Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс

РезюмеВодные дисперсии наночастиц серебра вводили внутрижелудочно через зонд растущим крысам-самцам ежедневно на протяжении 28 дней. Изучали массу тела животных, относительную массу их внутренних органов, степень всасывания макромолекул белка в желудочно-кишечном тракте, показатель окислительного повреждения ДНК, уровень небелковых тиолов, состояние системы I и II фазы детоксикации ксенобиотиков, стабильность лизосомальных мембран печени, биохимические и гематологические показатели крови, состояние микробиоценоза слепой кишки. Получены данные, свидетельствующие о возможных токсических рисках, связанных с воздействием наночастиц серебра.

Ключевые слова:серебро, наночастицы, токсичность, крысы

Металлическое серебро (Ag) в форме наночастиц (НЧ- Ag) широко применяется в качестве компонента защитных антимикробных покрытий, а также при производстве различных средств для обеззараживания воды, упаковочных материалов, косметических препаратов, дезинфицирующих средств и других видов продукции [1], поскольку даже очень низкие концентрации НЧ-Ag способны уничтожать бактерии [10, 13, 14, 26]. Однако токсичность НЧ-Ag для высших животных и человека изучена недостаточно.

Несмотря на данные, подтверждающие в опытах in vitro повреждающее действие НЧ-Ag на клетки [12, 15, 16, 22, 25], токсичность Ag для лабораторных животных в опытах in vivo не выявлена [11, 17, 18, 24]. В частности, не установлено отрицательного воздействия НЧ-Ag и нами в опубликованной ранее работе [8]: 28-дневное внутрижелудочное введение крысам НЧ-Ag в суточной дозе до 0,1 мг/кг не вызывало никаких неблагоприятных эффектов. Более высокие дозы НЧ-Ag в указанной работе не охарактеризованы из-за присутствия в препарате стабилизирующей добавки - диоктилсульфосукцината натрия, которая сама обладает выраженной токсичностью.

Целью настоящего исследования было охарактеризовать воздействие на лабораторных животных более высоких доз НЧ-Ag (до 1 мг/кг/сут), стабилизированных нетоксичным водорастворимым полимером.

Материал и методы

В работе был использован препарат НЧ-Ag "Арговит", производимый ООО "НПЦ "ВекторВита" (Новосибирск, Россия), согласно ТУ 9310-13-00008064-00. Препарат представляет собой водную дисперсию НЧ-Ag, содержащую 1,0-1,4% (по массе Ag) и 18,6-19,0% стабилизатора - поливинилпирродидона (ПВП) с молекулярной массой 15-30 кД. Данный полимер малотоксичен для человека и высших животных и используется, в частности, как компонент кровезаменителей. Исследования проведены с помощью трансмиссионного электронного микроскопа "JEM-100 СХ" (фирма "Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. В составе используемой дисперсии были выявлены НЧ-Ag округлой, эллипсоидной или неправильной формы со средним диаметром 34,9±14,8 нм (рис. 1а, б). Минимальный размер указанных частиц составил 8,4, максимальный - 80,9 нм.

Эксперименты проведены в соответствии с [7] на 105 крысах-самцах Вистар с исходной массой 81±2 г. Крыс содержали группами по 3 животных в пластмассовых клетках и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом, приготовленном на основе казеина [5, 7]. Доступ к корму и питьевой воде для животных не ограничивали.

Животные были разделены на 7 групп по 15 крыс в каждой. Тестируемые материалы вводили крысам внутрижелудочно через зонд на протяжении 28 дней. Крысам 1-й (контрольной) группы вводили дистиллированную воду. Животные 2-й группы получали разведенный деионизованной водой препарат НЧ-Ag из расчета 0,1 мг Ag на 1кг массы тела в день (препарат, как указывалось выше, содержит стабилизатор ПВП). Животным 3-й опытной группы вводили 1,0 мг/кг/сут препарат НЧ-Ag, разведенный деионизированной водой и содержащий указанный выше ПВП. Крысы 4-й группы получали взвесь макроскопического Ag из расчета 0,1 мг/кг массы тела/день, извлеченного, согласно [3], из нитрата серебра ч.д.а, и дополнительно ПВП - 1,33 мг/кг в день. Крысам 5-й группы вводили дисперсию макроскопического Ag и дополнительно ПВП в количестве соответственно 1 и 13,3 мг/кг в день. Животные 6-й и 7-й групп получали только стабилизатор ПВП в количестве соответственно 1,33 и 13,3 мг/кг в день.

В ходе эксперимента у крыс всех групп еженедельно определяли прирост массы тела, взвешивая их на электронных весах с точностью ±0,5 г.

