт. выявили у пожилых людей без указания на наличие ССЗ в анамнезе ассоциацию между потреблением яиц, мясных и молочных продуктов, крахмалсодержащей пищи, выпечки и возрастанием уровня ТМАО в крови [13].
Таким образом, до настоящего времени не получено однозначных данных о связи определенных продуктов с увеличением концентрации ТМАО в крови, не разработана диета с перспективой снижения уровня указанного метаболита
Цель данного исследования - оценить влияние потребления продуктов, содержащих L-карнитин и фосфатидилхолин, на продукцию проатерогенного метаболита ТМАО и изменения кишечного микробиома у пациентов с ИБС.
Материал и методы
Настоящее исследование выполнено на базе Клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии им. В.Х. Василенко. Его участниками стали пациенты с ИБС, подтвержденной анамнестическими данными, результатами суточного мониторирования ЭКГ по Холтеру, коронароангиографии. Все пациенты получали антигипертензивные препараты, аспирин, статины, нитраты длительного действия.
Вторую группу в исследовании составили здоровые добровольцы старше 50 лет, у которых на момент обследования не было выявлено заболеваний со стороны сердечно-сосудистой системы, а также острых или обострения хронических заболеваний со стороны других органов и систем. Участники среди добровольцев были приглашены по результатам диспансеризации в ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет" Минздрава России (Сеченовский университете), в Клинике пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии им. В.Х. Василенко их дополнительно обследовали для исключения ИБС.
После применения критериев включения и исключения в первый этап исследования были включены 29 пациентов с ИБС (14 мужчин и 15 женщин) и 30 здоровых добровольцев (16 мужчин и 14 женщин). Рандомизацию не проводили.
Исключению из исследования подлежали пациенты, получавшие за 1 мес до исследования антибиотики, пробиотики, с хроническими заболеваниями в стадии декомпенсации, онкологическими заболеваниями.
После подписания информированного согласия на участие в исследовании все участники заполняли анкету с указанием количества продуктов, содержащих фосфатидилхолин и L-карнитин, обычно потребляемых ими в неделю.
Определение концентрации триметиламин-N-оксида в крови
Накануне исследования участники исключали из диеты продукты с высоким содержанием фосфати-дилхолина и L-карнитина. Для стандартизации полученных результатов им выдавали 2 таблетки (800 мг) холина альфосцерата, которые необходимо было принять за 12 ч до забора крови. После приема холина следовал период голодания. После забора венозной крови выполняли центрифугирование образцов с последующим распределением аликвот сыворотки и замораживанием при температуре -80 °С до проведения анализа с использованием жидкостного тройного квадрупольного хромато-масс-спектрометра с электрораспылительной ионизацией LCMS-8050 (Shimadzu, Япония).
Анализ фекальной микрофлоры
Для анализа фекальной микрофлоры всем участникам выдали стерильные контейнеры и инструкцию по сбору образцов. Полученные образцы кала хранили в морозильной камере при температуре -80 °С. После разморозки образцов их подвергали гомогенизации, центрифугированию с последующим выделением ДНК для 16S-секвенирования, секвенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) в режиме парно-концевых прочтений, 2x150 нуклеотидов с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (300 cycles). Тотальную ДНК выделяли с помощью реагентов MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche, Швейцария). Для качественной и количественной оценки ДНК использовали NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Первый раунд амплификации вариабельных участков V3-V4 гена 16S рРНК выполняли с использованием прямого и обратного праймеров; программа амплификации (амплификатор Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific, США). Полученные продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) были очищены с использованием шариков Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США). Второй раунд амплификации для двойного индексирования образцов выполняли с участием комбинации специфических праймеров и амплификатора Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, США). Очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью шариков Agencourt AMPure XP. Концентрацию полученных библиотек 16S определяли с помощью флуориметра Qubit® 2.0 (Invitrogen, США) и набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity Assay Kit. Подготовка 16S-метагеномных библиотек выполнена по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, США), рекомендованному Illumina для секвенатора MiSeq.
Для изучения таксономической структуры бактериального сообщества на уровне родов и семейств была выполнена прямая таксономическая аннотация полученных последовательностей ампликонов (Exact Sequence Variants). Ввиду того что прямые и обратные прочтения не перекрывались друг с другом (размер целевого ПЦР-ампликона, без адаптеров, варьировал в пределах 440-470 нуклеотидов), они были слиты в единый фрагмент с поли-N-трактом в середине и далее таксономически аннотированы при помощи классификатора RDP (Ribosomal Database Project) и базы данных RDP. Обработку данных проводили с помощью программной среды R, предназначенной для статистической обработки данных, c последующим графическим отображением результатов в виде диаграмм размаха (boxplot). Количественное содержание отдельных семейств или родов в исследованных образцах оценивали с использованием коэффициента Брея-Кертиса, позволяющего рассчитать содержание семейств и родов в исследованных образцах, уникальных и общих для 2 групп.
