Влияние полифенолов на активность гликозил-гидролаз в слепой кишке крыс, получавших индуцирующие ожирение рационы

Резюме

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что профилактические и терапевтические эффекты применения полифенолов при ожирении сопровождаются значительным уменьшением тяжести дисбиоза, вызванного преобладанием в рационе питания жиров и простых углеводов, особенно фруктозы, и восстановлением функционального состояния микробиоты.

Целью работы было изучение влияния кверцетина и ресвератрола - полифенолов, широко представленных в ежедневном рационе питания человека, на активность бактериальных гликозидаз у крыс, получавших рационы с высоким содержанием фруктозы или жира и фруктозы.

Материал и методы. С использованием спектрофотометрического анализа была изучена активность β-галактозидазы (Гал), β-глюкозидазы (Глю) и β-глюкуронидазы (Глу) в содержимом слепой кишки крыс линии Вистар, получавших полусинтетический рацион и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (в/фр рацион) или полусинтетический рацион с высоким (30%) содержанием жира и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (вж/вфр рацион).

Результаты и обсуждение. Содержание крыс на в/фр рационе в течение 20 нед приводило к подавлению активности Гал на 35, Глю на 46 и Глу на 31%. При включении в состав в/фр рациона кверцетина в дозе 34 мг на 1 кг массы тела активность ферментов восстанавливалась до контрольных величин и превышала уровень активности у крыс, получавших в/фр рацион без кверцетина, на 60, 100 и 47% соответственно для Гал, Глю и Глу. Содержание крыс в течение 10 нед на вж/вфр рационе не оказывало существенного влияния на активность бактериальных ферментов. Включение в вж/вфр рацион ресвератрола в дозе 10 мг на 1 кг массы тела приводило к снижению активности Глю на 58 и Глу на 28%, а увеличение дозы до 100 мг на 1 кг массы тела вызывало дальнейшее подавление активности Гал на 30, Глю на 76 и Глу на 64% относительно активности у крыс на вж/вфр рационе без ресвератрола.

Заключение. Полученные данные позволяют предположить, что кверцетин восстанавливает сниженную в/фр рационом активность гликозил-гидролаз микрофлоры слепой кишки крыс, вероятнее всего, за счет увеличения представительства видов носителей ферментной активности. Подавляющее действие ресвератрола на активность гликозил-гидролаз микрофлоры слепой кишки крыс, получавших вж/вфр рацион, возможно, является результатом его прямого действия на ферменты и не связано с влиянием на состав кишечной микробиоты.

Ключевые слова:кверцетин, ресвератрол, кишечная микробиота, бактериальные гликозил-гидролазы, крысы, высокофруктозный рацион, высокожировой высокофруктозный рацион

Для цитирования: Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Аксенов И.В. Влияние полифенолов на активность гликозил-гидролаз в слепой кишке крыс, получавших индуцирующие ожирение рационы // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 63-68. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10030.

В настоящее время ассоциация организма человека и его кишечной микробиоты рассматривается как единое целое, в котором составляющие находятся в состоянии постоянного взаимовлияния и которое, как показывают последние исследования, играет значимую роль как в обеспечении здоровья человека, так и в патогенезе множества его заболеваний [1]. Перечень патологических состояний, ассоциирующихся с дисбиотическими изменениями микрофлоры кишечника, значительно расширился в результате изучения роли микробиоты и продуктов ее жизнедеятельности в регуляции метаболических процессов макроорганизма [2].

В последние годы все большее развитие получает гипотеза, согласно которой ожирение и связанные с ним сахарный диабет, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), сердечно-сосудистые заболевания обусловлены дисбиозом, вызванным преобладанием в рационе питания жиров и простых углеводов, особенно фруктозы [3-5].

При этом отмечается возросший интерес к полифенолам, обладающим широким спектром биологической активности, как модуляторам функциональной активности микробиоты. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что профилактические и терапевтические эффекты применения полифенолов при ожирении сопровождаются значительным уменьшением тяжести дисбиоза и восстановлением функционального состояния микробиоты [6-8].