На 29-й день эксперимента крыс умерщвляли путем обескровливания (под легким эфирным наркозом), подвергали патолого-анатомическому вскрытию, на секции отбирали внутренние органы (печень, почки, селезенка, сердце, семенники, тимус, легкие), определяли их относительную массу (ОМ), в % от массы тела. В печени выявляли содержание цитохромов Р450 и b5, а также активность ряда ферментов I и II фазы детоксикации ксенобиотиков - этоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A1), метоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A2), пентоксирезоруфиндеалкилазы (CYP2B1), глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы; общую и неседиментируемую активность арилсульфатаз А и В, активность β-галактозидазы и β-глюкуронидазы, а также уровень восстановленного глутатиона (GSH). В крови с помощью стандартных гематологических методов изучали уровень гемоглобина (Hb), содержание эритроцитов, лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) и тромбоцитов. Одновременно с помощью биохимического анализатора "Konelab 20 I" фирмы "Thermo Scientific" (США) определяли биохимические показатели сыворотки крови (аланинаминотрансферазу - АЛТ; аспартатаминотрансферазу - АСТ; альбумин; общий белок; глюкозу; креатинин; мочевую кислоту; мочевину; щелочную фосфатазу). В печени выявляли апоптоз гепатоцитов, а также содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (8-oxo-dG - продукт окислительного повреждения ДНК). Кроме перечисленных показателей, определявшихся в крови и печени крыс, изучали также состояние микробиоценоза слепой кишки и иммуноферментным методом степень всасывания в тонкой кишке макромолекул белка, вводимого однократно перорально (2 г на 1 кг массы тела). У всех животных в плазме крови определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ)* и активности ферментов антиокислительной защиты в эритроцитах крыс (диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, глютатионпероксидазы, глютатионредуктаза, супероксиддисмутазы, каталазы) (соответственно по [2, 4, 19-21, 23, 27]. Для характеристики НЧ диоксида серебра в настоящей работе были использованы методы, которые применялись нами ранее для определения НЧ диоксида титана [5, 6, 9].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ SPSS 17.0 согласно критерию Манна-Уитни с определением средней арифметической (М), ее ошибки (m), индекса достоверности (р) и проведением факторного анализа с использованием теста ANOVA.

Рис. 1. а - Репрезентативная электронная микрофотография препарата НЧ-Ag. Электронный микроскоп "JEM-100CX" ("Jeol", Япония), ускоряющее напряжение 80 кВ; б - гистограмма распределения частиц по диаметру

Ось абсцисс - диаметр частиц, нм; ось ординат - число частиц в интервале ±10 нм.

Таблица 1. Относительная масса внутренних органов крыс на 29-й день опыта

Таблица 2. Cодержание цитохромов Р450 и b5 и активность ферментов I и II фазы метаболизма ксенобиотиков у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента абсолютная и относительная масса тела у животных во всех группах изменялась практически однотипно: небольшие различия в массе тела у крыс исследуемых групп были статистически недостоверны.

Проведенный анализ показал отсутствие влияния на прирост массы тела НЧ-Ag и Ag как химического элемента. У животных всех опытных групп, получавших НЧ-Ag, Ag (металлическое) и ПВП, относительная масса печени, сердца, семенников, тимуса и легких была такой же, как у контрольных животных (табл. 1). Причем ОМ этих внутренних органов была одинаковой независимо от того, что получали животные - НЧ-Ag, металлическое серебро или ПВП.

Однако ОМ почек животных 2-й группы, получавших НЧ-Ag, была достоверно ниже, чем у животных 6-й группы, получавших ПВП. При сравнении 3-й и 5-й групп подобного эффекта не наблюдалось. ОМ селезенки крыс 3-й группы была достоверно выше, чем в 5-й группе. Вместе с тем такой же эффект наблюдался и у крыс 7-й группы. Полученные данные указывают на отсутствие влияния НЧ-Ag на ОМ всех исследованных нами внутренних органов.

Как следует из рис. 2, степень всасывания в кровь макромолекул белка, введенного перорально, достоверно не отличается от таковой у животных обеих групп, получавших НЧ-Ag. Однако обращает на себя внимание тот факт, что всасывание белка (овальбумина - ОВА) в тонкой кишке у животных 3-й группы оказывается достоверно выше, чем у животных 5-й группы. Различия между животными 3-й группы, получавшими Ag, и животными 7-й группы, получавшими только ПВП, имели ту же направленность, хотя были недостоверны. Данный результат указывает на возможность неблагоприятного увеличения всасывания макромолекул Ag вследствие приема высокой дозы НЧ-Ag.

