Особенности метаболизма меди у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе

Резюме

Медь относится к эссенциальным микронутриентам, так как является каталитическим и структурным кофактором ферментов, контролирующих базовые процессы во всех клетках, а также участником сигнальных путей. Токсические свойства ионов меди, обусловленные их химической природой, проявляются при нарушении ее гомеостаза в клетках и в целом организме.

Цель работы - выявление связи между калорийностью корма, статусом меди в крови, метаболизмом меди в печени и белой жировой ткани (БЖТ) крыс.

Материал и методы. Работа выполнена на 3 группах (в каждой n=5) белых беспородных крыс (средняя масса тела 220±15 г), содержавшихся в течение 75 дней на стандартном, низкокалорийном (НКР) или высококалорийном (высокожировом) (ВКР) рационах. Концентрацию мРНК определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией. Содержание церулоплазмина (ЦП) определяли методом иммуноэлектрофореза, иммуноблоттинга и по оксидазной активности. Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии.

Результаты и обсуждение. Показано, что в сыворотке крови крыс, содержавшихся на НКР, увеличивался уровень триглицеридов, а при ВКР снижались основные показатели статуса меди (концентрация атомной меди, уровень холо-ЦП и содержание иммунореактивного ЦП). В печени ни один из рационов не влиял на уровень экспрессии гена ЦП. В клетках подкожной жировой клетчатки при НКР достоверно повышалась концентрация обеих сплайс-форм ЦП-мРНК. В висцеральной жировой клетчатке при НКР концентрация ЦП-мРНК, кодирующей секреторный ЦП, не менялась, но содержание мРНК, кодирующей ЦП, связанный с мембраной, по сравнению с контрольной группой падало почти до нуля. При ВКР достоверных изменений в уровне обеих сплайс-форм ЦП-мРНК не было. Обсуждаются особенности метаболизма меди в клетках печени и БЖТ, обусловленные калорийностью корма.

Заключение. У крыс связь между метаболизмом меди и калорийностью рациона в печени проявляется в изменении экспрессии гена ЦП на уровне трансляции, а в БЖТ - на уровне транскрипции и посттранскрипционного созревания пре-мРНК этого гена.

Ключевые слова:метаболизм меди, церулоплазмин, экспрессия гена церулоплазмина, статус меди сыворотки крови, белая жировая ткань, низко- и высококалорийный рацион

Для цитирования: Ильичева ЕЮ., Канаш Л.А., Тимирова З.Р., Цымбаленко Н.В., Орлов Ю.А., Клюева Н.Н., Скоморохова Е.А. Денисенко А.Д., Пучкова Л.В. Особенности метаболизма меди у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе // Вопр. питания. 2019. Т 88, № 1. С. 41-48. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10004.

