Взаимосвязь изменений показателей перекисного окисления липидов, коэнзима Q10 и свободных жирных кислот у крыс под влиянием жирового компонента рациона

РезюмеВ сыворотке крови и в печени крови крыс 1, 3, 6, 9 и 12-месячного возраста исследованы онтогенетические особенности взаимоотношений между концентрацией КоQ10, интенсивностью процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), индекса перекисного окисления (ИПО), спектра, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) ω-3 и ω-6, насыщенных жирных кислот. В сыворотке крови выявлена выраженная обратная зависимость между концентрацией КоQ10 и интенсивностью процессов ПОЛ в период от 3 до 6 мес жизни животных, получавших пальмовое и льняное масла. В печени животных всех групп также установлена прямая взаимосвязь между содержание ТБК-активных продуктов и величиной ИПО, который характеризует способность жирных кислот к образованию перекисей. Это может быть использовано для оценки потенциальных субстратов ПОЛ как при проведении экспериментальных исследований, так и создании жировых композиций с заданным составом жирных кислот.

Ключевые слова:pыбий жир, пальмовое и льняное масло, коэнзим Q10, крысы 1, 3, 6, 9 и 12- месячного возраста

Состояние здоровья человека тесно взаимосвязано с характером питания, в частности с жировой составляющей его рациона. В исследованиях последних лет была установлена терапевтическая эффективность включения в диету больных, страдающих поражением сердечно-сосудистой системы, сахарным диабетом типа 2, гиперхолестеринемией, аллергическими, кожными и другими заболеваниями, жировых продуктов, богатых полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) [8, 15, 16]. В настоящее время, кроме традиционных для нашей страны растительных масел, используемых в питании (подсолнечное, соевое, кукурузное), все чаще стали применяться масла тропического происхождения - пальмовое, кокосовое, которые содержат 50% насыщенных жирных кислот (ЖК). На долю ПНЖК в этих маслах приходится не более 10% от суммы ЖК.

Поступление в организм (в составе пищи или специальных препаратов) ПНЖК, включающихся в липиды тканей и мембран, увеличивает в них содержание потенциальных субстратов перекисного окисления липидов (ПОЛ). В экспериментальных исследованиях установлена возможность индукции ПОЛ в результате такого рода изменений в составе липидов тканей [11, 12, 14, 17]. Существенное значение в этих условиях имеет адекватная обеспеченность организма антиоксидантами.

Одним из самых активных антиоксидантов является коэнзим (КоQ10). Специфика его действия заключается в том, что он уничтожает свободные радикалы внутри клетки. В отличие от других антиоксидантов (витамины Е, А, β-каротин), которые, выполнив свою функцию, теряют активность, КоQ10 способен регенерироваться в организме [3].

Свободные ЖК, являющиеся необходимым компонентом в пище человека, участвуют в образовании биологически активных веществ. Высшие ЖК участвуют непосредственно в построении липопротеидов плазмы крови, и в составе последних (как транспортной формы ЖК) доставляются в органы-мишени, в которых ЖК служат или источником энергии (сердечная и поперечно-полосатая мускулатура), или предшественниками синтеза тканевых триглицеридов с последующим отложением в клетках органов. Профиль и количество свободных ЖК в сыворотке крови меняются в зависимости от возраста, режима питания, изменения гормонального статуса [9].

Целями данного исследования были оценка влияния различного по составу ЖК жирового компонента рациона на фоне дополнительного потребления КоQ10 на показатели ПОЛ в сыворотке крови и печени крыс, а также анализ влияния в онтогенезе вышеуказанных факторов на содержание свободных ЖК в сыворотке крови животных.

Материал и методы

Исследования были выполнены на растущих крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 90-110 г. Животных содержали на стандартном полусинтетическом рационе, в состав которого входили казеин (источник белка), крахмал маисовый (источник углеводов), жир в количестве (по калорийности) соответственно 23,52 и 23%, а также пшеничные отруби (в качестве пищевых волокон) и солевая смесь, содержащая необходимые минеральные компоненты.

В зависимости от вида жира, используемого в рационе, были сформированы 4 группы животных. Крысы 1-й группы, контрольной, получали в качестве жирового компонента рациона подсолнечное масло : лярд в соотношении 1:1 крысы 2-й группы - пальмовое масло, 3-й - рыбий жир, 4-й - льняное масло. Дополнительно крысы всех групп получали КоQ10 из расчета 100 мг/кг массы тела. Животные получали необходимые водо- и жирорастворимые витамины, добавляемые в физиологических нормах в рацион каждой группы. Кормление крыс осуществляли вволю со свободным доступом к воде.

