Влияние кверцетина на морфологические изменения при неалкогольнои жировом болезни печени у крыс на рационе с повышенным содержанием фруктозы

Резюме

Цель исследования - изучение влияния полифенола кверцетина на морфологические изменения у крыс при неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), вызванной высокофруктозным рационом.

Материал и методы. В течение эксперимента длительностью 20 нед крысы (8 животных в каждой группе) 1-й группы получали стандартный полусинтетический рацион и воду; 2-й группы - стандартный рацион и 20% раствор фруктозы вместо воды; 3-й группы - стандартный рацион с добавлением кверцетина (0,1% от рациона) и 20% раствор фруктозы. Фиксированные формалином и обработанные парафином образцы печени были микротомированы, окрашены (гематоксилином и эозином, по Ван Газону), оценены с использованием шкал SAFи NAS.

Результаты и обсуждение. Гистологическая оценка не выявила патологии в структуре печени крыс 1-й группы (S0A0F0; NAS - 0, фиброз - 0). В печени крыс 2-й группы были обнаружены мелко-, средне- и крупнокапельный стеатоз, воспаление без баллонной дистрофии гепатоцитов, перицеллюлярный и пери-портальный фиброз (S2A1F2; NAS - 3, фиброз - 2). У получавших кверцетин крыс 3-й группы в печени было выявлено существенное уменьшение стеатоза без выраженных изменений в показателях воспаления и фиброза (S1A1F2; NAS - 2, фиброз - 2) по сравнению с крысами 2-й группы.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о способности кверцетина препятствовать развитию НАЖБП у крыс, получавших рацион с повышенным содержанием фруктозы, за счет снижения выраженности гепатостеатоза.

Ключевые слова:неалкогольная жировая болезнь печени, гепатостеатоз, фруктоза, полифенолы, кверцетин

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 16-21. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10062.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) - хроническое заболевание, объединяющее спектр морфологических изменений в печени (стеатоз, стеато-гепатит, фиброз, цирроз) у лиц, не употребляющих в чрезмерном количестве алкоголь (≤140 и ≤210 мл этанола в неделю для женщин и мужчин соответственно). Распространенность НАЖБП (диагностирована у 37% пациентов амбулаторно-поликлинической практики) является одной из наиболее высоких среди хронических заболеваний печени в России и имеет выраженную тенденцию к росту [1]. Нарушение питания относят к числу основных причин НАЖБП. При этом особую роль отводят повышению содержания в рационе фруктозы, что может приводить к активации de novo липогенеза и гепатостеатозу [2, 3]. Наиболее точным методом диагностики НАЖБП и определения тяжести заболевания является гистологическое исследование печени [1]. Для описания морфологических изменений в печени пациентов при НАЖБП предложены 2 оценочные шкалы: SAF (S - steatosis; A - activity; F - fibrosis) [5] и NAS (NAFLD Activity Score) [6], характеризующие выраженность стеатоза, фиброза, внутридолькового (лобулярного) воспаления и баллонной дистрофии гепатоцитов.

В настоящее время в качестве перспективных средств профилактики и лечения заболеваний печени рассматривают биологически активные вещества растительного происхождения [7, 8]. Среди полифенольных соединений пищи к числу наиболее распространенных относится кверцетин (3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон), основными источниками которого в рационе человека являются черный и зеленый чай, яблоки и репчатый лук. Совокупное поступление полифенола с рационом в среднем не превышает 40 мг/сут [9]. Анализ данных литературы свидетельствует о способности кверцетина оказывать гепатопротекторное действие. В условиях in vitro было показано снижение под действием кверцетина de novo липогенеза в клетках печени [10-12], в экспериментах in vivo установлено влияние кверцетина на метаболические процессы, окислительный стресс и воспалительный процесс [13-18], а также на развитие фиброза печени [4, 14]. Наряду с этим эффективность кверцетина в отношении НАЖБП остается малоизученной.