Статистический анализ
Анализ концентрации ТМАО и влияния диеты на уровень ТМАО выполнен с применением стандартных методов статистической обработки данных в программе IBM SPSS 22.0 (IBM, США). Для оценки межгрупповых различий использовали критерии Манна-Уитни и Фишера. Для анализа отличий в структуре фекальной микрофлоры, а именно состава микробиоты на уровне семейств и родов, применены критерий Вилкоксона, t-тест Стьюдента.
Результаты
Исследование было разделено на 2 части согласно его задачам. В первой части исследования сравнивали пищевые предпочтения пациентов с ИБС (n=29) и здоровых людей аналогичного возраста и пола (n=30).
Основные физические характеристики участников исследования указаны в табл. 1.
Оценка диеты и концентрации триметиламин-N-оксида у пациентов с ишемической болезнью сердца
У всех участников исследования оценивали рацион, в частности частоту потребления предшественников ТМАО. Анкета составлена с учетом приема продуктов, наиболее богатых фосфатидилхолином и L-карнитином, согласно полученным ранее данным в исследованиях [4]. Частоту потребления продуктов оценивали за недельный период, что было удобно для участников (табл. 2).
В результате отмечено более частое потребление красного мяса (говядина, свинина), молочных продуктов среди пациентов с ИБС, меньшее потребление рыбы, яиц. В отношении бобовых, брокколи и цветной капусты, а также морепродуктов частота приема была одинаково редкая (≤1 раза в неделю).
При сравнении концентрации ТМАО у пациентов с ИБС и здоровых людей обнаружено более чем 3-кратное повышение ее у лиц, страдающих ИБС. Так, концентрация ТМАО (M±σ) у пациентов с ИБС составила 1036,4±748,2 нг/мл, в то время как в группе здоровых участников - 376,5±147,9 нг/мл (р=0,0001)
Сравнение состава фекальной микрофлоры участников исследования
Состав фекальной микрофлоры изучали на уровне семейств и родов бактерий. Особое внимание уделяли обнаружению продуцирующей ТМА микрофлоры (семейства Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Peptococcaceae, Verrucomicrobiaceae, Enterococcaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae и другие; роды Acinetobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia, Proteus и др.).
Сравнение образцов кала пациентов с ИБС и здоровых участников позволило выявить у них увеличение как количества бактерий в материале, так и количественное преобладание микробов семейств Verrucomicrobiaceae (p<0,05) и Enterobacteriaceae (p<0,05), родов Escherichia/Shigella (р<0,05), тенденцию к увеличению количества бактерий Ruminococcus (р=0,065), Clostridium XlV (b) (р=0,10). Маркерные последовательности 16S во многом идентичны как для Escherichiaspp., так и для Shigella spp., поэтому данные приведены совместно (рис. 1, 2). Микрофлора, традиционно относящаяся к эубиотической, т.е. препятствующей колонизации условно-патогенными бактериями, представленная Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp., не продемонстрировала значимых изменений в составе (семейства Lactobacillaceae и Bifidobacteriaceae (р=0,18 и р=0,28 соответственно).
Таким образом, у пациентов с ИБС отмечено повышение концентрации ТМАО, увеличение количества триметиламин-продуцирующих бактерий в фекальной микрофлоре, что сопоставимо с увеличением количества продуктов - предшественников ТМАО в диете (красного мяса, молочных продуктов).
Оценка влияния диеты на концентрацию триметиламин-М-оксида
Задача второго этапа исследования - подтвердить взаимосвязь между частотой потребления продуктов, содержащих фосфатидилхолин и L-карнитин, и изменением концентрации ТМАО у пациентов с ИБС.
Для получения статистически значимых результатов количество участников с ИБС было увеличено до 89 человек, соответствующих критериям включения. Среди указанной когорты проведено анкетирование, результаты которого сопоставимы с полученными в первой части исследования данными. Также выполнен забор анализов крови на ТМАО.
Далее оценивали наличие корреляции между концентрацией ТМАО в сыворотке крови и частотой потребления того или иного продукта из указанных в анкете. Согласно полученным результатам, прием говядины, свинины, молока, сыра, яиц и бобовых ассоциирован с более высоким уровнем ТМАО (p<0,05), в то время как не получено достоверной ассоциации между повышением ТМАО и потреблением рыбы, цветной капусты и брокколи (табл. 3).
Таким образом, диета с высоким содержанием L-карнитина и фосфатидилхолина действительно вносит вклад в продукцию повышенного количества ТМАО у пациентов с ИБС.
Обсуждение
Большинство пациентов с ИБС, в отличие от здоровых добровольцев в предыдущих исследованиях, имеют опыт соблюдения диеты с ограничением прежде всего животных жиров и яиц. О необходимости диетических ограничений они, как правило, были проинформированы врачом при установлении диагноза.