Продолжительность эксперимента составляла 1, 3, 6 и 12 мес. По завершении указанных сроков опыта животных после легкого эфирного наркоза умерщвляли путем декапитации, подвергали патолого-анатомическому вскрытию и забирали печень и кровь. Собранную кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об./мин, отбирали сыворотку и хранили при температуре -20 °С. Гомогенат печени (10% концентрации) готовили на 0,9% растворе NaCl. Определяли содержание свободных ЖК в сыворотке крови [5]. Состав ЖК, используемого в рационах жирового компонента, а также ЖК печени исследовали методом газо-жидкостной хроматографии после предварительной экстракции и получения метиловых эфиров жирных кислот для проведения анализа [6]. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и ТБК-активных продуктов в сыворотке крови [1, 4] и печени животных [13]. Концентрацию КоQ10 в сыворотке крови определяли с помощью ВЭЖХ системы "Agilent 1100" со спектрофотометрическим детектором на аналитической колонке "Lunа C18" 150 Ч 4,6 (Phenomenex, США) в изократическом режиме элюирования [7], детектирование проводили при λ=275 нм. Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методом параметрической статистики с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Анализ состава ЖК жирового компонента используемых рационов свидетельствует о значительном различии в них содержания ПНЖК семейств ω-6 и ω-3. В табл. 1 представлено суммарное содержание в рационах животных ПНЖК, их соотношение и индекс, характеризующий способность ЖК к образованию перекисей (ИПО), рассчитанный согласно [10]. В рационе контрольных животных преобладали ЖК семейства ω-6, а соотношение ПНЖК было наивысшим (164). В рационе с рыбьим жиром (3-я группа) соотношение ПНЖК ω-6/ω-3 было наименьшим (0,08) за счет преимущественного содержания в рационе ЖК семейства ω-3. Самым высоким ИПО был в рационе с рыбьим жиром (148), в 15 раз превышая показатель в рационе с пальмовым маслом.

Таблица 1. Содержание полиненасыщенных жирных кислот различных семейств и индекс перекисного окисления в рационах крыс

Взаимосвязь влияния КоQ10 на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови животных продемонстрирована на рисунке, где представлена динамика изменений содержания продуктов ПОЛ и КоQ10 в сыворотке крови в зависимости от продолжительности эксперимента. У 3-месячных крыс всех групп отмечено наивысшее содержание КоQ10 и наименьшее - продуктов ПОЛ (ДК и ТБК-активных).

Известно, что старение сопровождается снижением концентрации КоQ10 в миокарде. Показано, что к 20 годам этот показатель достигает максимума, к 40 годам понижается на 30%, а к 60 годам - на 50% [2]. Таким образом, при максимальном уровне КоQ10 в 3-месячном возрасте наиболее ярко проявляются его антиоксидантные свойства у животных всех групп независимо от источника жира в рационе. Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) - было наивысшим у 1-месячных крыс, особенно в группах, содержащихся на рыбьем жире и льняном масле (соответственно 3,19±0,09 и 3,12±0,07). Однако у 3-месячных крыс всех групп этот показатель был практически одинаковым.

При увеличении срока пребывания животных на изучаемых рационах до 6 и 12 мес содержание ДК в сыворотке крови и печени повышалось у крыс во всех группах, причем наименьшим оно было у животных 3-й и 4-й групп. Следует отметить, что в рационах крыс этих групп жировой компонент обладает большей ненасыщенностью (ИПО - 148 и 126 соответственно), и именно у этих животных содержание ДК в сыворотке крови было наименьшим, особенно у крыс 4-й группы (1,49±0,04; в контроле - 2,18±0,06). Очевидно, это связано с наибольшим содержанием КоQ10 в сыворотке крови крыс данной группы. Содержание вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-активных) в сыворотке крови 1-месячных животных было наименьшим у крыс 2-й и 4-й групп. У 3-месячных животных всех групп этот показатель уменьшался, а концентрации КоQ10 в сыворотке крови была, напротив, максимальной. К 6 и 12 мес содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке крови крыс различных групп было практически одинаковым; исключение составляли животные контрольной группы, у которых содержание ТБК-активных продуктов было наивысшим (в 6 мес - 10,70±0,12 нмоль МДА/мл, в 12 мес - 11,66±0,15 нмоль МДА/мл) на фоне высокого содержания в рационе ПНЖК семейства ω-6.

В табл. 2 представлены данные о содержании ПНЖК ω-3 в печени животных и содержании ТБК-активных продуктов в зависимости от продолжительности опыта. Видно, что содержание ПНЖК семейства ω-3, как и ИПО, у животных 3-й и 4-й групп были наибольшими в сроке 3 мес. С увеличением срока пребывания животных на экспериментальных рационах до 6 мес оно уменьшалось примерно вдвое (у животных 3-й группы - с 26,1 до 11,0%, 4-й группы - с 23,4 до 14,8%), что свидетельствует об усиленном метаболизме этих кислот. В то же время в эти сроки исследования содержание ПНЖК ω-6 в печени животных этих групп практически не изменялось. К 12-месячному пребыванию крыс на используемых нами рационах (табл. 3) содержание ПНЖК ω-3 в печени изменилось незначительно по сравнению с 6 мес, а семейства ω-6 - возросло.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и коэнзима Q10 в сыворотке крови крыс на различных рационах в зависимости от продолжительности эксперимента КоQ10, мкг/мл ТБК-акт. продукты, нмоль МДА/мл ДК, усл. ед/мл

ИПО и содержание ТБК-активных продуктов в печени 3-месячных животных были наивысшими (соответственно 144 и 314,74 нмоль МДА/г ткани) при содержании на рыбьем жире. Увеличение срока эксперимента до 6 мес приводило к уменьшению содержания в печени животных ТБК-активных продуктов во всех группах крыс что, очевидно, напрямую связано с ИПО в органе, т.е. понижением потенциальных субстратов ПОЛ. Иными словами, более длительное пребывание животных на рационах с различными источниками жира нивелировало содержание продуктов ПОЛ в печени, что может быть связано с влиянием КоQ10, проявляющего свои антиоксидантные свойства и тормозящего в организме процессы ПОЛ.