Как известно, одной из основных функций микробиоты является метаболическая, которая связана в первую очередь с активностью гликолитических ферментов микрофлоры толстой кишки, обеспечивающих утилизацию сложных углеводов растительного происхождения, неперевариваемых ферментами макроорганизма.

К числу таких ферментов относятся бактериальные гликозил-гидролазы - глюкозидазы, галактозидазы, глюкуронидазы. Гликозил-гидролазы кишечной микробиоты играют также ключевую роль в метаболизме и обеспечении биодоступности многих биологически активных веществ пищи, в том числе полифенолов, которые в природе существуют главным образом в виде гликозидов [9, 10]. Это позволяет рассматривать уровень их активности в качестве одного из показателей функционального состояния кишечной микробиоты.

Целью работы было изучение влияния кверцетина и ресвератрола - полифенолов, широко представленных в ежедневном рационе питания человека, на активность бактериальных гликозидаз у крыс, получавших рационы с высоким содержанием фруктозы или жира и фруктозы. Оба рациона близки к так называемому западному типу диеты, с которой связывают рост ожирения и сопутствующих метаболических болезней.

Материал и методы

В работе придерживались рекомендаций "Международные руководящие принципы биомедицинских исследований на животных", разработанных Советом международных научных медицинских организаций (2012 г.) и Правил надлежащей лабораторной практики (приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н).

В первом эксперименте крысы-самцы линии Вистар (в каждой группе по 8 животных с исходной массой тела 135-165 г) в течение 20 нед получали стандартный полусинтетический рацион (контрольная группа) или высокофруктозный (в/фр) рацион - стандартный рацион и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (в/фр 1-я опытная группа), или стандартный рацион с добавлением кверцетина в количестве 34 мг на 1 кг массы тела и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (в/фр 2-я опытная группа) [11].

Во втором эксперименте растущие крысы-самцы Вистар (по 6 животных в группе с исходной массой тела 73-88 г) в течение 10 нед получали стандартный полусинтетический рацион (контрольная группа) или полусинтетический рацион с высоким (30% от массы сухого корма) содержанием жира (лярд/подсолнечное масло - 1/1) и 20% раствор фруктозы вместо питьевой воды (вж/вфр рацион, 1-я опытная группа), или вж/вфр рацион с включением ресвератрола в количестве 10 мг на 1 кг массы тела (2-я опытная группа), или вж/вфр рацион с включением ресвератрола в количестве 100 мг на 1 кг массы тела (3-я опытная группа). Использованные дозы полифенолов были сопоставимы с таковыми, применяемыми в экспериментах на животных [6-8].

Сразу после декапитации крыс слепую кишку выделяли вместе с содержимым. Содержимое тщательно перемешивали in situ, небольшую порцию смешивали с 0,1 М калий-фосфатным буфером рН 6,5 в соотношении 1:15 (масса : объем), гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком в течение 120 с при 1200 об/мин и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 мин при 4 °С. Надосадочную жидкость отбирали и хранили при -80 °С до определения активности ферментов.

Реакционную смесь для определения активности бактериальных гидроксил-гидролаз, содержащую 0,1 М фосфатный буфер рН 6,5, исследуемый материал и субстрат - 5 мМ 4-нитрофенил- β-О-галопирано-зид (для β-галактозидазы) или 5 мМ 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид (для β-глюкозидазы), или 5 мМ 4-нитрофенил- β-О-глюкуронид для β-глюкуронидазы, инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали 0,4 М глициновым буфером рН 10,8 и измеряли экстинкцию при Х=405 нм [12].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics Ver. 20 (IBM, США). Данные представляли в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m).Для выявления статистически значимых (р<0,05) различий между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ с использованием в качестве апостериорного критерия LSD-теста.