В последние 20 лет физиологическая роль белой жировой ткани (БЖТ), которая долго рассматривалась только как инертное депо липидов, важное для поддержания энергетического баланса, в корне пересматривается. Формируется концепция, согласно которой БЖТ является анатомически гетерогенным эндокринным органом, вовлеченным, помимо терморегуляции, в регуляцию углеводного и липидного обмена, а также в контроль над воспалительным ответом и чувствительностью к инсулину [1]. Недавно было показано, что церулоплазмин (ЦП), основной медьсодержащий белок крови печеночного происхождения, который включает 95-96% внеклеточной меди [2, 3], является и адипокином [4, 5]. ЦП относится к полифункциональным белкам категории "moonlighting" [2], основными функциями которого являются окисление Fe(II) → Fe(III), требуемое для переноса железа через мембраны, регуляция уровня катехоламинов и транспорт меди к клеткам негепатоцитарных рядов. Показано, что клетки БЖТ продуцируют ЦП на низком уровне, однако синтез и секреция ЦП в кровоток многократно повышаются в клетках опухолей, развитие которых связано с ожирением [4, 5]. При хроническом дефиците сывороточного холо-ЦП в клетках подкожной жировой клетчатки (ПЖК) повышается продукция ЦП-мРНК, кодирующей секреторную форму ЦП, что компенсирует дефицит холо-ЦП в крови [6, 7]. У мышей с нокаутированным геном Atp7b в гепатоцитах наряду с накоплением меди и снижением продукции холо-ЦП (фенотипические проявления мутаций в этом гене, болезнь Вильсона) также наблюдали нарушение липидного обмена [8]. Приведенные факты свидетельствуют о существовании межорганной системы, направленной на поддержание гомеостаза меди в организме, в которой наряду с печенью - центральным органом, контролирующим баланс меди, принимает активное участие и БЖТ. Ранее было показано, что повышение концентрации меди в корме млекопитающих, принадлежащих к различным отрядам (жвачные [9], зайцевые [10], грызуны [11], нежвачные парнокопытные [12]), изменяет липидный метаболизм в различных органах, в том числе и в БЖТ. Возможно, это связано с тем, что медь контролирует липолиз через активацию сАМР-зависимого сигнального пути [13]. Многие стороны систем, обеспечивающих безопасный транспорт и утилизацию токсичных и одновременно жизненно необходимых ионов меди, известны [14, 15]. Общепризнанно, что с нарушением гомеостаза меди связано развитие сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, онкологических заболеваний и метаболического синдрома [5, 16]. Сведения о влиянии липидного обмена на метаболизм меди в БЖТ отсутствуют.

Цель работы - выявление связи между калорийностью корма, статусом меди в крови, метаболизмом меди в печени и БЖТ крыс.

Представленная работа фокусируется на экспрессии гена ЦП в клетках печени и БЖТ у крыс, содержавшихся на низко- или высококалорийном рационе (НКР и ВКР соответственно). Поскольку ПЖК и висцеральная жировая клетчатка (ВЖК) различаются по многим параметрам (анатомическому строению, клеточному составу, паттернами экспрессирующихся генов, способностью утилизировать жирные кислоты, чувствительностью к инсулину, к катехоламинам и др. [5]), исследование проведено на обоих подтипах БЖТ.

Материал и методы

Животные и их содержание. Исследование было одобрено Комитетом по этике ФГБНУ "Институт экспериментальной медицины" (Санкт-Петербург, Россия), который руководствовался приказом Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики", проведено с соблюдением Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой Европейским союзом в 1986 г.

Работа выполнена на белых беспородных самцах крыс, приобретенных в питомнике Рапполово (Ленинградская область, Россия). Крысы адаптировались в течение 1 мес в виварии ФГБНУ "Институт экспериментальной медицины". Их содержали в пластиковых клетках на древесных опилках. В помещении поддерживали 12:12-часовой цикл свет-темнота и 60% влажность. После карантина крысы (средняя масса тела 220±15 г) были разделены на 3 группы (в каждой n=5). Животные контрольной группы получали стандартный рацион - сухой полнорационный экструдированный комбикорм (ООО "Лабораторкорм", Россия) (СК-крысы), в котором содержалось 19% белка, 5% жиров, 4,9% клетчатки, энергетическая ценность 295 ккал/100 г. Крысы 2-й группы получали НКР (НКР-крысы) - комбикорм (ООО "Лабораторкорм", Россия) с калорийностью 195 ккал/100 г и содержанием белка 18,5%, клетчатки - 11,76%. Крысы 3-й группы получали высококалорийный рацион (ВКР-крысы) - 420 ккал/100 г, который готовили из пшенной каши и сала в соотношении 100 г сырого свиного сала на 100 г сухой крупы (масса которой после варки увеличивается в 3 раза), в готовом корме содержание сала составляло 25%. Все животные получали воду и корм без ограничения. Учет потребления корма не проводили. Крысы ежесуточно получали 40-50 г корма на 1 животное, который не съедали полностью. Концентрация меди в корме составила соответственно 12,5; 20 и 9 мг/кг, т.е. со всеми рационами животные получали количество меди, соответствующее физиологической норме.

