Выделение и изучение железосвязывающей способности лактоферрина коровьего молока

Резюме

Проведены исследования по получению и определению железосвязывающей способности лактоферрина (ЛФ), выделенного из сборного молока голштино-фризской (черно-пестрой) породы коров, которая составляет основное поголовье российского стада крупного рогатого скота.

Целями исследования были получение ЛФ и определение его железосвязывающей способности для обоснования сырьевых ресурсов его промышленного производства как легкоусвояемого источника двухвалентного железа для производства биологически активных добавок к пище и/или специализированных пищевых продуктов.

Материал и методы. Для оптимизации получения ЛФ в производственных условиях молочных предприятий использовали методику выделения ЛФ из коровьего молока в собственной модификации, которая состояла в обезжиривании цельного молока центрифугированием и двойной катионообменной хроматографией с последовательным применением следующих сорбентов: карбоксиметил-целлюлозы-52 и Macro-Prep High QSupport.

Результаты и обсуждение. Разработанная модификация метода хроматографического получения ЛФ показала ее эффективность и доступность для производственных условий отечественных молочных предприятий. Степень чистоты ЛФ составляет около 95%, а содержание около 74 мкг/см3. Определена железосвязывающая способность апо- и холоформы выделенного ЛФ. Показана возможность насыщения аполактоферрина железом.

Заключение. Полученный новый фактический материал дает основу для дальнейших исследований возможности использования насыщенной железом формы хололактоферрина коровьего молока голштино-фризской породы в качестве отечественного сырья при производстве биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов.

Ключевые слова:лактоферрин коровьего молока, апо- и холоформы лактоферрина, железосвязывающая способность, хроматографическая очистка лактоферрина

Для цитирования: Титов Е.И., Тихомирова НА., Ионова И.И. Выделение и изучение железосвязывающей способности лактоферрина коровьего молока // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 1. С. 91-96. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10011.

Лактоферрин (ЛФ) принадлежит к семейству белков-трансферринов, состоит из одной полипептидной цепи длиной в 703 аминокислотных остатка и является эволюционно самым молодым представителем семейства катионоактивных железосвязывающих гликопротеинов [1]. Молекула ЛФ организована в 2 домена, каждый из них имеет сайт связывания железа и относительно устойчив к действию протеаз [2]. ЛФ образует с железом комплекс красного цвета, что отражено в его названии - red protein (красный белок). Впервые ЛФ был обнаружен в 1939 г. в коровьем молоке, молекулярная масса - около 80 кДа. В 1984 г. была расшифрована первичная структура ЛФ молока человека, молекулярная масса - около 83 кДа, а в 1991 г. - ЛФ коровьего молока. Позднее ЛФ был обнаружен в большинстве биологических жидкостей: в слюне, слезной жидкости, выделениях из носа, бронхов, кишечника, панкреатическом и желудочном соке [3, 4]. Содержание ЛФ в сыворотке крови здоровых взрослых людей в зависимости от этнических и географических особенностей исследуемых популяций, по данным зарубежных исследователей, колеблется от 0,13 до 1,62 мкг/см3 [5]. Идентичность аминокислотного состава ЛФ коровьего и женского молока составляет около 70%. Его содержание существенно выше в женском молоке, чем в молоке сельскохозяйственных животных, что объясняется его важной биологической функцией [6, 7]. Функциональные свойства ЛФ рассматривают на основе его молекулярной структуры, которая представлена двумя формами: апо- и хололактоферрин - ненасыщенной и насыщенной соответственно. ЛФ способен связывать железо и осуществлять его транспорт через слизистую кишечника. В первые месяцы лактации в женском молоке превалирует насыщенная холоформа, которая способствует транспорту железа, а апоформа в сочетании с бифидофлорой осуществляет бактериостатическое действие, в частности на E. coli. [8, 9]. Основным механизмом антивирусной активности ЛФ считают его связывание с глюкозоаминогликанами мембран клеток, что препятствует адсорбции вируса мембранами клеток [10-12].

