Разработка и использование метода хромато-масс-спектрометрии для количественного определения летучих N-нитрозоаминов в копченых мясных продуктах

Резюме

Приведены результаты экспериментальных исследований по разработке высо­кочувствительной и селективной хромато-масс-спектрометрической мето­дики определения 9 N-нитрозоаминов в образцах пищевых продуктов (кол­басные изделия) с использованием дистилляции и автоматической системы твердофазной экстракции на угольных картриджах на этапе подготовки проб. При оптимально отработанных условиях подготовки пищевых проб к хими­ческому анализу (дистилляция и твердофазной экстракции) и хромато-масс-спектрометрического определения достигнута высокая эффективность разде­ления 9 N-нитрозоаминов стандартного образца и чувствительность с нижним пределом 0,0002 мг/кг и максимальной погрешностью не более 19%. Комплексное использование дистилляции N-нитрозоаминов с добавлением калия гидроокси­да в сочетании с оптимальной схемой элюирования твердофазной экстракции и концентрированием дистиллята на угольный картридж Coconut обеспечи­ло извлечение N-нитрозоаминов из образцов пищевой продукции (колбасные изделия) на 93,2-100%. В процессе апробации методики в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) различных производителей обнаружено содер­жание N-нитрозоаминов в диапазоне концентраций 0,00029 ±0,000055÷0,350±0,05 мг/кг. Выполненные исследования содержания N-нитрозоаминов по сумме (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) позволили установить в образце № 5 превышение гигиенического норматива до 47 раз, в образцах № 2 и 16 - до 57,5 и 22,9 раза и в образце № 4 - в 88 раз.

Ключевые слова:летучие N-нитрозоамины, копченые мясные продукты, хромато-масс-спектрометрический метод, твердофазная экстракция

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 5. С. 102-110. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10059.

Стратегия развития государственной политики обес­печения качества и безопасности пищевой про­дукции до 2020 г. относится к одному из элементов реализации Основ государственной политики Россий­ской Федерации в области здорового питания населе­ния на период до 2020 г. и Поручения Президента РФ от 26.06.2015 Пр-1259 [1].

Проблемы обеспечения безопасности и качества про­дукции становятся все более актуальными для пред­приятий пищевой промышленности России. В настоя­щее время не всегда можно обеспечить безопасность пищи при отсутствии современной системы контроля качества и безопасности продовольственного сырья, готовых видов пищевой продукции [2]. Именно с пище­выми продуктами в организм человека из окружающей среды поступает до 70% токсинов различной природы [3]. Канцерогены и их предшественники попадают в пищу из внешней среды, а также в процессе приго­товления, хранения и кулинарной обработки продуктов. К сильнейшим из известных канцерогенов относятся N-нитрозоамины [4]. Одним из источников поступления N-нитрозоаминов в организм человека являются коп­ченые пищевые продукты. При исследовании пищевых продуктов в Китае и Европе N-нитрозоамины (NAMS), подгруппа N-нитрозосоединений, были выявлены в колбасе копченой, сухой и салями, жареном беконе, ветчине [5, 6].

Большинство летучих N-нитрозоаминов являются сильными мутагенами, и их потребление может привести к новообразованиям [7]. На основании эпидемиологичес­ких исследований и экспериментов на животных Между­народное агентство по изучению рака (IARC) признало N-нитрозодиметиламин (N-DMA) и N-нитрозодиэтил-амин (N-DEA), вероятно, канцерогенными для человека. Другие N-нитрозоамины также встречаются в мясных продуктах, например N-нитрозодибутиламин (N-DBA), N-нитрозопипирединамин (NPIPA), N-нитрозопирролиди-намин (NPYRA) и N-нитрозоморфолинамин (N-MORA) классифицируются как возможно канцерогенные для человека (IARC, 1998) [8]. Безопасная суточная доза низ­комолекулярных N-нитрозоаминов для человека состав­ляет 10 мкг/сут или 5 мкг на 1 кг пищевого продукта.