Результаты исследования показали, что у крыс 2-й и 3-й групп, получавших НЧ-Ag, содержание 8-оксо-2-дезоксигуанозина (маркер окислительного повреждения ДНК) практически такое же, как у контрольных животных и животных 4-й и 5-й групп, получавших Ag (металлический) и ПВП. Эти данные подтверждают, что используемые дозы препарата не вызывают усиления окислительного повреждения ДНК.

Таблица 3. Показатели системы антиоксидантной защиты у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Как следует из табл. 2, достоверных изменений в общем содержании цитохромов P-450 и b5 в печени животных 1-7-й групп не наблюдали. Активность CYP1A1 была максимальной у животных 2-й группы, причем различия с 4-й группой достоверны. Аналогичный эффект отмечен и для CYP1A2. Установлено, что единственным фактором, влияющим на данный показатель, является присутствие ПВП. Активность CYP2B1 во всех группа (за исключением 7-й) понижена по сравнению с показателем у контрольных животных. При этом наибольшим снижение было в 4-й, 5-й и 6-й группах. Фактором, достоверно влияющим на данный показатель, является введение ПВП. Что же касается животных, получавших НЧ-Ag, у них степень подавления активности CYP2B1 оказалась минимальной.

Активность глутатион-S-трансферазы у крыс всех опытных групп не отличалась от таковой в контрольной группе, но оказалась достоверно пониженной у животных 4-й группы. При этом у крыс, получавших НЧ-Ag, этот показатель в среднем имел наибольшие значения. Аналогичная картина наблюдалась и при определении активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы. Таким образом, не выявлено признаков, свидетельствующих о снижении в печени под действием высоких и низких доз НЧ-Ag функции системы детоксикации ксенобиотиков. Что касается ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков (изоформы CYP), то наблюдаемые эффекты связаны, скорее всего, не с действием НЧ-Ag, а с влиянием стабилизатора ПВП. В случае конъюгирующих ферментов II фазы метаболизма ксенобиотиков НЧ-Ag, по-видимому, не только не ослабляют защиту, но, возможно, приводят к ее определенной активации. Иными словами, негативного влияния НЧ-Ag на микросомальную систему детоксикации ксенобиотиков не выявлено.

Таблица 4. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Результаты определения неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз в печени крыс продемонстрировали отсутствие ее достоверных изменений у животных всех опытных групп по сравнению с контролем. Исключением была неседиментируемая активность β-глюкуронидазы, которая оказалась ниже у животных 2-й группы (5,08±0,49%), чем 6-й (5,98±0,32%). Таким образом, никаких признаков того, что введение животным препарата НЧ-Ag вызывает дестабилизацию лизосомальных мембран гепатоцитов, не обнаружено.

Содержание небелковых тиолов в печени у животных всех опытных групп было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии воздействия на указанные компоненты препарата НЧ-Ag, Ag (металлического) и ПВП (р>0,1). Таким образом, введение препарата НЧ-Ag существенно не влияет на уровень тиолов, характеризующий состояние окислительно-восстановительных процессов в печени.

Таблица 5. Содержание лейкоцитов (включая процент лимфоцитов и моноцитов) и тромбоцитов в периферической крови крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Изучение ПОЛ (табл. 3) показало, что содержание диеновых конъюгатов в плазме крови было несколько повышено у животных 2-й группы по сравнению с животными контрольной, а также 4-й и 6-й групп. Однако при более высокой дозе НЧ-Ag (3-я группа) этот эффект не проявлялся. При этом содержание малонового диальдегида в плазме крови крыс всех опытных групп было практически одинаково и не отличалось от такового в контроле. В то же время активность глутатионпероксидазы в крови животных всех опытных групп была достоверно повышена по сравнению с контролем. Активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы эритроцитов у животных всех опытных групп была практически одинаковой и не отличалась от таковой в контроле, что свидетельствует об отсутствии влияния используемых веществ. Активность каталазы эритроцитов у крыс 2-й группы была незначительно, но достоверно понижена по сравнению с показателем в 6-й группе. У животных 3-й и 7-й групп эта зависимость сменялась на противоположную. Полученные данные не позволяют судить о каком-либо однозначном и однонаправленном влиянии НЧ-Ag на состояние антиоксидантной защиты организма. Если выявляется действие НЧ-Ag, оно оказывается не дозозависимым и очень незначительным по величине (не выше 15% от контрольного уровня), поэтому нельзя говорить о каком-то негативном влиянии используемых доз НЧ-Ag на систему антиоксидантной защиты организма животных.