Практическая ценность промышленного получения ЛФ связана с необходимостью его использования в детском питании при создании смесей для искусственного или смешанного вскармливания, необходимостью производства специализированных пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Так, только для производства адаптированных и частично адаптированных молочных смесей для детского питания его потребность в Российской Федерации составляет более 50 т/год.

Известны коммерческие препараты биотехнологического рекомбинантного ЛФ человека, средняя стоимость которых составляет около 6000 долларов США за 1 кг. Цена коровьего ЛФ на мировом рынке в зависимости от уровня очистки и качества белка варьирует от 50 до 500 долларов США за 1 кг.

Промышленное производство коровьего ЛФ из сыворотки, получаемой при производстве сыра, осуществляется рядом зарубежных компаний. Большинство зарубежных исследований in vitro, а также клинических испытаний были проведены с использованием коммерческого ЛФ, который признан Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США безопасным веществом и доступен в больших количествах [13]. В современных условиях импортозамещения имеется острая потребность производства препаратов ЛФ из отечественного сырья. В связи с этим разработка доступного и эффективного способа получения ЛФ из коровьего молока голштино-фризской породы, которая составляет основное поголовье российского стада крупного рогатого скота (КРС), и определение его железосвязывающей способности представляет научную новизну и практическую ценность.

Цели настоящего исследования - получение ЛФ из сборного коровьего молока голштино-фризской породы, исследование его железосвязывающей способности и обоснование сырьевых ресурсов промышленного производства из него легкоусвояемого источника двухвалентного железа.

Материали методы

ЛФ получали из сборного коровьего молока голштино-фризской породы, которое проверяли на соответствие требованиям показателей качества и безопасности ТР ТС 033/2013. Выделение проводили методом двойной катионообменной хроматографии в собственной модификации, заключающейся в подборе сорбентов и параметров хроматографической очистки. Контролем служил коммерческий препарат бычьего ЛФ (Sigma, США). Чистоту препарата ЛФ подтверждали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (SDS). В качестве маркеров использовали набор стандартных белков для электрофореза молекулярной массы 10-250 кДа (Bio-Rad, США). Для определения содержания ЛФ использовали твердофазный конкурентный гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА, Elisa). Общий белок определяли методом Лоури. Железосвязывающую способность ЛФ определяли УФ-спектроскопическим методом [14]. Образцы ЛФ насыщали раствором 0,005M FeCl3 и 0,05M NaHCO3 при pH 8,5 и выдерживали при 4 °С в течение 5 ч. Избыток несвязавшегося железа удаляли диализом против буфера, содержащего 0,01 М трис-НС1, рН 7,5 в течение 2 ч. Определяли поглощение образцов при длине волны 465 нм против контрольного раствора, содержащего трис-НС1, рН 7,5. Активность лактопероксидазы определяли методом, основанным на ее свойстве катализировать окисление перекисью водорода фенолов, ароматических аминов [15]. В качестве субстрата использовали диаммониевую соль 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) (ABTS).

Результаты и обсуждение

Из свежевыдоенного сборного коровьего молока голштино-фризской породы КРС на лабораторном сепараторе-сливкоотделителе получали обезжиренную фракцию, которую направляли на хроматографическую очистку. Модификация хроматографического метода состояла в том, что использовали 2 стадии очистки с соответствующими сорбентами: карбоксиметилцел-люлоза-52 (КМЦ-52) (CM-cellulose 52, Serva, Германия) и Macro-Prep High Q Support (Bio-Rad Laboratories, США). Вначале проводили катионообменную хроматографию на КМЦ. Профиль элюции катионных белков с КМЦ-52 представлен на рис. 1, он характеризуется типичным пиком. Катионную фракцию белков с экстинкцией D280≥0,1 собирали, объединяли и проводили при температуре 4 °С диализ против 0,01 М К2НРО4 (рН 6,7) в течение 12 ч. После диализа катионную фракцию полученных белков очищали на сорбенте Macro-Prep High Q Support. Для отделения белков от сорбента проводили элюирование буфером K2HPO4x3H2O при pH 6,7 с линейным градиентом NaCl (от 0,35 до 1 М). В элюате измеряли экстинкцию при длине волны 280 нм и фракции с экстинкцией более 0,1 объединяли. Объединенную фракцию направляли на диализ против дистиллированной воды при температуре 4 °С в течение 24 ч.