Результаты и обсуждение

Влияние кверцетина на активность гликозил-гидролаз в слепой кишке крыс, получавших высокофруктозный рацион

Как видно из данных, представленных в табл. 1, длительное содержание крыс на рационе с фруктозой (1-я опытная группа) приводило к снижению активности β-галактозидазы, β-глюкозидазы и β-глюкуронидазы до 65, 54 и 69% от уровня контроля соответственно. При обогащении в/фр рациона кверцетином (2-я опытная группа) активность бактериальных ферментов восстанавливалась до контрольных величин и превышала уровень активности у крыс, получавших в/фр рацион без кверцетина, на 60, 100 и 47% соответственно для β-галактозидазы, β-глюкозидазы и β-глюкуронидазы.

В недавно опубликованной работе B. Fotschki и соавт. [13] также показали, что содержание крыс Вистар в течение 6 нед на в/фр рационе приводит к значительному снижению в содержимом слепой кишки активности β-галактозидазы и β-глюкозидазы, но мало влияет на активность β-глюкуронидазы. Обнаруженное подавление активности бактериальных гликозил-гидролаз у крыс, получавших в/фр рацион, совпадает с имеющимися данными литературы, свидетельствующими о том, что в/фр рационы приводят к дисбиозу и уменьшению численности представителей видов Lactobacillus и Bifidobacterium [14, 15], которые являются продуцентами гликозил-гидролаз [9].

Что касается кверцетина, следует отметить, что в ряде экспериментальных исследований обнаружено, что он может подавлять проявления метаболического синдрома у крыс, получавших в/фр рацион, ослаблять окислительный стресс и развитие ключевого патогенетического звена развития ожирения - низкоинтенсивной системной воспалительной реакции [16-18]. Морфологические исследования, проведенные в нашем эксперименте [19], также показали, что у крыс 2-й опытной группы, получавших в/фр рацион с включением кверцетина, проявления НАЖБП были менее выражены, чем у животных 1-й опытной группы, получавших в/фр рацион без кверцетина.

Значительно меньше сведений имеется о влиянии кверцетина на дисбиоз и активность ферментов микробиоты в экспериментах с использованием индуцирующих ожирение рационов. Показано, что кверцетин снижает тяжесть дисбиоза и развитие ожирения и НАЖБП у крыс, получавших высокожировые или высокоуглеводные с высоким содержанием жира рационы [6, 20, 21]. При этом авторы связывают действие кверцетина на проявления метаболического синдрома с его способностью вызывать глубокие (на уровне филумов) изменения композиционного состава кишечной микробиоты и восстанавливать микроэкологическое равновесие [6]. В одной публикации сообщается, что кверцетин и его моногликозиды усиливают метаболическую активность кишечной микробиоты и активируют β -глюкозидазу и β -глюкуронидазу в содержимом слепой кишки крыс, получавших высокожировой рацион [22].

Влияние ресвератрола на активность гликозил-гидролаз в слепой кишке крыс, получавших высокожировой высокофруктозный рацион

Содержание крыс в течение 10 нед на вж/вфр рационе - 1-я опытная группа, не оказывало существенного влияния на активность изученных бактериальных ферментов (табл. 2). Включение в рацион ресвератрола в количестве 10 мг на 1 кг массы тела (2-я опытная группа) приводило к незначительному (на 20%) возрастанию активности β -галактозидазы относительно активности фермента у крыс 1-й опытной группы. В то же время активность бактериальных β -глюкозидазы и β -глюкуронидазы у животных 2-й опытной группы была статистически значимо ниже активности у крыс 1-й опытной группы, не получавших ресвератрол, - соответственно на 58 и 28%. Увеличение дозы ресвератрола до 100 мг на 1 кг массы тела (3-я опытная группа) вызывало дальнейшее подавление активности всех трех изученных ферментов - β-галактозидазы на 30%, β-глюкозидазы - на 76% и β-глюкуронидазы - на 64% (относительно уровня активности у крыс 1-й опытной группы, не получавших ресвератрол).