Как следует из табл. 4, концентрации общего белка, альбумина, мочевой кислоты, креатинина, активность АЛТ у крыс, получавших НЧ-Ag (2-я и 3-я группы), металлическое Ag (4-я и 5-я группы) или ПВП (6-я и 7-я группы), не претерпевала изменений по сравнению с таковой у контрольных животных. Однако активность АСТ оказывалась статистически достоверно повышенной у животных 7-й и особенно 3-й группы. Вместе с тем ее абсолютная величина была незначительной (24%) и оставалась в пределах колебаний, отмечаемых в контроле. В свою очередь уровень глюкозы в крови крыс, получавших НЧ-Ag, был ниже, чем в контроле, причем снижение зависело от дозы используемого препарата НЧ-Ag и для крыс 3-й группы было более статистически достоверным. В отличие от этого у животных, получавших металлическое Ag, концентрация глюкозы в крови не изменялась, а у получавших ПВП в высокой дозе возрастала, не выходя за пределы, характерные для контрольных животных. Таким образом, есть основание полагать, что введение крысам НЧ-Ag в высокой дозе может повлиять на состояние их углеводного обмена.

Таблица 6. Характеристика основных популяций нормального микробиоценоза слепой кишки крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Рис. 2. Всасывание в кровь овальбумина (ОВА) у крыс 1-7-й групп. Ось абсцисс - номера групп; ось ординат - количество белка в крови через 3 ч, % от скормленной дозы антигена Ч 103, M±m

Концентрация Hb в крови крыс 2-й и 3-й групп практически не отличается от таковой в контроле. Однако по сравнению с 5-й группой концентрация в 3-й группе была незначительно понижена (на 16%). Результаты оценки остальных гематологических показателей свидетельствуют о том, что общее количество эритроцитов, их средний объем, среднее содержание Hb в эритроцитах у животных 2-й и 3-й групп находились в пределах показателей в контроле и не отличались от подобных показателей животных 4-й и 5-й групп. Уровень гематокрита у животных 2-й группы был незначительно понижен по сравнению с таковым в 4-й группе. Средняя концентрация Hb в эритроцитах животных 3-7-й групп оказалась достоверно ниже, чем в контроле, а у животных 2-й группе не отличалась от него. Полученные данные однозначно указывают на то, что НЧ-Ag и металлическое Аg не оказывают негативное воздействие на концентрацию Hb в эритроцитах (р>0,1), а ее снижение скорее связано с действием ПВП (р<0,05).

Общее количество лейкоцитов во 2-й группе несколько понижено по сравнению с подобным показателем животных 6-й группой и не отличалось от показателей животных 4-й группы (табл. 5). Отсюда можно сделать вывод, что фактором, влияющим на уровень лейкоцитов в крови, является введение серебра, а не НЧ-Ag. По числу нейтрофилов животные 2-й и 3-й групп, получавшие НЧ-Ag, не отличались от контрольных крыс, получавших металлическое Аg и ПВП. Количество тромбоцитов было достоверно снижено (по сравнению с контролем) только у крыс 7-й группы, получавших большую дозу ПВП, что, несомненно, свидетельствует об отрицательном влиянии этого вещества на тромбоцитарный показатель периферической крови крыс. Иными словами, точных данных, свидетельствующих о влиянии НЧ-Ag на клеточные показатели периферической крови (количество лейкоцитов и тромбоцитов), не получено.

Исследование апоптоза гепатоцитов показало, что доля живых клеток у животных 3-й группы составила 93,16±0,48% и была достоверно (р<0,05) выше, чем при применении аналогичной дозы Ag в 5-й группе (91,54±0,46%). При этом относительное число клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза, было ниже у крыс 3-й и особенно 5-й группы (соответственно 5,99±0,39 и 7,51±0,44%). Различия остальных изученных показателей апоптоза (число клеток в позднем апоптозе, число всех клеток, находящихся в стадии апоптоза, а также число мертвых клеток) между всеми группами животных не выявлены. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у крыс влияния НЧ-Ag, металлического Ag, а также ПВП на процессы апоптоза гепатоцитов.