Профиль элюции КМ-фракции с Macro-Prep High Q Support представлен на рис. 2. Профиль элюции хроматографической очистки на второй стадии характеризуется двумя пиками: один из них соответствует лактопероксидазе, а другой - ЛФ. Степень чистоты ЛФ составила ~95%. Содержание ЛФ - 74 мкг/см3, содержание лактопероксидазы составило, соответственно, 10 мкг/см3.

Чистота выделенного из обезжиренного молока ЛФ была подтверждена методом SDS-электрофореза в ПААГ (рис. 3). На электрофореграмме (дорожка 2) видна четкая линия, соответствующая белку с молекулярной массой 80 кДа. Полученная электрофореграмма подтверждает, что в результате двойной ионообменной хроматографии на КМЦ и Macro-Prep High Q Support из обезжиренного коровьего молока голштино-фризской породы был получен чистый препарат ЛФ. Выделенный ЛФ расфасовывали в пенициллиновые флакончики по 2 см3, лиофильно высушивали.

После качественного анализа был проведен количественный анализ содержания ЛФ, выделенного из обезжиренного коровьего молока. Для этого использовали твердофазный гетерогенный иммунный анализ (ИФА, Elisa). Для ИФА лактоферрина коровьего молока определяли титр антисыворотки непрямым методом. На стенках лунок планшетов сорбировали ЛФ и определяли связывание с ним иммунной сыворотки в последовательных разведениях. Раствор антигена (лактоферрина) инкубировали на пластиковой подложке при температуре 37 °С в течение 2 ч. Свободный антиген удаляли путем отмывания 5-6 раз смесью растворов буфера NaH2PO4x2H2O с хлоридом натрия (рН 7,4) и Tween 20 (PBST) в объеме 220 мм3 в лунку. Затем подложку обрабатывали избытком постороннего белка (человеческий сывороточный альбумин, ЧСА) для предотвращения последующего неспецифического связывания белков. Исследуемые образцы по 50 мм3 переносили в лунки, добавляли столько же свежеприготовленного раствора конъюгата, который разбавляли (1:80). Планшеты инкубировали в термошейкере (TSP-60) в течение 1 ч при 37 °С. Несвязанные белки отмывали 5-кратным добавлением по 220 мм3 раствора PBST в лунку. Заливали в лунки свежеприготовленный раствор субстрата [0,04М ABTS, 0,01М цитрат натрия (рН 4,0) и 3% раствор Н202] по 200 мм3 в лунку и оставляли при комнатной температуре для развития окраски. Измеряли экстинкцию на планшетном фотометре (MR-600) для иммуноферментного анализа. Содержание ЛФ в образцах определяли по калибровочной кривой, для построения которой в качестве стандарта использовали коммерческий препарат бычьего ЛФ с концентрацией 1 мг/см3. Полученный раствор белка раститровывали по лункам планшетов (по 50 мм3 в лунку), инкубировали в течение 1 ч при 37 °С, отмывали 6 раз свежим раствором PBST, добавляли раствор субстрата [0,04 М ABTS, 0,1М цитрат натрия (рН 4,0), 3% раствор перекиси водорода] по 200 мм3 в лунку. Определяли экстинкцию при длине волны 410 нм на планшетном фотометре MR-600 и строили калибровочную кривую "Зависимость экстинкции (А) от десятичного логарифма концентрации (lg С) бычьего лактоферрина".

Как следует из данных литературы, до 15% ЛФ в коровьем молоке содержится в холоформе, а остальной - в апоформе. Если перевести и оставшийся аполактоферрин в холоформу, то его можно рассматривать в качестве источника железа в легкоусвояемой форме в отличие от солей железа, используемых при производстве биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов [16-20].