В табл. 4 представлены данные о содержании свободных ЖК в сыворотке крови животных. Видно, что у 3-месячных животных 3-й и 4-й групп отмечено увеличение содержания свободных ЖК по сравнению с контролем, причем эти показатели были наивысшими за период всего эксперимента. Увеличение у крыс пула плазменных свободных ЖК в 3-месячном возрасте напрямую связано с самым высоким за весь период наблюдения содержанием в печени ПНЖК семейства ω-3 (см. табл. 2). Увеличенное содержание в печени ЖК этого семейств, очевидно, способствует компенсаторному синтезу эндогенных ЖК, а также поддержанию в печени необходимого уровня ПНЖК семейства ω-6. С увеличением времени пребывания на рационах содержание свободных ЖК уменьшается; достоверных различий между группами не отмечено.

Полученные данные свидетельствуют о том, что включение в состав используемых нами экспериментальных рационов различных источников жира (насыщенные жиры, жиры с преобладанием ПНЖК семейств ω-3 или ω-6) не вызывает у животных даже при длительном их пребывании на этих рационах существенных изменений в индукции ПОЛ.

Однако в 3-месячном возрасте в сыворотке крови животных всех групп отмечено наивысшее содержание КоQ10 и наименьшее продуктов ПОЛ (ДК и ТБК-активных). Это говорит о наиболее сильном проявлении антиоксидантных свойств КоQ10 в самом активном для животных возрасте. При этом высокий антиоксидантный потенциал КоQ10 сохранялся у 3- и 6-месячных животных, получавших рационы с пальмовым и льняным маслом (см. рисунок, а-г). В то же время содержание ТБК-активных продуктов в печени животных всех исследуемых групп напрямую зависело от степени ненасыщенности жирных кислот, используемых в рационах и отражалось в изменениях показателя ИПО. Этот показатель, определяющий способность ЖК к образованию перекисей, может использоваться для оценки потенциальных субстратов ПОЛ как при проведении экспериментальных исследований, так и при создании жировых композиций с заданным составом ЖК.

Таблица 2. Индекс перекисного окисления, содержание полиненасыщенных жирных кислот семейства ω-3 и ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/г ткани) в печени крыс в зависимости от длительности эксперимента

Таблица 3. Содержание полиненасыщенных жирных кислот семейств ω-3 и ω-6, ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/г ткани) и показателя ИПО в печени крыс после 12 мес пребывания на рационах

Таблица 4. Содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс (мкмоль/л) в зависимости от длительности эксперимента

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Аронов Д.М. // Рус. мед. журн. - 2007. -Т. 15, № 20. - С. 1484-1489.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - С. 704.

4. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. // Лаб. дело. - 1989. - № 3. - С. 33-35.

5. Прохоров М.Ю., Тиунов М.П., Шакалис Д.А. // Лаб. дело. - 1977. - № 9. - С. 535-536.

6. Руководство Р. 1.1672-03 // Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - С. 240.

7. Шаранова Н.Э., Батурина В.А., Васильев А.В., Гаппаров М.М.Г. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 151, № 6. - С. 624-627.

8. Boelsma E., Hendriks H.F., Roza L. // Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - Vol. 73. - P. 853-864.

9. Christeff N., Homo-Delarche F., Thobie N. et al. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. - 1994. - N 51. - P. 12 5 -13 1.

10. Cosgrove J.P. ,Church D.F., Pryor W.A. // Lipids. - 1987. - N 22. - P. 299-304.

11. Herbert K.E. ,Wills E.D. // Biochem. Soc. Trans. - 1987. - Vol. 51. - P. 410-441.

12. Ibrahim W., Lee U.S., Yeh C.C. et al. // J. Nutr. - 1997. - Vol. 127, N 7. - P. 1401-1406.

13. Ohkawa H., Onishi Y., Yagi K. // Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 95. - P. 351-358.

14. Piche L.A., Draper H.H., Colf P.D. // Lipids. - 1988. - Vol. 23. - P. 370-371.

15. Simopolos A.P. // Am. J. Clin. Nutr. - 1999. - N 70 (suppl.). - P. 560-569.

16. Thies F., Garry J.M. // Lancet. - 2003. - Vol. 8, N 361. - P. 47 7- 4 8 5 .

17. Tres A., Bou R., Codony R. et al. // J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56, N 16. - P. 7243-7272.