Рекомендации ВОЗ, большинства национальных ассоциаций кардиологов сходятся во мнении, что изменения в питании в рамках вторичной профилактики ССЗ должны включать снижение потребления насыщенных жиров, соли, увеличения доли овощей и фруктов в диете [3].
С выделением ТМАО в качестве нового потенциального показателя сердечно-сосудистого риска оценивали влияние тех или иных продуктов на продукцию данного метаболита как в эксперименте на животных, так и в клинических исследованиях. Тем не менее до настоящего времени не изучали влияние диеты на концентрацию ТМАО и изменения микробиома при этом у людей с ИБС.
Данное исследование было направлено на оценку частоты потребления продуктов, которые служат субстратом для образования потенциально проатерогенного метаболита ТМАО у пациентов с ИБС. Согласно полученным данным, среди пациентов с ИБС ожидаемо отмечалось в среднем меньшее потребление яиц, тем не менее потребление красного мяса (говядина, свинина) среди данной группы было выше, чем среди участников, не страдающих ССЗ. Здоровые участники исследования чаще включали в рацион рыбу.
Включение в рацион бобовых, брокколи, цветной капусты и морепродуктов было редким во всех группах, вероятно, ввиду особенностей национального рациона и высокой стоимости некоторых указанных продуктов.
В исследовании важно было не только оценить рацион участников, но и продемонстрировать связь потребления определенных продуктов с увеличением концентрации ТМАО. Такая корреляция выявлена для красного мяса, яиц, молочных продуктов, что согласуется с полученными ранее данными в экспериментах, однако статистически не значима в отношении приема рыбы, несмотря на то что рыба - важный источник фосфатидилхолина [12]. Причины данного явления неясны и требуют дальнейшего изучения.
Продукция ТМАО осуществляется посредством участия кишечной микрофлоры, вследствие этого в исследовании сравнивали образцы фекальной микробиоты пациентов с ИБС и участников без ССЗ. Согласно результатам проведенного анализа, у пациентов с ИБС отмечено большее количество микроорганизмов семейств Verrucomicrobiaceae и Enterobacteriaceae, различия сохранялись на уровне родов. Указанные бактерии обнаруживаются и у здоровых людей, однако у пациентов, страдающих ССЗ, количество Enterobacteriaceae выше [14]. Данное семейство, факультативные анаэробы, включает множество патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, таких как Enterobacter, Proteus, Shigella, Salmonella spp. В отношении семейства Verrucomicrobiaceae на сегодняшний день недостаточно данных, позволяющих оценить вклад в развитие патологии сердца и сосудов, а также в продукцию ТМА.
На уровне родов выявлено повышение количества бактерий Escherichia у пациентов с ИБС, представляющих собой совокупность как комменсалов, так и условно-патогенных и патогенных видов. В отношении метаболизма кишечной микробиоты важно отметить, что бактерии указанного рода могут служить субстратом для переноса ТМА-лиаз, т.е. своеобразным буфером для поддержания синтеза ТМАО в организме. Микроорганизмы родов Ruminococcus и Clostridium XIV (b), обнаружившие тенденцию к увеличению у пациентов с ИБС, играют важную роль в формировании местного иммунного ответа, продукции бутирата, однако, кроме того, участвуют в превращении холина в ТМА [15, 16].
Известно, что диета и состав кишечной микрофлоры тесно связаны, подвержены взаимным изменениям. Коррекция рациона питания способна повлиять на состав микробиома кишечника, при этом, согласно полученным ранее данным, в достаточно короткие сроки [17].
Среди изученных ранее в исследованиях терапевтических стратегий по снижению концентрации ТМАО в крови с целью потенциального снижения сердечно-сосудистого риска предложены антибиотики, пробиотики, эналаприл и некоторые другие [18]. Тем не менее ни один из методов не продемонстрировал убедительной эффективности.
Таким образом, диета с ограничением продуктов, содержащих L-карнитин и фосфатидилхолин, таких как красное мясо (свинина, говядина), яйца, молочные продукты, включая сыр, в отсутствие других эффективных мер по снижению концентрации ТМАО может быть одной из мер вторичной профилактики сердечно-сосудистого риска у пациентов с ИБС.
Настоящее исследование является пилотным и имеет некоторые ограничения. 16S-секвенирование не позволяет адекватно раскрыть потенциал продукции ТМА бактериями, а также разделить вклад пристеночной и просветной микрофлоры того или иного отдела кишечника в фекальных образцах. Низкая статистическая достоверность данных в отношении микробного состава на небольшом количестве образцов определила ограничение анализа такими таксономическими единицами, как семейство и род.
Ввиду того что L-карнитин и фосфатидилхолин служат важными источниками для многих метаболических процессов в организме, полностью исключать их нежелательно. Необходимы дальнейшие исследования с оценкой оптимального количества указанных нутриентов в рационе, с учетом в том числе микробного состава кишечника и его потенциальной коррекции.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.