Каждая молекула ЛФ прочно связывает 2 иона РеЗ+. Комплекс с ионами РеЗ+ образуется в присутствии бикарбонатных ионов:

Присоединение ионов железа к ЛФ меняет его изоэлектрическую точку с 9,2 на 8,5 за счет одновременного присоединения отрицательно заряженных бикарбонатных ионов. Конформационные изменения при связывании с ионами железа обеспечивают образование более компактной структуры ЛФ. Для аполактоферрина (свободного от ионов железа) характерна открытая конформация N-доли и закрытая конформация С-доли. Он устойчив к нагреванию (90-100 °С в течение 5 мин) при рН 4,0. Известно, что хололактоферрин, который является железонасыщенным, проявляет большую устойчивость к действию пищеварительных протеаз, чем аполактоферрин. Для хололактоферрина характерна закрытая конформация обеих долей.

Перевод апоформы ЛФ в холоформу осуществляли диализом против раствора бикарбоната натрия, содержащего РеЗ+. Пик спектра поглощения хололактоферрина - при 465 нм [21]. Эти спектральные свойства могут быть использованы для оценки степени насыщенности железом ЛФ. Коэффициенты экстинкции коммерческих препаратов ЛФ представлены в таблице.

Железосвязывающую способность ЛФ коровьего молока определяли следующим образом. Образцы ЛФ помещали в раствор 0,005 M FeCl3 и 0,05 M NaHC03 при pH 8,5 и выдерживали при 4 °С в течение 5 ч. Избыток несвязавшегося железа удаляли диализом против буфера, содержащего 0,01 М трис-НС1, рН 7,5 в течение 2 ч. Определяли экстинкцию образцов при 465 нм против контрольного раствора, содержащего трис-НСl, рН 7,5. Для получения аполактоферрина, свободного от ионов железа, использовали диализ против 0,1 М лимонной кислоты (рН 2,0) или диализ против раствора ЭДТА при нейтральном рН. Для приготовления хололактоферрина, который является железонасыщенным, осуществляли диализ ЛФ против раствора бикарбоната натрия, содержащего добавленное железо. Определение холоформы в выделенном ЛФ оценивали с помощью УФ-спектроскопии исходя из коэффициента экстинкции 15,1 для чистого 1% раствора коммерческого ЛФ при 280 нм (см. таблицу). Результаты исследований по определению железосвязывающей активности ЛФ показали, что его насыщение железом составляло около 30%, как было обнаружено с помощью оптической спектроскопии при 465 нм исходя из коэффициента экстинкции 0,58 (1% раствор при 100% насыщения железом). Таким образом, 70% выделенного ЛФ находилось в апоформе.

В современных условиях импортозамещения имеется острая потребность производства ЛФ из отечественного сырья на предприятиях, работающих на едином товарном рынке стран - участниц Таможенного союза. Проведенные исследования позволяют рекомендовать отечественным предприятиям молочной промышленности использовать для выделения ЛФ из сборного коровьего молока предложенную методику, которая обеспечивает выход чистого ЛФ около 95%, с концентрацией около 74 мкг/см3. Полученный новый фактический материал дает предпосылки для дальнейших исследований с целью обоснования возможности использования насыщенной железом формы хололактоферрина коровьего молока голштино-фризской породы в качестве отечественного сырья для производства биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов.

Финансирование. Исследования выполнены при финансировании Минобрнауки России (грант № 15.7579.2017/8.9).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Литература

1. Adlerova L., Bartoskova A. Lactoferrin: a review // Veterinarni Medicina. 2008. Vol. 53, N 9. P. 457-468.

2. Legrand D., Pierce A., Elass E., Carpentier M., Mariller C., Mazurier J. Lactoferrin structure and functions // Adv. Exp. Med. Biol. 2008. Vol. 606. P. 163-194.