Эксперимент длился 75 дней. В течение этого времени животных взвешивали через каждые 7 дней. Крыс гильотинировали, собирали образцы тканей и крови. Кровь оставляли при комнатной температуре до образования сгустка, затем центрифугированием собирали сыворотку. Все биологические образцы хранили при -80 °С.

Тотальную рибонуклеиновую кислоту (РНК) выделяли с помощью реагента TRIzol в соответствии с рекомендациями производителя (Ambion, США). Степень чистоты препаратов РНК оценивали по отношению экстинкций A260/A280, которое не было ниже 1,8. Измерение проводили на спектрофотометре "NanoDrop 2000" (Thermo Scientific, США), о нативности препаратов РНК судили по соотношению зон 18S/28S рРНК, выявляемых при электрофорезе в 1,4% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Синтез кДНК на полученных препаратах РНК проводили с помощью обратной транскрипции. Реакционная смесь (25 мм3) содержала 500 нг тотальной РНК, 200 единиц M-MLV обратной транскриптазы, однократный буфер для обратной транскриптазы, эквимолярную смесь 4 dNTP по 500 мкМ каждого, 0,5 мкМ случайных праймеров и 0,5 мкМ 16-членных олиго-dT в присутствии 25 единиц ингибитора РНКаз (Promega, США). Относительное и абсолютное содержание молекулярных форм ЦП-мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе CFX96TM (Bio-Rad, США) с использованием неспецифического интеркалирующего красителя EVA Green по прописи производителя ("Синтол", РФ). Праймеры для ЦП-мРНК (F: ttg-ctg-ggt-aac-aga-atc-gct; R: gaa-gag-ttg-gag-aca-gtt-tag-tgg-a) и ЦП-мРНК, кодирующей ЦП, связанный с мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП) (F: tac-caa-gga-gta-gcc-agg-aaa-ata-a; R: aga-ata-tagctt-ttg-agg-ggc-aaa-g), были подобраны по программе "Primer-BLAST" (NCBI, США) и изготовлены фирмой "Синтол" (Москва, Россия).

Иммуноблоттинг с антителами к высокоочищенному препарату ЦП крысы [17], определение относительного содержания холо-ЦП в геле окрашиванием ор-тодианизидином, измерение оксидазной активности колориметрическим методом с парафенилендиамином, количественный иммуноэлектрофорез и измерение концентрации меди методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ZEEnit 650P, Analytik Jena, Германия) описаны ранее [18]. Содержание общего холестерина, триглицеридов и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяли на анализаторе "Chem Well" (Awareness Technology, США).

Статистический анализ данных проводили с применением пакета программ Statistica 8. Данные представлены как среднее ± стандартное квадратичное отклонение. При сравнении двух групп применяли критерий Стьюдента для неравных дисперсий. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

За динамикой массы тела животных следили в течение всего эксперимента. На рис. 1А показано, что масса тела СК-крыс росла равномерно и к концу эксперимента увеличилась почти в 1,5 раза. Чтобы исключить влияние естественного роста крыс на результаты измерений, все нижеописанные исследования были проведены на образцах печени и БЖТ, взятых у СК-крыс в начале и в конце эксперимента. Поскольку изменений не было найдено (данные не приводятся), в работе в качестве контроля использовали СК-крыс одного возраста с НКР- и ВКР-крысами. В течение первых 2 нед масса тела крыс групп НКР и ВКР изменялась одинаково с контрольной группой (см. рис. 1А). После 3-й недели крысы в группе НКР прогрессивно теряли массу тела, а в группе ВКР набирали ее. Через 75 дней НКР-крысы отличались по массе тела от ВКР-крыс почти в 2 раза (p<0,05). Для оценки изменения массы подкожных жировых отложений использовали жир, располагающийся в области бедра, внутренних жировых отложений - жир, локализованный в брюшной полости в области брыжейки. За 100% принимали изменение массу этих участков БЖТ у СК-крыс этого же возраста. Данные, приведенные на рис. 1Б, показывают, что масса подкожного жира у НКР-крыс была почти в 3 раза ниже, а у ВКР-крыс в 1,5 раза выше, чем у животных на СК. Масса висцерального жира у НКР-крыс была в 2 раза ниже, а у ВКР-крыс в 2 раза выше, чем у СК-крыс. Данные позволяют считать, что диета с высоким содержанием сала и углеводов индуцировала рост БЖТ.