N-нитрозоамины образуются в пищевых продуктах в результате реакции нитрозирующего агента и вторич­ного амина. В пищевых продуктах, особенно в мясных, основными донорами нитрозильных групп являются нитрит и нитрат натрия [9], которые выступают не только в качестве консервантов, но и необходимы для формирования цвета, аромата ветчинности, вкуса и про­явления антимикробных эффектов [10]. Допустимая суточная доза (ДСД) нитратов для человека составляет 300-325 мг. Допустимые дозы нитрита натрия посто­янно обсуждаются из-за его токсичности и возможного участия в образовании канцерогенных аминов в мясе. Вместе с тем удаление нитрита натрия из пищевых про­дуктов может увеличить риск отравления ботулизмом, так как нитриты используется в качестве ингибитора роста клостридий ботулизма и в качестве ингибитора продуцирования токсинов в колбасных изделиях.

Вторичные амины попадают в пищевой продукт раз­личными путями. Появление N-DEA, N-DBA и N-MORА в пищевых продуктах часто связано с миграцией предшес­твенников аминов из упаковочных материалов [11], в то время как N-РРА и N-PYRА могут попадать в пищевые продукты при использовании специй, таких как черный и красный перец [12]. В частности, в мясных продуктах биогенные амины и другие продукты распада белка явля­ются важным источником предшественников аминов.

С целью приоритетного развития прикладных научных исследований в области питания человека, изучения роли питания в профилактике наиболее распростра­ненных неинфекционных заболеваний, контроля со­держания высокотоксичных соединений необходимо располагать высокочувствительными и прецизионными аналитическими методиками обнаружения, идентифи­кации и количественного определения потенциально опасных загрязнителей пищевой продукции.

В зарубежной лабораторной практике для обнару­жения летучих N-нитрозоаминов в пищевой продукции широко используется метод газовой хроматографии (ГХ) с применением термоэнергетического детектора (TEA) [13]. Mногие существующие методы определения N-нитрозоаминов основаны на газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС) с ионизацией элект­ронного удара (EI) [14]. Вместе с тем в ГХ/MС наиболее чувствительным методом ионизации N-нитрозоаминов является химическая ионизация (CI), которая приво­дит к меньшей молекулярной фрагментации. Mето-дики позволяют количественно определять и выпол­нять идентификацию низких уровней N-нитрозоаминов в мясных продуктах [предел определения (LOQs) -0,0003-0,0004 мг/кг] [15].

Цель работы - разработка и использование ГХ/MС-метода для количественного определения 9 N-нитрозо-аминов в пищевой продукции (колбасные изделия).

Материал и методы

Разработка и аттестация ГХ/MС-методики по опреде­лению N-нитрозоаминов в пищевых продуктах прове­дена в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009. Mетрологическая аттестация методики выполнена в соответствии с РMГ 61-2010 [16] и ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002.

Для исследований использовали стандартные об-разцысмеси9N-нитрозоаминов (N-диметилнитрозоамин, N-метилэтилнитрозоамин, N-диэтилнитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин, N-пирролидиннитрозоамин, N-морфолиннитрозоамин, N-дифенилнитрозоамин) концентрацией 2000 мкг/мл в метаноле (Supelco, США), CAS 62-75-9.

Для построения градуировочной характеристики ис­пользовали стандартный раствор (0,16 мкг/см3) смеси 9 N-нитрозоаминов EPA 521 Nitrosamine Mix, состоящий из N-нитрозодиметиламина (N-DMNA), N-нитрозомети-лэтиламина (N-MENA), N-нитрозодиэтиламина (N-DENA), N-нитрозодипропиламина (N-DPNA), N-нитрозодибу-тиламина (N-DBNA), N-нитрозопипиредин (N-PIPNA), N-нитрозопирролидинамина (N-PYRNA), N-нитрозо-морфолинамина (N-MORNA) и N-нитрозодифениламина (N-DPHNA). Для работы автоматической системы твер­дофазной экстракции использовали растворители (HPLC) дихлорметан 99,9%; ацетонитрил 99,9%; 2-про-панол 99,99%; этилацетат 99,97%.

Для количественного определения содержания 9 N-нитрозоаминов выполняли ГХ/MС-анализ стандар­тных растворов и на основе результатов измерений строили градуировочную зависимость в режиме се­лективного ионного детектирования (SIM) по харак­теристическим ионам соединений 74, 88, 102, 130, 84, 114, 100, 116, 168 m/z в диапазоне концентраций 0,0002-0,0016 и 0,016-5,0 мг/кг. Правильность мето­дики оценена методом добавок аналитов на 3 уровнях концентраций 0,0002 (0,016), 0,0008 (0,008) и 0,0016 (0,0008) мг/кг. Проведенная аттестация методики поз­волила установить метрологические характеристики: показатель внутрилабораторной прецизионности 4,84%, показатель правильности не более 10% и показатель точности 19% [16].