Поскольку НЧ-Ag, как известно, в опытах in vitro обладают выраженной антимикробной активностью [1], было интересно изучить их возможное влияние на состояние кишечного микробиоценоза in vivo. Как следует из данных, представленных в табл. 6, численность бифидобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших НЧ-Ag (2-я и 3-я группы), дозозависимо снижается по сравнению как с контролем, так и с данным показателем у животных 4-й и 5-й групп. Проведенный анализ показал, что НЧ-Ag достоверно влияют на этот показатель. Несмотря на явное угнетение численности бифидофлоры под действием НЧ-Ag, ее кислотообразующая антагонистическая активность остается без видимых изменений. Отчетливый ингибирующий эффект НЧ-Ag выявлен в отношении популяций лактобацилл, стрептококков и стафилококков. На общее количество аэробных и анаэробных микроорганизмов НЧ-Ag не оказывали специфического воздействия. Влияние НЧ-Ag на популяцию энтерококков было немонотонным и отличалось некоторой стимуляцией роста этих микроорганизмов при низкой концентрации и полным отсутствием эффекта при большой.

Изучение транзиторных популяций кишечной микрофлоры крыс показало, что численность таких их представителей, как цитратассимилирующие энтеробактерии, St. aureus, дрожжи и плесени, не претерпевает тех изменений, которые можно соотнести с эффектом действия НЧ-Ag, особенно в малой дозе (животные 2-й группы). Вместе с тем введение крысам НЧ-Ag в высокой дозе (3-я группа) вызывает уменьшение содержания гемолитических стрептококков и клостридий, по сравнению с таковым у животных, получавших металлическое Ag и ПВП. Таким образом, воздействие НЧ-Ag в высокой дозе на кишечный микробиоценоз состоит в ингибиции как полезной симбиотической микрофлоры, так и, возможно, некоторых популяций условно-патогенных микроорганизмов.

В заключение следует отметить, что полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния НЧ-Ag, которое проявляется лишь при высокой дозе (1 мг/кг/в день) указанного препарата. При этом изменяются только отдельные показатели состояния организма животных. При низких дозах НЧ-Ag (0,1 мг/кг/в день) упомянутые эффекты отсутствуют либо являются статистически недостоверными. Настоящая работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы".

Литература

1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 13-20.

2. Гаврилов В.Б. // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 35-55.

3. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. - М.: Химия. - 1974. - 407 с.

4. Мальцев Г .Ю., Т ышко Н .В. // Гиг. и сан. - 2002. - № 2. - С. 69-72.

5. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

6. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

7. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. МУ 1.2.2520-09.

8. Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Кравченко Л.В. и др. Труды 3-го съезда токсикологов России. - 2008, апр. - С. 327-329.

9. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

10. Amin R.M., Mohamed M.B., Ramadan M.A. et al. // Nanomed. - 2009. - Vol. 4, N 6. - P. 637-643.

11. Bhol K.C., Schechter P.J. // Dig. Dis. Sci. - 2007. - Vol. 52, N 10. - P. 2732-2742.

12. Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J.J. et al. // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88, N 2. - P. 412-419.

13. Choi O., Hu Z. // Environ. Sci. Technol. - 2008. - Vol. 42, N 12. - P. 4 5 8 3 - 4 5 8 8 .

14. Dror-Ehre A., Mamane H., Belenkova T. et al. // J. Colloid Interface Sci. - 2009. - Vol. 339, N 2. - P. 521-526.

15. Hsin Y.H., Chen C.F., Huang S. et al. // Toxicol. Lett. - 2008. - Vol. 179, N 3. - P. 130-139.

16. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2005. - Vol. 9, N 7. - P. 975-983.

17. Ji J.H., Jung J.H., Kim S.S. et al. // Inhal. Toxicol. - 2007. - Vol. 19, N 10. - P. 857-871.

18. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S. et al. // Inhal. Toxicol. - 2008. - Vol. 20, N 6. - P. 575-583.

19. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. // Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23, N 3. - P. 302-311.

20. Mille G. // Biol. Chem. - 1959. - N 244. - P. 502-506.

21. Niashikimi M., Rao N.A., Jagi K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1972. - N 46. - P. 849-854.

22. Park S., Lee Y.K., Jung M. et al. // Inhal. Toxicol. - 2007. - Vol. 19, suppl. 1. - P. 59-65.

23. Placer Z. // Nahrung. - 1968. - N 12. - P. 679.

24. Sawosz E., Binek M., Grodzik M. et al. // Arch. Anim. Nutr. - 2007. - Vol. 61, N 6. - P. 444-451.

25. Shin S.H., Ye M.K., Kim H.S. et. al. // Int. Immunopharmacol. - 2007. - Vol. 7, N 13. - P. 1813-1818.

26. Su H.L., Chou C.C., Hung D.J. et al. // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30, N 30. - P. 5979-5987.

27. Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S. // Nutr. - 1971. - N 101. - P. 14 5 9 .