Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии EH92-527-1 в пищевой продукции

Резюме

Цель исследования - разработка протокола количественного определения генно-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии EH92-527-1 в формате дуплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqManR PCR.

Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый - для выявления специфичной трансформационному событию EH92-527-1 последовательности ДНК, второй - для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.

Результатом этих исследований являлся оптимизированный состав реакционной смеси для идентификации EH92-527-1 и фрагмента гена Stp23 в дуплексной системе: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ROX (carboxy-X-rhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (EH92-f/EH92-r) и целевого таксона (GРF3/GРR3) в количестве 250/250 и 100/100 нM, зонды - 200 и 200 нM соответственно; бычий сывороточный альбумин - 0,04%; MgCl2 - 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95 °С - 5 мин, последующие 45 циклов: 95 °С - 20 с, 58 °С - 20 с, 62 °С - 40 с).

Заключение. Разработан метод количественного определения ДНК ГМ-картофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности.

Ключевые слова:ГМ-картофель, методы контроля, ПЦР-РВ, дуплексная ПЦР, трансформационное событие EH92-527-1

Для цитирования: Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Груздев Д.С., Сухачева М.В. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии EH92-527-1 в пищевой продукции // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 1. С. 57-61. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10006.

Система контроля за оборотом генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО) на продовольственном рынке, действующая в настоящее время в Российской Федерации, предусматривает использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Особенности законодательного регулирования ГМО (порог маркировки и порог отнесения к случайной или технически неустранимой примеси составляет 0,9%) определяют необходимость применения количественных методов анализа, к которым относится ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Существующий перечень протоколов ПЦР-РВ, аттестованных (валидированных) и утвержденных в соответствии с международными стандартами в области методов контроля за ГМО, позволяет идентифицировать и проводить количественный анализ содержания кукурузы (27 линий), сои (17), риса (2), сахарной свеклы (1), а также картофеля (1) и прочих культур [1-3]. База данных Объединенного исследовательского центра Европейской комиссии (Joint Research Centre of the European Commission, JRC EC) [3] содержит 125 протоколов ПЦР, из них 68 - для событие-специфичного анализа, 22 - для конструкт-специфичного анализа, а также 35 - для элемент-специфичного анализа (по ситуации на декабрь 2018 г.).

Принимая во внимание, что все вышеупомянутые протоколы предусматривают применение реакционных смесей европейских производителей, их использование в рутинной практике российских испытательных лабораторий имеет целый ряд ограничений экономического и логистического характера. Методическое обеспечение контроля за ГМО в Российской Федерации предусматривает в том числе адаптацию существующих ПЦР-протоколов к отечественным реагентам и приборам, валидацию новых методов в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 [4] и МУК 4.2.3389-16 [5] и разработку методических указаний или государственных стандартов, утверждаемых в установленном порядке. К настоящему времени в Российской Федерации перечень методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК включает 27 линий (трансформационных событий), а также методы скринингового анализа, основанные на определении конструкт-специфичной и элемент-специфичной ДНК. Все эти методы в различных комбинациях представлены более чем в 150 коммерческих тест-системах отечественного производства, позволяющих выявить присутствие более 80% от всех зарегистрированных в мире ГМО.

Следует отметить, что совершенствование методологии лабораторного контроля за ГМО на современном этапе развития подразумевает использование мультиплексирования ПЦР-РВ. В основе концепции мультиплексной ПЦР лежит возможность регистрации накопления специфичных продуктов амплификации по нескольким каналам детекции, так как ПЦР-РВ позволяет одновременно использовать несколько комплементарных пар красителей/гасителей с неперекрывающими спектрами излучения. Применение мультиплексной ПЦР-РВ, предполагающей протекание двух и более реакций в одной пробирке, позволяет существенно сократить время проведения анализа, снизить расход реагентов и риск возникновения ошибок при пипетировании и т.п. [6, 7].

Цель данной работы - разработка протокола количественного определения ГМ-картофеля линии EH92-527-1 в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR.

Материал и методы

В работе были использованы стандартные сертифицированные образцы ГМ-картофеля линии EH92-527-1 (кат. № ERM-BF421b) и образцы не ГМ-аналога (кат. № ERM-BF421a) производства JRC-IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements), Бельгия. ERM-BF421b произведен из лиофилизированных клубней картофеля, концентрация ГМО составляет 100%; ERM-BF421a - из традиционного картофеля сорта Kuras.

Для выделения ДНК применяли модифицированный метод щелочной экстракции по Бирнбойму-Доли и Wizard-технологии фирмы "Promega" (США) [8, 9]. Количество и качество ДНК определяли общепринятыми методами [10].

Для идентификации трансформационного события EH92-527-1 и фрагмента гена Stp23 применяли флуо-ресцентно-меченные зонды и пары праймеров (табл. 1). Праймеры и зонды синтезированы НПК "Синтол" (РФ).

Для проведения ПЦР использовали амплифика-тор CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, США). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета CFX Manager™ Software, версия 1.6.

Результаты и обсуждение

Выбор оптимальных параметров ПЦР проводили на основании эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.

Результаты исследований, включающие состав реакционной смеси и режим амплификации, представлены в табл. 2 и 3.

В соответствии с требованиями к валидации методов контроля за ГМО [5] экспериментально определены аналитические характеристики метода.