Цель данного исследования - изучение влияния кверцетина на морфологические изменения при НАЖБП, вызванной содержанием крыс на высокофруктозном рационе.

Материал и методы

Исследование проводили на 3 группах крыс-самцов линии Wistar (8 животных в каждой группе), полученных из питомника филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России. Исходная масса тела крыс составляла 135-165 г и статистически значимо не различалась между группами животных. В работе с крысами придерживались разработанных Советом международных научных медицинских организаций рекомендаций "Международные руководящие принципы биомедицинских исследований на животных" (2012 г.) и приказа Минздрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики".

В работе использовали полусинтетический рацион на основе казеина (20%) с содержание жира 10% [19]. Для моделирования НАЖБП питьевую воду заменяли на 20% раствор фруктозы [3]. В течение 20 нед крысы 1-й (контрольной) группы получали полусинтетический рацион и воду, животные 2-й группы - полусинтетический рацион и 20% раствор фруктозы вместо воды, а 3-й группы - полусинтетический рацион с добавкой кверцетина (Q4951, Sigma-Aldrich, США) в количестве 0,1% от рациона и 20% раствор фруктозы. Расчетное среднесуточное поступление кверцетина составило 34 мг на 1 кг массы тела, что было сопоставимо с дозами, применяемыми в модельных экспериментах на животных [12, 20]. Корм, воду и 20% раствор фруктозы давали ad libitum, ежедневно отмечая величину их потребления. Животных декапитировали под эфирным наркозом с предварительным (за 16 ч) лишением корма и питья.

Для гистологического исследования отбирали фрагмент левой боковой доли печени, который после фиксации формалином, обработки парафином и микротомирования, окрашивали гематоксилином и эозином (для обзорного осмотра), а также по Ван Гизону (для определения соединительной ткани). Осмотр гистологических препаратов проводили при увеличении х50, х100 и х200. Оценку проводили по 10 полям зрения каждого препарата. В целях стандартизации методических подходов и с учетом общности биохимических процессов и морфологических нарушений при НАЖБП у разных видов млекопитающих при описании структурных изменений в печени подопытных животных были использованы полуколичественные оценочные шкалы SAF и NAS. Дифференцировку стеатоза от баллонной дистрофии гепатоцитов проводили по характерным морфологическим признакам: при жировой дистрофии - по наличию единичных вакуолей круглой формы при сохранной структуре цитоплазмы в интактных участках и смещению ядра на периферию клетки; при баллонной дистрофии - по наличию нескольких вакуолей овальной формы и положению ядра в центре клетки.

Для установления статистически значимых различий (р<0,05) между группами животных использовали программное обеспечение Prism (GraphPad, США) с применением теста Краскела-Уоллиса и в качестве вторичного ретроспективного анализа - критерия множественного сравнения Данна.

Результаты и обсуждение

Включение фруктозы в рацион крыс 2-й и 3-й групп приводило к снижению потребления ими корма (на 80 и 83% соответственно) относительно контроля (рис. 1). Однако при этом за счет употребления раствора фруктозы среднесуточная калорийность их рациона была выше, чем в контрольной группе (на 52 и 50% соответственно). У крыс, получавших фруктозу, было отмечено увеличение конечной массы тела (на 12% - во 2-й группе и на 13% - в 3-й) и относительной массы печени (на 15 и 13% соответственно) по сравнению с контролем (рис. 2).

В результате проведенных исследований были отмечены выраженные межгрупповые отличия в структуре изученных участков печени, при этом внутри одной группы животных гистологическая картина значимо не различалась (рис. 3).

В печени крыс 1-й группы во всех полях зрения не наблюдали отклонений от нормальной структуры печени: не обнаружено признаков стеатоза (липидные включения содержали <5% гепатоцитов), лобулярного воспаления и баллонной дистрофии гепатоцитов, а также фиброза. На основании оценки полученных данных был сделан вывод об отсутствии в печени крыс 1-й группы гистологических признаков НАЖБП: S0A0F0; NAS - 0 и фиброз - 0.