3. Gonzales-Chavez S.A., Arevalo-Gallegos S., Rascon-Cruz Q. Lactoferrin: structure, function and application // Int. J. Antimicrob. Agents. 2009. Vol. 33, N 4. P. 301.e1-301.e8.

4. Bing Fang, Ming Zhang, Mai Tiana, Lu Jiang, Hui Yuan Guo, Fa Zheng Ren Bovine lactoferrin binds oleic acid to form an anti-tumor complex similar to HAMLET // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1841. P. 535-543.

5. Weinberg E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential // J. Pharm. Pharmcol. 2001. Vol. 53, N 10. P. 1303-1310.

6. Шидловская В.П. Ферменты молока. СПб. : ГИОРД. 2006. 296 с.

7. Pierce A., Legrand D., Mazurier J. Lactoferrin: a multifunctional protein // Med. Sci. (Paris). 2009. Vol. 25, N 4. P. 361-369.

8. Huma Bokkhim, Nidhi Bansal, Lisbeth Grondahl, Bhesh Bhandari Physico-chemical properties of differents forms of bovine lactoferrin // Food Chem. 2013. Vol. 141, N 3. P. 3007-3013.

9. Chapple D.S., Mason D.J., Joannou C.L., Odell E.W., Gant V., Evans R.W. Structure-function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region on human lactoferrin against Escherichia coli serotype O111 // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 6. P. 2434-2440.

10. Ekins A., Khan A.G., Shouldice S.R. Lactoferrin receptors in Gram-negative bacteria: Insights into the iron acquisition process // Biometals. 2004. Vol. 17, N 3. P. 235-243.

11. Scarino M.L. A sideways glance: take it or leave it? The role of lactoferrine in iron sequestration and delivery within the body // Genes Nutr. 2007. Vol. 2, N 2. P. 161-162.

12. Сhow L.M., Subbaraman L.N., Sheardown H. Kinetics of in vitro lactoferrin deposition on silicone hydrogel and FDA group II and group IV hydrogel contact lens materials // Biomater. Sci. Polym. Ed. 2009. Vol. 20, N 1. P. 71-82.

13. Wakabayaschi H., Yamauchi K., Abe F. Quality control of commercial bovine lactoferrin // Biometals. 2018. Vol. 31, N 3. P. 313-319.

14. Shimazaki K.-I. Lactoferrin: a marvelous protein in milk? // Anim. Sci. J. 2000. Vol. 71, N 4. P. 329-347.

15. Blel M., Cazes J., Guingamp M.F., Gaillard J.L. Improvement of a method for the measurement of lactoperoxidase activity in milk // Int. Dairy J. 2001. Vol. 11, N 10. P. 795-799.

16. Artym J. The role of lactoferrin in the iron metabolism. Part I. Effect of lactofferin on intake, transport and iron storage // Postepy Hig. Med. Dosw. 2008. Vol. 62. P. 599-612.

17. Chapple D.S., Hussain R., Joannou C.L., Hancock R.E.W., Odell E., Evans R.W. et al. Structure and association of human lactoferrin peptides with Escherichia coli lipopolysaccharide // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. Vol. 48, N 6. P. 2190-2198.

18. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Суханов Б.П., Кудашева В.А. Микронутриенты в питании здорового и больного человека. М. : Колос, 2002. 423 с.

19. Хотимченко С.А., Алексеева И.А. Подходы к оценке алиментарной нагрузки чужеродными веществами // Гиг. и сан. 2001. № 5. С. 25.

20. Хотимченко С.А., Алексеева И.А., Батурин А.К. Распространенность и профилактика дефицита железа у детей и беременных женщин: влияние пищевого фактора // Рос. педиатр. журн. 1999. № 1. С. 21-29.

21. Бейкер Е.Н., Бейкер Х.М., Кун Н., Кидд Р.Д. Лактоферрин: свойства и применение // Мол. пром-сть. 2006. № 2. С. 38-39.

References

1. Adlerova L., Bartoskova A. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 2008; 53 (9): 457-68.

2. Legrand D., Pierce A., Elass E., Carpentier M., Mariller C., Mazurier J. Lactoferrin structure and functions. Adv Exp Med Biol. 2008; 606: 163-94.