Наличие прямо пропорциональной зависимости аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце подтвердило линейность разработанной методики. В диапазоне рабочих концентраций от 0,1 до 5% угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, а коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) превышал 0,98. Значения систематической ошибки и относительного стандартного отклонения (RSDr) находились в допустимом интервале (±25%) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что свидетельствует о правильности и прецизионности разработанного протокола.

Предел обнаружения составил 0,1%, или 56 копий геномной ДНК картофеля линии ЕН92-527-1 из расчета на 100 нг суммарной ДНК, RSDr≤25%. Предел количественного обнаружения - 0,3%, или 168 копий геномной ДНК картофеля линии ЕН92-527-1 из расчета на 100 нг суммарной ДНК, RSDr≤25%.

Заключение

Таким образом, разработан метод количественного определения ДНК ГМ-картофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности, что позволяет рекомендовать данный метод для использования в рамках надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04123).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

1. Angers-Loustau A., Petrillo M., Bonfi ni L. et al. JRC GMO-Matrix: a web application to support Genetically Modifi ed Organisms detection strategies // BMC Bioinformatics. 2014. Vol. 15, N 1. P. 417.

2. Bonfini L., van den Bulcke M.H., Mazzara M., Ben E. et al. GMOMETHODS: The European Union database of reference methods for GMO analysis // J. AOAC Int. 2012. Vol. 95, N 6. P. 1713-1719.

3. GMOmethods Online Database. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/ (date of access October 27, 2018).

4. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения М. : Стандартинформ, 2009. 24 с.

5. Валидация методов, предназначенных для выявления и идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах и продовольственном сырье : методические указания (МУК 4.2.3389-16). М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. 19 с.

6. Аляпкина Ю.С., Моисеева М.В., Ксенофонтова О.В., Алексеев Я.И. Разработка и валидация набора для мультиплексного ПЦР-РВ анализа регуляторных элементов (промотора SsuAra и терминатора Е9) для обнаружения генетически модифицированных (ГМ) линий рапса, сои, картофеля и других растений // Изв. Тимирязевской с.-х. акад. 2018. № 3. С. 5-16.

7. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Сухачева М.В., Батурин А.К. Молекулярно-генетические исследования генно-инженерно- модифицированного картофеля: трансформационное событие PH05-026-0048 // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 25-31.

8. Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.

9. ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с.

10. ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005). Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2009. 60 с.

11. Event-Specific Method for the Quantification of Amylopectin Potato Event EH92-527-1 Using Real-time PCR. Community Reference Laboratory for GM Food and Feed. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EH92-527-1-%20Validation%20Report.pdf (дата обращения: 27.10.2018).

12. Кочиева Е.З., Сухачева М.В., Слугина М.А. и др. Способ количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО, с использованием высокоспецифичного ДНК-маркера. Пат. РФ № 2658352 от 20.06.2018.

References

1. Angers-Loustau A., Petrillo M., Bonfini L., et al. JRC GMOMatrix: a web application to support Genetically Modifi ed Organisms detection strategies. BMC Bioinformatics. 2014; 15 (1): 417.

2. Bonfini L., van den Bulcke, M. H., Mazzara M., Ben E., et al. GMOMETHODS: The European Union database of reference methods for GMO analysis. J AOAC Int. 2012; 95 (6): 1713-9.

3. GMOmethods Online Database. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/ (date of access October 27, 2018).

4. GOST R ISO 5725-1-2002 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1. General principles and definitions. Moscow: Standartinform, 2009: 24 p. (in Russian)

5. Methodical Guidelines 4.2.3389-16. Validation of methods for detection and identification of genetically modified organisms in food products and food raw materials’. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology of Federal Office for Inspectorate in Field of Consumers and Human Well-Being Protection, 2016: 19 p. (in Russian)

6. Alyapkina Yu.S., Moiseyeva M.V., Ksenofontova O.V., Alekseyev Ya.I. Development and validation of multiplex real-time PCR test system for analyzing regulator elements (SsuAra promoter and E9 terminator) to detect genetically-modified strains of rape, soybeans, potatoes and other plants. Izvestiya Timiryazevskoy sel’skokhozyaystvennoy akademii [Bulletin of the Timiryazev Agricultural Academy]. 2018; (3): 5-16. (in Russian)

7. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Sukhacheva M.V., Baturin A.K. Molecular and genetic studies of genetically engineered potato: transformation event PH05-026-0048. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 25-31. (in Russian)

8. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extraction from different food products using the modified alkaline method. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2009; (2) 83-90. (in Russian)

9. GOST R ISO 21571-2014. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)

10. GOST R 53244-2008 [ISO 21570:2005]. Foodstuff s. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods. Moscow: Standartinform, 2009: 60 с. (in Russian)

11. Event-specific Method for the Quantification of Amylopectin Potato Event EH92-527-1 Using Real-time PCR. Community Reference Laboratory for GM Food and Feed. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EH92-527-1-%20Validation%20Report.pdf (date of access October 27, 2018).

12. Kochieva E.Z., Sukhacheva M.V., Slugina M.A., et al. Method for quantitative determination of potato genomic DNA in plant raw materials and products derived from it, including the quantitative identification of GMO, using a highly specific DNA marker. RU Patent No. 2658352 of 06/20/2018. (in Russian)