По сравнению с животными 1-й группы, получавшими воду в качестве питья, у крыс 2-й группы, получавших 20% раствор фруктозы, во всех полях зрения структура печени имела выраженные изменения: от 34 до 66% гепатоцитов содержали мелко-, средне- и крупнокапельные жировые включения; отмечалась умеренная (менее 2 фокусов воспаления в пределах 1 дольки) воспалительная инфильтрация лимфоплазмоцитарными элементами портальных трактов при отсутствии баллонной дистрофии гепатоци-тов; выявлено разрастание соединительной ткани в пространстве Диссе (в зоне 3 печеночного ацинуса) около отдельных гепатоцитов (перицеллюлярный фиброз), а также около портальных трактов (перипортальный фиброз). Полученные данные свидетельствовали о наличии в печени крыс 2-й группы гистологических признаков НАЖБП: S2A1F2; NAS - 3, фиброз - 2.

В печени крыс 3-й группы, рацион которых содержал кверцетин, во всех полях зрения было отмечено существенное снижение выраженности стеатоза по сравнению с крысами 2-й группы: жировые включения были выявлены в меньшем количестве гепатоцитов (от 5 до 33%) и представлены только мелкокапельными включениями. При этом не установлено значимого влияния кверцетина на показатели воспаления, баллонной дистрофии гепатоцитов или фиброза. Степень НАЖБП у крыс 3-й группы соответствовала S1A1F2; NAS - 2, фиброз - 2.

Полученные результаты подтверждают способность фруктозы приводить к развитию НАЖБП, особенно гепатостеатоза, который может быть обусловлен стимулированием de novo липогенеза, ингибированием р-окисления жирных кислот и нарушением выведения липидов из печени [11, 12, 18].

В нашем исследовании впервые, исходя из анализа научных работ, представленных в базе данных PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), было показано, что включение кверцетина в состав рациона крыс, получавших вместо воды 20% раствор фруктозы, препятствует развитию НАЖБП за счет уменьшения выраженности стеатоза. Механизм действия кверцетина при этом мог быть связан с ингибирующим влиянием данного полифенола на ферменты de novo липогенеза, в том числе опосредованном транскрипционными факторами SREBP-1c и ChREBP, а также индуцирующим действием полифенола на транскрипционный фактор PPARa, стимулирующий β-окисление жирных кислот [11, 16]. Сходные результаты были получены в работе при использовании высокожирового рациона: кверцетин препятствовал развитию гепатостеатоза вследствие модулирующего действия на экспрессию генов липидного обмена [21]. Наряду с этим, в отличие от работы Marcolin и соавт. [10], в настоящем исследовании не установлено влияния кверцетина на выраженность баллонной дистрофии и воспаления, что может быть связано с различиями в условиях проведения экспериментов (в том числе использовании разных моделей НАЖБП и видов животных).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности кверцетина препятствовать развитию НАЖБП у крыс, получавших рацион с повышенным содержанием фруктозы, за счет снижения выраженности гепатостеатоза.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории энзимологии питания ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" ГВ. Гусевой и И.В. Аксенову за предоставленный для исследования гистологический материал и содействие в подготовке статьи к опубликованию.

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 20132020 гг. (тема № 0529-2014-0051).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература

1. Лазебник Л.Б., Радченко В.Г., Голованова Е.В., Звенигородская Л.А. и др. Неалкогольная жировая болезнь печени: клиника, диагностика, лечение (рекомендации для терапевтов, 2-я версия) // Терапия. 2017. Т. 3, № 13. С. 6-23.

2. Lim J.S., Mietus-Snyder M., Valente A., Schwarz J.M. et al. The role of fructose in the pathogenesis of NAFLD and the metabolic syndrome // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010. Vol. 7. P. 251-264.