Таким образом, полученные результаты показали, что в/фр рацион с одновременным увеличением доли жира в рационе не оказывает значительного влияния на активность изученных гликозил-гидролаз в содержимом слепой кишки крыс. Эти результаты отличаются от данных, полученных в 1-м разделе исследований, в котором использовали в/фр рацион. Возможно, при этом, кроме различий в составе рациона, определенное значение имеет длительность экспериментов и разнонаправленность влияния высокожировых и высокоуглеводных рационов на ферментную активность. Так, не обнаружены изменения активности β-галактозидазы, β-глюкозидазы и β-глюкуронидазы в содержимом слепой кишки крыс Вистар, получавших высокожировой рацион [22], в то время как в/фр рацион вызывал у крыс Вистар существенное снижение активности бактериальных гликозил-гидролаз [13].

Значительное место в изучении механизмов защитного действия ресвератрола при ожирении занимают сведения о его влиянии на кишечную микробиоту. По данным некоторых авторов, благоприятные эффекты ресвератрола при ожирении могут быть связаны с его регулирующим действием на состав микробиоты, существенным уменьшением в ней видов, характерных для диет-индуцированного ожирения, и увеличением представительства видов Lactobacillus и Bifidobacterium [20, 23].

В других исследованиях при сравнении защитного действия ресвератрола и кверцетина у крыс Вистар, получавших высокожировой высокосахарозный рацион, показано, что подавление ресвератролом развития ожирения не было связано с изменением состава кишечной микробиоты [6]. Согласно данным, изложенным в обзоре [24], ресвератрол не оказывал существенного влияния на популяционный состав кишечной микробиоты у крыс и мышей, получавших высокожировой или высокоуглеводные рационы. Авторы полагают, что в отличие от кверцетина действие ресвератрола происходит на уровне кишечника и опосредовано укреплением/восстановлением целостности эпителиального барьера. В пользу такого заключения свидетельствует обнаруженное усиление ресвератролом экспрессии генов белков плотных контактов эпителиальных клеток [6, 24].

Таким образом, полученные результаты и анализ данных литературы позволяют сделать следующие выводы:

1. Кверцетин восстанавливает сниженную в/фр рационом активность гликозил-гидролаз микрофлоры слепой кишки крыс, вероятнее всего, за счет восстановления ее композиции, в том числе за счет увеличения численности носителей ферментной активности.

2. Ресвератрол оказывает дозозависимое подавляющее действие на активность гликозил-гидролаз микрофлоры слепой кишки крыс, получавших вж/вфр рацион, что, возможно, является результатом прямого действия на активность ферментов и не связано с влиянием на состав микробиоты.

Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература

1. Микроэкология: фундаментальные и прикладные проблемы : монография / под ред. Плужникова Н.Н., Накатиса Я.А., Хурцилавы О.Г. СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2012. 304 с.

2. Derrien M., Veiga P. Rethinking diet to aid human-microbe symbiosis // Trends Microbiol. 2017. Vol. 25, N 2. P. 100-112.

3. Корниенко Е.А. Современные представления о взаимосвязи ожирения и кишечной микробиоты // Педиатр. 2013. Т. 4, № 3. С. 3-14.

4. Драпкина О.М., Кабурова А.Н. Кишечная микробиота - новый спутник на маршруте сердечно-сосудистых заболеваний: неожиданные роли старых соседей // Рациональная фармакотер. в кардиологии. 2016. Т. 12, № 1. С. 66-71.

5. Lambertz J., Weiskirchen S., Landert S., Weiskirchen R. Fructose: a dietary sugar in crosstalk with microbiota contributing to the development and progression of non-alcoholic liver disease // Front. Immunol. 2017. Vol. 8. P. 1159.

6. Etxeberria U., Arias N., Boque N. et al. Reshaping faecal gut microbiota composition by the intake of trans-resveratrol and quercetin in high-fat sucrose diet-fed rats // J. Nutr. Biochem. 2015. Vol. 26, N 6. P. 651-660.

7. Carrera-Quintanar L., López Roa R.I., Quintero-Fabián S. et al. Phytochemicals that influence gut microbiota as prophylactics and for the treatment of obesity and inflammatory diseases // Mediators Inflamm. 2018. Vol. 2018. Article ID 9734845.