Исследования стандартных образцов и пищевой про­дукции выполняли на газовом хроматографе Agilent 7890А (Agilent, США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (MCD) 5975С. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ.

Для подготовки образцов пищевой продукции (колбас­ные изделия) использовали современный метод твердо­фазной экстракции (ТФЭ). Для исследований применяли автоматизированную многоканальную систему твердо­фазной экстракции (Separths, Италия).

16 образцов пищевой продукции были изъяты из тор­говой сети методом случайной выборки. Они включали колбасные изделия: колбаса, салями, сырокопченая, сервелат. Каждый образец пищевого продукта анализи­ровали дважды.

В процессе разработки методики определения 9 N-нитрозоаминов в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) изучены и отработаны оптималь­ные условия выполнения ГХ и MС-анализа, подготовки проб методом дистилляции и ТФЭ, количественного определения 9 N-нитрозоаминов изучена полнота из­влечения способом "введено-найдено"; установлены метрологические характеристики измерительного процесса.

Результаты и обсуждение

В процессе разработки методики учитывали фак­торы, влияющие на разделение изучаемых и матрич­ных соединений: характеристики колонки (геомет­рические размеры - длина и внутренний диаметр), тип неподвижной фазы, толщину пленки в колонке, природу газа-носителя и его скорость, температуру колонки [17].

Отработка оптимальных условий выполнения хроматографического и масс-спектрометрического анализа. Для разделения 9 N-нитрозоаминов с использованием стандартных образцов были изучены параметры се­лективного разделения капиллярных колонок с раз­личными характеристиками неподвижных жидких фаз: DB-624 25 м x 0,32 мм x 5,0 мкм; HP-HP-FFAP 50 м x 0,32 мм x 0,5 мкм и HP-1-35 м x 0,32 мм x 0,25 мкм. Высокая эффективность хроматографического разделе­ния N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитро-зометилэтиламин, N-нитрозодиэтиламин, N-нитрозо-пирролидинамин, N-нитрозоморфолинамин, N-нитро-зодибутиламин, N-нитрозодипропиламин, N-нитрозо-пипиредин и N-нитрозодифениламин) с различными физико-химическими свойствами достигнута на капил­лярной колонке серии HP-FFAP 50 м x 0,320 мм x 0,50 мкм (длиной 50 м, внутренним диаметром 0,320 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,50 мкм). Режим программирования колонки: начальная температура 50 °С, повышение температуры до 120 °С со скоро­стью 8 °С/мин; от 120 до 185 °С со скоростью 12 °С/мин и от 185 до 240 °С со скоростью 25 °С/мин с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-но­сителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1,0 см3/мин в режиме постоянного потока. Температура аналитического интерфейса 220 °С. Ввод пробы осу­ществляли с помощью автосамплера в режиме pulsed/splitless; объем пробы 2 мм3. Режимы ГХ/МС-параметров представлены в табл. 1.

В режимах 2 и 3 не наблюдалось достаточно эф­фективного разделения N-нитрозоаминов. Селективное разделение N-нитрозоаминов стандартного образца было достигнуто в режиме 1, который и был выбран для дальнейшей работы.

Изучение полноты извлечения нитрозоаминов из об­разцов пищевой продукции методом "введено-най­дено". Для устранения влияния матричных эффектов [18] пищевых продуктов на результаты ГХ/МС-анализа N-нитрозоаминов, повышения селективности и полноты их извлечения выполняли очистку образцов пищевой продукции от мешающих компонентов и жира с до­бавлением калия гидрооксида с последующей дис­тилляцией с перегретым водяным паром и концентри­рованием дистиллята на картриджах автоматической системы ТФЭ.

Дистилляция. Навеску 20-50 г продукта помещали в перегонную колбу объемом 500 см3, соединенную с паровиком и прямым холодильником. К пищевому продукту добавляли 1,5 г калия гидроокиси, 50-100 см3 дистиллированной воды и отгоняли N-нитрозоамины с перегретым водяным паром [tпарообр = (100±5) °С и tколбы с образцом пищевого продукта = (80±5) C°] собирая 70 см3 дистиллята. Затем дистиллят пропус­кали через угольный картридж автоматической системы ТФЭ.