Концентрация общего холестерина и холестерина, связанного с ЛПВП, в сыворотке крови крыс всех групп была примерно одинаковой (см. таблицу). У НКР-крыс повышалось содержание триглицеридов по сравнению с крысами, находившимися на стандартном или высококалорийном рационе. В обеих экспериментальных группах, но не в СК-группе наблюдали широкие индивидуальные колебания значений регистрируемых параметров.

В качестве показателей статуса меди в сыворотке крови использовали атомную концентрацию меди, а также содержание оксидазного и иммунореактивного ЦП. Данные, приведенные на рис. 2А, показывают, что концентрация меди в сыворотке крыс всех групп была одинаковой. У ВКР-крыс концентрация оксидазного ЦП, по данным колориметрических измерений с парафенилендиамином (рис. 2Б) и окрашивания гелей ортодианизидином (данные не приводятся), была снижена примерно на 30%.

Содержание полипептидов ЦП, определенное методом ракетного иммуноэлектрофореза, соответствовало уровню содержания энзиматически активного ЦП (рис. 2В). Данные полностью совпадают с результатами определения относительного содержания иммунореактивного ЦП методом иммуноблоттинга (данные не приводятся). Полученные результаты позволяют заключить, что показатели статуса меди, которые в основном определяются метаболизмом меди в печени, при ВКР снижаются. При этом наблюдается несоответствие между снижением уровня ЦП и не изменяющейся концентрацией меди в сыворотке крови. Возможно, у ВКР-крыс молекула ЦП содержит больше лабильных атомов меди или в крови увеличивается содержание нецерулоплазминовой меди. Однако, чтобы понять природу этого противоречия, необходимы дополнительные исследования.

Концентрация меди у животных всех групп была измерена в печени, ПЖК, ВЖК, а также в почках, селезенке, сердце, легких, мышцах и семенниках. В печени по сравнению с СК-крысами концентрация меди у крыс обеих групп не менялась. У НКР-крыс концентрация меди повышалась в обоих подтипах БЖТ в большей степени, чем снижалась масса жировой ткани. В то же время у ВКР-крыс концентрация меди в БЖТ не менялась по сравнению с СК-крысами. В других органах, взятых в исследование, концентрация меди у НКР- и ВКР-крыс по сравнению СК-крысами не менялась (см. таблицу).