8. Wang P., Li D., Ke W. et al. Resveratrol-induced gut microbiota reduced obesity in high-fat diet-fed mice // Int. J. Obes. (Lond.). 2019 Febr. doi: 10.1038/s41366-019-0332-1

9. Braune A., Blaut M. Bacterial species involved in the conversion of dietary flavonoids in the human gut // Gut Microbes. 2016. Vol. 7, N 3. P. 216-234.

10. Rowland I., Gibson G., Heinken A. et al. Gut microbiota function: metabolism of nutrients and other food components // Eur. J. Nutr. 2018. Vol. 57, N 1. P. 1-24.

11. Аксенов И.В., Авреньева Л.И., Гусева Г.В. и др. Влияние кверцетина на защитный потенциал крыс при повышенном содержании фруктозы в рационе // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 5. С. 6-12.

12. Djouzi Z., Andrieux C., Degivry M.C. et al. The association of yogurt starters with Lactobacillus casei DN 114001 in fermented milk alters the composition and metabolism of intestinal microflora in germ-free rats and in human flora-associated rats // J. Nutr. 1997. Vol. 127, N 11. Р. 2260‑2266.

13. Fotschki B., Juskiewicz J., Kolodziejczyk K. et al. Protective effects of ellagitannin-rich strawberry extracts on biochemical and metabolic disturbances in rats fed a diet high in fructose // Nutrients. 2018. Vol. 10, N 4. pii: E445.

14. Jegatheesan P., Beutheu S., Ventura G. et al. Effect of specific amino acids on hepatic lipid metabolism in fructose-induced non-alcoholic fatty liver disease // Clin. Nutr. 2016. Vol. 35, N 1. P. 175-182.

15. Zubiria M.G., Gambaro S.E., Rey M.A. et al. Deleterious metabolic effects of high fructose intake: the preventive effect of Lactobacillus kefiri administration // Nutrients. 2017. Vol. 9, N 5. pii: E470.

16. Vazquez Prieto M.A., Bettaieb A., Rodriguez Lanzi C. et al. Catechin and quercetin attenuate adipose inflammation in fructose-fed rats and 3T3-L1 adipocytes // Mol. Nutr. Food Res. 2015. Vol. 59, N 4. P. 622-633.

17. Owis A.I., Abo-Youssef A.M., Osman A.H. Leaves of Cordia boissieri A. DC. as a potential source of bioactive secondary metabolites for protection against metabolic syndrome-induced in rats // Z. Naturforsch. C. 2017. Vol. 72, N 3-4. P. 107-118.

18. Zhao Y., Chen B., Shen J. et al. The beneficial effects of quercetin, curcumin, and resveratrol in obesity // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 2017. Article ID 1459497.

19. Никитин Н.С., Кузнецов С.П. Влияние кверцетина на морфологические изменения при неалкогольной жировой болезни печени у крыс на рационе с повышенным содержанием фруктозы // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 16-21.

20. Zhao L., Zhang Q., Ma W. et al. A combination of quercetin and resveratrol reduces obesity in high‑fat diet-fed rats by modulation of gut microbiota // Food Funct. 2017. Vol. 8, N 12. P. 4644‑4656.

21. Porras D., Nistal E., Martinez-Florez S. et al. Protective effect of quercetin on high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in mice is mediated by modulating intestinal microbiota imbalans and related gut-liver axis activation // Free Radic. Biol. Med. 2017. Vol. 102. P. 188-202.

22. Grzelak-Blaszczyk K., Milala J., Cosmala M. et al. Onion quercetin monoglycosides alter microbial activity and increase antioxidant capacity // J. Nutr. Biochem. 2018. Vol. 56. P. 81-88.

23. Qiao Y., Sun J., Xia S. et al. Effects of resveratrol on gut microbiota and fat storage in mouse model with high-fat-induced obesity // Food Fuct. 2014. Vol. 5, N 6. P. 1241-1249.

24. Bird J.K., Raederstorff D., Weber P., Steinert R.E. Cardiovascular and antiobesity effects of resveratrol mediated through the gut microbiota // Adv. Nutr. 2017. Vol. 8, N 6. P. 839-849.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»