3. Mamikutty N., Thent Z.C., Sapri S.R., Sahruddin N.N. et al. The establishment of metabolic syndrome model by induction of fructose drinking water in male Wistar rats // BioMed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. Article ID 263897. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/263897.

4. Kanter M. Protective effect of quercetin on liver damage induced by biliary obstruction in rats // J. Mol. Histol. 2010. Vol. 41. P. 395-402.

5. Bedossa P. FLIP Pathology Consortium. Utility and appropriateness of the fatty liver inhibition of progression (FLIP) algorithm and steatosis, activity, and fibrosis (SAF) score in the evaluation of biopsies of nonalcoholic fatty liver disease // Hepatology. 2014. Vol. 60. P. 565-575.

6. Kleiner D.E., Brunt E.M., Van Natta M., Behling C. et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease // Hepatology. 2005. Vol. 41. P. 1313-1321.

7. Van De Wier B., Koek G.H., Bast A., Haenen G.R. The potential of flavonoids in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2017. Vol. 57. P. 834-855.

8. Wu L., Yan M., Jiang J., He B. et al. Pure total flavonoids from citrus improve non-alcoholic fatty liver disease by regulating TLR/CCL signaling pathway: a preliminary high-throughput "omics" study // Biomed. Pharmacother. 2017. Vol. 93. P. 316-326.

9. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. Флаванолы и флавоны: распространенность, пищевые источники, потребление // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 1. С. 4-22.

10. Marcolin E., Forgiarini L.F., Rodrigues G., Tieppo J. et al. Quercetin decreases liver damage in mice with non-alcoholic steatohepatitis // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2013. Vol. 112. P. 385-391.

11. Gnoni G.V., Paglialonga G., Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat-liver cells // Eur. J. Clin. Invest. 2009. Vol. 39. P. 761-768.

12. Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I. et al. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes // Phytother. Res. 2013. Vol. 27. P. 139-143.

13. Балакина А.С., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Влияние куркумина и кверцетина на показатели защитного потенциала крыс при их раздельном и совместном действии // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 2. С. 14-22.

14. Pavanato A., Tunon M. J., Sanchez-Campos S., Marroni C.A. et al. Effects of quercetin on liver damage in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis // Dig. Dis. Sci. 2003. Vol. 48. P. 824-829.

15. Enos R.T., Vel6zquez K.T., Carson M.S., McClellan J.L. et al. A low dose of dietary quercetin fails to protect against the development of an obese phenotype in mice // PLoS One. 2016. Vol. 11. Article ID e0167979.

16. Formica J.V., Regelson W. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids // Food Chem. Toxicol. 1995. Vol. 33. Article ID 10611080.

17. Kobori M., Masumoto S., Akimoto Y., Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a Western-style diet in C57/BL6J mice // Mol. Nutr. Food Res. 2011. Vol. 55. P. 530-540.

18. Miltonprabu S., Tomczyk M., Skalicka-Wozniak K., Rastrelli L. et al. Hepatoprotective effect of quercetin: From chemistry to medicine // Food Chem. Toxicol. 2017. Vol. 108. P 365-374.

19. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

20. Yamamoto Y., Oue E. Antihypertensive effect of quercetin in rats fed with a high-fat high-sucrose diet // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. Vol. 70. P. 933-939.

21. Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I. et al. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes // Phytother. Res. 2013. Vol. 27. P. 139-143.

References

1. Lazebnik L.B., Radchenko V.G., Golovanova E.V., Zvenigorodskaya L.A., et al. Nonalcoholic fatty liver disease: clinic, diagnostics, treatment (guidelines for the specialists on internal medicine, 2nd version). Terapiya [Therapy]. 2017; (3): 6-23. (in Russian)

2. Lim J.S., Mietus-Snyder M., Valente A., Schwarz J.M., et al. The role of fructose in the pathogenesis of NAFLD and the metabolic syndrome. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2010; 7: 251-64.