Повышение концентрации меди в клетках БЖТ при изменении калорийности корма и снижение уровня ЦП в крови при ВКР стали основанием для изучения экспрессии гена ЦП в клетках БЖТ. Общая транскрипционная активность, если судить по концентрации тотальной РНК, в печени примерно в 8 раз выше, чем в клетках ПЖК (2,5±0,4 мкг РНК/мг ткани в печени vs 0,31±0,08 мкг РНК/мг ткани в ПЖК), а в ПЖК примерно в 3 раза выше, чем в ВЖК (0,31±0,08 мкг РНК/мг ткани в ПЖК vs 0,09±0,02 мкг РНК/мг ткани в ВЖК). Измерение в печени концентрации зрелых транскриптов гена ЦП, кодирующих его секреторную форму, показало, что у крыс, содержавшихся как на НКР, так и на ВКР, по сравнению с СК-крысами экспрессия гена ЦП на уровне транскрипции не менялась (см. таблицу). Это может означать, что снижение концентрации полипептидов ЦП в крови у ВКР-крыс (рис. 2) происходит не за счет снижения скорости транскрипции гена ЦП в печени. Возможно, что в клетках печени ВКР-крыс подавлена трансляция ЦП-мРНК. Это предположение согласуется с существованием системы посттранскрипционного подавления активности гена ЦП с помощью управляющих сигналов в 3'-нетранслируемой области ЦП-мРНК [19, 20]. В клетках многих тканей, в том числе и в БЖТ, но не в гепатоцитах из первичного продукта транскрипции гена ЦП формируются 2 сплайс-формы ЦП-мРНК: мРНК, кодирующая секреторный ЦП, и ЦП-мРНК, кодирующая синтез ЦП, связанного с поверхностью плазматической мембраны через ГФИ-ЦП [6, 21]. У крыс СК-группы содержание ЦП-мРНК для секреторной формы ЦП в клетках ПЖК почти в 20 раз ниже, чем в печени, а в клетках ВЖК в 3 раза ниже, чем в ПЖК (рис. 3А, см. таблицу). Уровень секреторной формы ЦП-мРНК повышался в клетках ПЖК у НКР-крыс по сравнению с СК-крысами в 5 раз, а в клетках ВЖК-животных, содержащихся на ВКР, концентрация ЦП-мРНК была примерно в 3 раза выше, чем у СК-крыс (см. рис. 3А). Концентрация ГФИ-ЦП мРНК в ПЖК достоверно повышалась при содержании животных на НКР (рис. 3Б). В ВЖК крыс, содержавшихся на НКР, сплайс-форма ЦП-мРНК ГФИ-ЦП практически не формировалась, но ее уровень повышался у ВКР-крыс (см. рис. 3Б).

Заключение

В целом представленные данные позволяют заключить, что при ВКР показатели статуса меди в крови снижаются за счет пропорционального уменьшения концентрации полипептидов холо-ЦП, которое, возможно, происходит за счет снижения скорости трансляции ЦП-мРНК, содержащей в 3'-нетранслируемой области регуляторные последовательности, участвующие в посттранскрипционном подавлении активности гена ЦП [19, 20].

ПЖК по сравнению с ВЖК демонстрирует более высокую транскрипционную активность, в частности в отношении экспрессии гена ЦП, центрального белка внеклеточного круговорота меди, металлирование которого зависит от импорта меди в клетку, ее переноса в люмен аппарата Гольджи и корректного включения в апо-ЦП [14, 22].

Повышение концентрации меди в клетках ПЖК и ВЖК при обоих рационах согласуется с увеличением уровня экспрессии гена ЦП. Однако профиль формирования сплайс-форм ЦП-мРНК отличается между ПЖК и ВЖК и зависит от калорийности корма в обоих типах БЖТ.

Представленные данные впервые устанавливают связь между метаболизмом меди в БЖТ и калорийностью корма на фоне сбалансированного содержания меди в рационе. Они подтверждают участие меди в липидном метаболизме; результаты этих исследований могут помочь в понимании связи между развитием метаболического синдрома и нарушением гомеодинамики меди в организме млекопитающих.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 18-015-00481 и 16-34-60219) и Президента РФ (грант МК 2718.2018.4).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Kwok K.H., Lam K.S., Xu A. Heterogeneity of white adipose tissue: molecular basis and clinical implications // Exp. Mol. Med. 2016. Vol. 48. P. e215.

2. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a ‘moonlighting’ protein // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. N9. P. 1413-1427.

3. Bernevic B., El-Khatib A.H., Jakubowski N., Weller M.G. Online immunocapture ICP-MS for the determination of the metalloprotein ceruloplasmin in human serum // BMC Res. Notes. 2018. Vol. 11, N 1. P. 213-217.

4. Arner E., Forrest A.R., Ehrlund A. et al. Ceruloplasmin is a novel adipokine which is overexpressed in adipose tissue of obese subjects and in obesity-associated cancer cells // PLoS One. 2014. Vol. 9, N 3. Article ID e80274.

5. Gómez-Hernández A., Beneit N., Díaz-Castroverde S., Escribano Ó. Differential role of adipose tissues in obesity and related metabolic and vascular complications // Int. J. Endocrinol. 2016. Vol. 2016. Article ID 1216783.