Твердофазная экстракция. Экспериментально отрабо­танная оптимальная схема селективного элюирования включала 4 стадии:

- стадия кондиционирования или активации карт­риджа хлористым метиленом объемом 2 см3, затем этилацетатом объемом 2,0 см3 с задержкой раство­рителя в течение 30 с. Для удаления остаточных ко­личеств растворителей картридж промывали водой объемом 2 см3 и продували автоматическую систему азотом в течение 2 мин;

- стадия адсорбции целевых компонентов на карт­ридже при загрузке пробы объемом 70 см3;

- стадия сушки картриджа в течение 20 мин для удаления остаточных количеств образца и про­дувка автоматической системы азотом в течение 2 мин;

- заключительная стадия - элюирование целевых аналитов с картриджа хлористым метиленом объ­емом 4 см3 и продувка автоматической системы азотом в течение 2 мин. Затем экстракт хлористого метилена объемом 2 мм2 через испаритель вводили в хроматографическую колонку.

Результаты исследований полноты извлечения N-нитрозоаминов из пищевого продукта с применением стандартного образца методом дистилляции и ТФЭ на угольном картридже представлены в табл. 2.

При оптимально отработанных условиях подготовки пищевых проб к химическому анализу (дистилляция и ТФЭ) и ГХ/МС-определения была достигнута высо­кая эффективность разделения 9 N-нитрозоаминов стандартного образца, что наглядно иллюстрирует хроматограмма (рис. 1).

В результате проведенных исследований установлено, что комплексное использование дистилляции N-нит-розоаминов с добавлением калия гидрооксида массой 1,5 г в сочетании с оптимальной схемой элюирования ТФЭ и концентрированием дистиллята на угольный картридж позволило достичь высокой полноты извлече­ния N-нитрозоаминов из образцов пищевой продукции (колбасные изделия) с применением стандартного рас­твора, которая составила 93,2-100%.

Метрологическая аттестация методики. Согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2002 в ходе валидации оценивали следующие параметры: диапазон измерений, прецизионность (точность, воспроизводимость), показатель правильности методики (табл. 3).

Точность (среднеквадратическое отклонение погреш­ности результатов анализа) и достоверность определяли на 3 уровнях концентраций образцов QC. Содержание N-нитрозоаминов в полученных растворах находились на нижней границе, верхней границе (75% от верхней точки линейного диапазона) и середине (50%) линейного диапазона методики. Проводили 5 измерений каждого уровня в течение 3 дней. Рассчитывали точность и до­стоверность за 1 день (одна аналитическая серия) и за 3 дня (между тремя аналитическими сериями). Согласно критериям FDA и ЕМА [19, 20] значение среднеквадратического отклонения не превышало 15% для уровня кон­центраций, соответствующих пределу количественного определения не более 20% для верхней границы диапазона. Достоверность рассчитывали как отношение сред­него значения концентрации внутри одной или между тремя аналитическими сериями к истинному значению концентрации. Предельно допустимые значения досто­верности составили для N-нитрозоаминов 95,8-100,0% для нижней границы диапазона и 97,2-100,0% для ос­тальных уровней концентраций [21].

Апробация методики. С помощью разработанной ГХ/МС-методики выполнены скрининговые исследова­ния 16 образцов пищевой продукции (колбаса салями, сырокопченая, сервелат) различных производителей. Содержание суммы N-нитрозоаминов (N-нитрозодиме-тиламин и N-нитрозодиэтиламин) оценивали относи­тельно допустимого уровня 0,004 мг/кг. Результаты коли­чественного определения N-нитрозоаминов в образцах колбасных изделий приведены в табл. 4. Высокое со­держание N-нитрозоаминов обнаружено в образце № 3 (рис. 2).

В результате выполненных исследований в образ­цах пищевых продуктов (колбасные изделия) (n=16) обнаружено содержание 9 N-нитрозоаминов в диа­пазоне концентраций 0,00029±0,000055÷0,350±0,05 мг/кг.

Выполненные исследования содержания высокоток­сичных N-нитрозоаминов по сумме (N-нитрозодимети-ламин, N-нитрозодиэтиламин) позволили установить в сервелате образца № 5 превышение гигиенического норматива до 47 раз. В сервелате образцов № 2 и 16 пре­вышение гигиенического норматива по сумме N-нитро-зоаминов составило 57,5 и 22,9 раза соответственно. Mаксимальное содержание N-нитрозоаминов по сумме (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) уста­новлено 88 предельно допустимых концентраций в сер­велате образца № 4.