3. Mamikutty N., Thent Z.C., Sapri S.R., Sahruddin N.N., et al. The establishment of metabolic syndrome model by induction of fructose drinking water in male Wistar rats. BioMed Res Int. 2014; 2014: 263897. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/263897.

4. Kanter M. Protective effect of quercetin on liver damage induced by biliary obstruction in rats. J Mol Histol. 2010; 41: 395-402.

5. Bedossa P. FLIP Pathology Consortium. Utility and appropriateness of the fatty liver inhibition of progression (FLIP) algorithm and steatosis, activity, and fibrosis (SAF) score in the evaluation of biopsies of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2014; 60: 565-75.

6. Kleiner D.E., Brunt E.M., Van Natta M., Behling C., et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005; 41: 1313-21.

7. Van De Wier B., Koek G.H., Bast A., Haenen G.R. The potential of flavonoids in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Crit Rev Food Sci Nutr. 2017; 57: 834-55.

8. Wu L., Yan M., Jiang J., He B., et al. Pure total flavonoids from citrus improve non-alcoholic fatty liver disease by regulating TLR/CCL signaling pathway: a preliminary high-throughput "omics" study. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 316-26.

9. Tutelyan V.A., Lashneva N.V. Biologically active substances of plant origin. Flavonols and flavones: prevalence, dietary sourses and consumption. Voprosy pitaniia [Problem of Nutrition]. 2013; 82 (1): 4-22. (in Russian)

10. Marcolin E., Forgiarini L.F., Rodrigues G., Tieppo J., et al. Quercetin decreases liver damage in mice with non-alcoholic steatohepatitis. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2013; 112: 385-91.

11. Gnoni G.V., Paglialonga G., Siculella L. Quercetin inhibits fatty acid and triacylglycerol synthesis in rat-liver cells. Eur J Clin Invest. 2009; 39: 761-8.

12. Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I., et al. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes. Phytother Res. 2013; 27: 139-43.

13. BalakinaA.S., Aksenov I.V., Trusov N.V., Guseva G.V., et al. The influence of separate and combined supplementation with curcumin and quercetin on the protective capacity in rats. Voprosy pitaniia [Problem of Nutrition]. 2017. 86 (2): 14-22. (in Russian)

14. Pavanato A., Tunon M. J., Sanchez-Campos S., Marroni C.A., et al. Effects of quercetin on liver damage in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis. Dig Dis Sci. 2003; 48: 824-9.

15. Enos R.T., Velбzquez K.T., Carson M.S., McClellan J.L., et al. A low dose of dietary quercetin fails to protect against the development of an obese phenotype in mice. PLoS One. 2016; 11: e0167979.

16. Formica J.V., Regelson W. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids. Food Chem Toxicol. 1995; 33: 10611080.

17. Kobori M., Masumoto S., Akimoto Y., Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a Western-style diet in C57/BL6J mice. Mol Nutr Food Res. 2011; 55: 530-540.

18. Miltonprabu S., Tomczyk M., Skalicka-Wozniak K., Rastrelli L., et al. Hepatoprotective effect of quercetin: From chemistry to medicine. Food Chem Toxicol. 2017; 108: 365-74.

19. Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Pashorina V.A., Selyaskin K.E., et al. A comparative assessment of the diet influence on growth and development of rats. Voprosy pitaniia [Problem of Nutrition]. 2011; 80 (5): 30-8. (In Russian)

20. Yamamoto Y., Oue E. Antihypertensive effect of quercetin in rats fed with a high-fat high-sucrose diet. Biosci Biotechnol Biochem. 2006; 70: 933-9.

21. Jung C.H., Cho I., Ahn J., Jeon T.I., et al. Quercetin reduces high-fat diet-induced fat accumulation in the liver by regulating lipid metabolism genes. Phytother Res. 2013; 27: 139-43.