6. Ilyechova E.Y., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. The role of subcutaneous adipose tissue in supporting the copper balance in rats with a chronic deficiency in holo-ceruloplasmin // PLoS One. 2017. Vol. 12, N 4. Aricle ID e0175214.

7. Ilyechova E.Y., Saveliev A.N., Skvortsov A.N., Babich P.S. et al. The effects of silver ions on copper metabolism in rats // Metallomics. 2014. Vol. 6, N 10. P. 1970-1987.

8. Muchenditsi A. Yang H., Hamilton J.P. et al. Targeted inactivation of copper transporter Atp7b in hepatocytes causes liver steatosis and obesity in mice // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2017. Vol. 313, N 1. P. G39-G49.

9. Engle T.E. Copper and lipid metabolism in beef cattle: a review // J. Anim. Sci. 2011. Vol. 89, N 2. P. 591-596.

10. Lei L., Xiaoyi S., Fuchang L. Effect of dietary copper addition on lipid metabolism in rabbits // Food Nutr. Res. 2017. Vol. 61, N 1. Article ID 1348866.

11. Tinkov A.A., Polyakova V.S., Nikonorov A.A. Chronic administration of iron and copper potentiates adipogenic effect of high fat diet in Wistar rats // Biometals. 2013. Vol. 26, N 3. P. 447- 463.

12. Amer M.A., Elliot J.I. Influence of supplemental dietary copper and vitamine E on the oxidative stability of porcine depot fat // J. Anim. Sci. 1973. Vol. 37, N 1 P. 87-90.

13. Krishnamoorthy L., Cotruvo J.A. Jr, Chan J. et al. Copper regulates cyclic-AMP-dependent lipolysis // Nat. Chem. Biol. 2016. Vol. 12, N 4. P. 586-592.

14. Lutsenko S. Copper trafficking to the secretory pathway // Metallomics. 2016. Vol. 8, N 9. P. 840-852.

15. Мазо В.К., Ширина Л.И. Медь в питании человека: абсорбция и биодоступность // Вопр. питания. 2005. Т. 74, № 2. С. 52-59.

16. Kozlowski H., Kolkowska P., Watly J. et al. General aspects of metal toxicity // Curr. Med. Chem. 2014. Vol. 21, N 33. P. 3721- 3740.

17. Соколов А.В., Костевич В.А., Романико Д.Н. и др. Двух- стадийный метод получения церулоплазмина на основе его взаимодействия с неомицином // Биохимия. 2012. Т. 77, № 6. С. 775-784.

18. Zatulovskaia Y.A., Ilyechova E.Y., Puchkova L.V. The features of copper metabolism in the rat liver during development // PLoS One. 2015. Vol. 10, N 10. Article ID e0140797.

19. Tapryal N., Mukhopadhyay C., Das D. et al. Reactive oxygen species regulate ceruloplasmin by a novel mRNA decay mechanism involving its 3’-untranslated region: implications in neurodegenerative diseases // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284, N 3. P. 1873-1883.

20. Mazumder B., Sampath P., Fox P.L. Translational control of ceruloplasmin gene expression: beyond the IRE // Biol. Res. 2006. Vol. 39, N 1. P. 59-66.

21. Mostad E.J., Prohaska J.R. Glycosylphosphatidylinositol-linked ceruloplasmin is expressed in multiple rodent organs and is lower following dietary copper deficiency // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2011. Vol. 236, N 3. P. 298-308.

22. Пучкова Л.В. Пищевая роль церулоплазмина молока // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. C. 4-17.

References

1. Kwok K.H., Lam K.S., Xu A. Heterogeneity of white adipose tissue: molecular basis and clinical implications. Exp Mol Med. 2016; 48: e215.

2. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a ‘moonlighting’ protein. Cell Mol Life Sci. 2002; 59 (9): 1413-27.