Заключение

Создание современных высокочувствительных ме­тодик ГХ/МС-анализа позволяет с высокой степенью вероятности и надежности определять не только ингредиентный состав химически сложных смесей пи­щевых продуктов, но и выполнять количественное содержание высокотоксичных соединений. Разрабо­танная методика СТО M-29-2017 "Методика измерений содержания N-нитрозоаминов (N-диметилнитрозоамин, N-метилэтилнитрозоамин, N-диэтилнитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин, N-пирролидиннитрозоамин, N-морфолиннитрозоамин, N-дифенилнитрозоамин) в пробах пищевой продукции (копченые мясные, мясо- и птицепродукты) методом хромато-масс-спектрометрии" может быть использована для контроля качества колбасных изделий и оценки риска для здоровья человека.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутс­твие конфликтов интересов.

Литература

1. Проект стратегии развития государственной политики обес­печения качества и безопасности пищевой продукции до 2020 года.

2. Аршакуни В.Л. От системы ХАССП - к системе менеджмента безопасности пищевой продукции по ИСО 22000 // Стандарты и качество. 2008. № 2. C. 88-89.

3. Закревский В.В. Безопасность пищевых продуктов и биологи­чески активных добавок к пище : практическое руководство. СПб. : Гиорд, 2004. 280 с.

4. Регламент ЕС № 852/2004 Европейского Парламента и Совета от 29 апреля 2004 года "По гигиене пищевых продуктов".

5. Yuan Y., Wei M., Miao Y., Chen F., Hu X. Determination of eight volatile nitrosamines in meat products by ultrasonic solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry method // Int. J. Food Properties. 2015. Vol. 18. P. 1181-1190.

6. Sannino A., Bolzoni L. GC/CI-MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-Nitrosamines in meat products // Food Chem. 2013. Vol. 141, N 4. P. 3925-3930.

7. Rohrmann S., Overvad K., Bueno-de-Mesquita H.B., Jakobsen M.U., Egeberg R., Tjonneland A. et al. Meat consumption and mortality -results from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition // BMC Med. 2013. Vol. 11. P. 63.

8. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks for Humans. Lyon, 1991. Vol. 52. P. 473.

9. Herrmann S.S., Granby K., Duedahl-Olesen L. Formation and mitigation of N-nitrosamines in nitrite preserved cooked sausages // Food Chem. 2015. Vol. 174. P. 516-526.

10. Keszei A.P., Goldbohm R.A., Schouten L.J., Jakszyn P., van den Brandt P.A. Dietary N-nitroso compounds, endogenous nitrosation, and the risk of esophageal and gastric cancer subtypes in the Netherlands Cohort Study // Am. J. Clin. Nutr. 2013. Vol. 97. P. 135-146.

11. Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment // Food Control. 2014. Vol. 48. P. 163-169.

12. De Stefani E., Deneo-Pellegrini H., Carzoglio J.C. et. al. Dietary nitrosodi-methylamine and the risk of lung cancer: a case-control study from Uruguay // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996. Vol. 5, N 9. P. 679-682.

13. Ozel M.Z., Gongus F., Yagci S., Hamilton J.F., Lewis A.C. Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detection // Food Chem. Toxicol. 2010. Vol. 48, N 11. P. 3268-3273.

14. Man-Chun Huang, Hsin-Chang Chen, Ssu-Chieh Fu, Wang-Hsien Ding. Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography - chemical ionisation mass spectrometry // Food Chem. 2013. Vol. 138. P. 227-233. URL: www.elsevier.com/locate/foodchem.

15. Pei Wang, Weijun Yu, Yuesheng Qiu, Yungang Liu, Minxian Rong, and Hong Deng. Levels of nine volatile N-nitrosamines in Chinese-style sausages as determined by quechers-based gas chromatography-tandem mass spectrometry // Ann. Public Health Res. 2016. Vol. 3, N 4. 1049.

16. РМГ 61-2010. Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизион­ности методик количественного химического анализа. Методы оценки. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200094703. (дата обращения: 20.06.2017)

17. Михеева А.Ю., Васильева И.А., Семенов С.Ю., Сычев К.С. При­менение многослойных колонок для проведения экспрессной адсорбционной очистки экстракта при определении хлорорганических пестицидов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9, 1. С. 95-104.