3. Gonzales-Chavez S.A., Arevalo-Gallegos S., Rascon-Cruz Q. Lactoferrin: structure, function and application. Int J Antimicrob Agents. 2009; 33 (4): 301.e1-8.

4. Bing Fang, Ming Zhang, Mai Tiana, Lu Jiang, Hui Yuan Guo, Fa Zheng Ren Bovine lactoferrin binds oleic acid to form an antitumor complex similar to HAMLET. Biochim Biophys Acta. 2014; 1841: 535-43.

5. Weinberg E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. J Pharm Pharmcol. 2001; 53 (10): 1303-10.

6. Shidlovskaya V.P. Ferments of milk. Saint Petersburg: GIORD, 2006: 296 p. (in Russian)

7. Pierce A., Legrand D., Mazurier J. Lactoferrin: a multifunctional protein. Med Sci (Paris). 2009; 25 (4): 361-9.

8. Huma Bokkhim, Nidhi Bansal, Lisbeth Grondahl, Bhesh Bhandari Physico-chemical properties of differents forms of bovine lactoferrin. Food Chem. 2013; 141 (3): 3007-13.

9. Chapple D.S., Mason D.J., Joannou C.L., Odell E.W., Gant V., Evans R.W. Structure-function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region on human lactoferrin against Escherichia coli serotype O111. Infect Immun. 1998; 66 (6): 2434-40.

10. Ekins A., Khan A.G., Shouldice S.R. Lactoferrin receptors in Gram-negative bacteria: Insights into the iron acquisition process. Biometals. 2004; 17 (3): 235-43.

11. Scarino M.L. A sideways glance: take it or leave it? The role of lactoferrine in iron sequestration and delivery within the body. Genes Nutr. 2007; 2 (2): 161-2.

12. Сhow L.M., Subbaraman L.N., Sheardown H. Kinetics of in vitro lactoferrin deposition on silicone hydrogel and FDA group II and group IV hydrogel contact lens materials. Biomater Sci Polym Ed. 2009; 20 (1): 71-82.

13. Wakabayaschi H., Yamauchi K., Abe F. Quality control of commercial bovine lactoferrin. Biometals. 2018; 31 (3): 313-9.

14. Shimazaki K.-I. Lactoferrin: a marvelous protein in milk? Anim Sci J. 2000; 71 (4): 329-47.

15. Blel M., Cazes J., Guingamp M.F., Gaillard J.L. Improvement of a method for the measurement of lactoperoxidase activity in milk. Int Dairy J. 2001; 11 (10): 795-9.

16. Artym J. The role of lactoferrin in the iron metabolism. Part I. Eff ect of lactoff erin on intake, transport and iron storage. Postepy Hig Med Dosw. 2008; 62: 599-612.

17. Chapple D.S., Hussain R., Joannou C.L., Hancock R.E.W., Odell E., Evans R.W., et al. Structure and association of human lactoferrin peptides with Escherichia coli lipopolysaccharide. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48 (6): 2190-8.

18. Tutelyan V.A., Spirichev V.B., Sukhanov B.P., Kudasheva V.A. Micronutrients in the diet of a healthy and sick person. Moscow: Kolos, 2002: 423 p. (in Russian)

19. Khotimchenko S.A., Alekseeva I.A. Approaches to the evaluation of alimentary load by foreign substances. Gigiena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2001; (5): 25. (in Russian)

20. Khotimchenko S.A., Alekseeva I.A., Baturin A.K. Prevalence and prevention of iron defi ciency in children and pregnant women: the impact of food factor. Rossiyskiy pediatricheskiy zhurnal [Russian Journal of Pediatrics]. 1999; (1): 21-9. (in Russian)

21. Baker E.N., Baker H.M., Kuhn N., Kidd R.D. Lactoferrin: properties and applications. Molochnaya promyshlennost’ [Dairy Industry]. 2006; (2): 38-9. (in Russian)