3. Bernevic B., El-Khatib A.H., Jakubowski N., Weller M.G. Online immunocapture ICP-MS for the determination of the metalloprotein ceruloplasmin in human serum. BMC Res Notes. 2018; 11 (1): 213-7.

4. Arner E., Forrest A.R., Ehrlund A., et al. Ceruloplasmin is a novel adipokine which is overexpressed in adipose tissue of obese subjects and in obesity-associated cancer cells. PLoS One. 2014; 9 (3): e80274.

5. Gómez-Hernández A., Beneit N., Díaz-Castroverde S., Escribano Ó. Diff erential role of adipose tissues in obesity and related metabolic and vascular complications. Int J Endocrinol. 2016; 2016: 1216783.

6. Ilyechova E.Y., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. The role of subcutaneous adipose tissue in supporting the copper balance in rats with a chronic deficiency in holo-ceruloplasmin. PLoS One. 2017; 12 (4): e0175214.

7. Ilyechova E.Y., Saveliev A.N., Skvortsov A.N., Babich P.S., et al. The effects of silver ions on copper metabolism in rats. Metallomics. 2014; 6 (10): 1970-87.

8. Muchenditsi A. Yang H., Hamilton J.P., et al. Targeted inactivation of copper transporter Atp7b in hepatocytes causes liver steatosis and obesity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2017; 313 (1): G39-49.

9. Engle T.E. Copper and lipid metabolism in beef cattle: a review. J Anim Sci. 2011; 89 (2): 591-6.

10. Lei L., Xiaoyi S., Fuchang L. Effect of dietary copper addition on lipid metabolism in rabbits. Food Nutr Res. 2017; 61 (1): 1348866.

11. Tinkov A.A., Polyakova V.S., Nikonorov A.A. Chronic administration of iron and copper potentiates adipogenic effect of high fat diet in Wistar rats. Biometals. 2013; 26 (3): 447-63.

12. Amer M.A., Elliot J.I. Influence of supplemental dietary copper and vitamine E on the oxidative stability of porcine depot fat. J Anim Sci. 1973; 37 (1): 87-90.

13. Krishnamoorthy L., Cotruvo J.A. Jr, Chan J., et al. Copper regulates cyclic-AMP-dependent lipolysis. Nat Chem Biol. 2016; 12 (4): 586-92.

14. Lutsenko S. Copper trafficking to the secretory pathway. Metallomics. 2016; 8 (9): 840-52.

15. Mazo V.K., Shirina L.I. Copper in nutrition man: absorption and bioavailability. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2005; 74 (2): 52-9. (in Russian)

16. Kozlowski H., Kolkowska P., Watly J., et al. General aspects of metal toxicity. Curr Med Chem. 2014; 21 (33): 3721-40.

17. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Romanico D.N., et al. Two-stage method for purification of ceruloplasmin based on its interaction with neomycin. Biokhimiya [Biochemistry]. 2012; 77 (6): 631-8. (in Russian)

18. Zatulovskaia Y.A., Ilyechova E.Y., Puchkova L.V. The features of copper metabolism in the rat liver during development. PLoS One. 2015; 10 (10): e0140797.

19. Tapryal N., Mukhopadhyay C., Das D., et al. Reactive oxygen species regulate ceruloplasmin by a novel mRNA decay mechanism involving its 3’-untranslated region: implications in neurodegenerative diseases. J Biol Chem. 2009; 284 (3): 1873-83.

20. Mazumder B., Sampath P., Fox P.L. Translational control of ceruloplasmin gene expression: beyond the IRE. Biol Res. 2006; 39 (1): 59-66.

21. Mostad E.J., Prohaska J.R. Glycosylphosphatidylinositol-linked ceruloplasmin is expressed in multiple rodent organs and is lower following dietary copper deficiency. Exp Biol Med. (Maywood). 2011; 236 (3): 298-308.

22. Puchkova L.V. The nutrition role of milk ceruloplasmin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (4): 4-17. (in Russian)