18. Ярошенко Д.В., Карцова Л.А. Матричный эффект и способы его устранения в биоаналитических методиках, использующих хромато-масс-спектрометрию // Журн. аналит. химии. 2014. Т. 69. 4. С. 1-8.

19. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office. Washington, DC, 2001.

20. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use. London, 2009.

21. Bioanalytical Method Validation 05/24/18. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2018.

References

1. Draft of the strategy for the development of state policy for ensuring the quality and safety of food products until the year 2020. (in Rus­sian)

2. Arashkuni V.L. From HACCP system to ISO 22000 system of manage­ment of food products safety. Standarty i kachestvo [Standards and Quality]. 2008; (2): 88-9. (in Russian)

3. Zakvevskiy V.V. Safety of food products and biologically active food additives: A practice guidelines. Saint Petersburg: Giord, 2004: 280 p. (in Russian)

4. Regulation (EC) No. 852/2004 of the European Parliament and the Council from April 29, 2004 year "food hygiene". (in Rus­sian)

5. Yuan Y., Wei M., Miao Y., Chen F., Hu X. Determination of eight vola­tile nitrosamines in meat products by ultrasonic solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry method. Int J Food Properties. 2015; 18: 1181-90.

6. Sannino A., Bolzoni L. GC/CI-MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-Nitrosamines in meat products. Food Chem. 2013; 141 (4): 3925-30.

7. Rohrmann S., Overvad K., Bueno-de-Mesquita H.B., Jakobsen M.U., Egeberg R., Tjonneland A., et al. Meat consumption and mortality -results from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. BMC Med. 2013; 11: 63.

8. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks for Humans. Lyon, 1991; 52: 473.

9. Herrmann S.S., Granby K., Duedahl-Olesen L. Formation and mitiga­tion of N-nitrosamines in nitrite preserved cooked sausages. Food Chem. 2015; 174: 516-26.

10. Keszei A.P., Goldbohm R.A., Schouten L.J., Jakszyn P., van den Brandt P.A. Dietary N-nitroso compounds, endogenous nitrosation, and the risk of esophageal and gastric cancer subtypes in the Netherlands Cohort Study. Am J Clin Nutr. 2013; 97: 135-46.

11. Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment. Food Control. 2014; 48: 163-9.

12. De Stefani E., Deneo-Pellegrini H., Carzoglio J.C., et. al. Dietary nitrosodi-methylamine and the risk of lung cancer: a case-control study from Uruguay. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996; 5 (9): 679-82.

13. Ozel M.Z., Gongus F., Yagci S., Hamilton J.F., Lewis A.C. Deter­mination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detection. Food Chem Toxicol. 2010; 48 (11): 3268-73.

14. Man-Chun Huang, Hsin-Chang Chen, Ssu-Chieh Fu, Wang-Hsien Ding. Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography - chemical ionisation mass spectrometry. Food Chem. 2013; 138: 227-33. URL: www.elsevier.com/locate/foodchem.

15. Pei Wang, Weijun Yu, Yuesheng Qiu, Yungang Liu, Minxian Rong, and Hong Deng. Levels of nine volatile N-nitrosamines in Chinese-style sausages as determined by quechers-based gas chromatography-tandem mass spectrometry. Ann Public Health Res. 2016; 3 (4): 1049.

16. RMG 61-2010. State system for ensuring the uniformity of measure­ments. Indicators of accuracy, correctness, precision methods of quantitative chemical analysis. The methods of evaluation. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200094703. (date of access June 20, 2017) (in Russian)

17. Mikheev A.Yu., Vasilyeva I.A., Semenov S.Yu., Sychev K.S. Appli­cation of multi-layered columns for conducting rapid adsorption purification of the extract when determining organochlorine pesti­cides. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy [Sorption and Chromatographic Processes]. 2009; 9 (1): 95-104. (in Russian)

18. Yaroshenko D.V., Kartsova L.A., Matrix effect and its elimination in bioanalytical methods using chromatography-mass spectrometry. Zhurnal analiticheskoy khimii [Journal of Analitical Chemistry]. 2014; 69 (4): 1-8. (in Russian)

19. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Depart­ment of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2001.

20. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use. London, 2009.

21. Bioanalytical Method Validation 05/24/18. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2018.