Молекулярно-генетические исследования генно-инженерно-модифицированного картофеля: трансформационное событие PH05-026-0048

Резюме

Характеристика и оценка специфичности методов идентификации и коли­чественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) направлены на подтверждение их адекватности инструменталь­ной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО. Специфичность праймерной системы для идентификации трансфор­мационного события PH05-026-0048 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени экспериментально подтверждена в исследованиях с другими генно-инженерно-модифицированными (ГМ) линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Эффективность, линейность и пра­вильность метода соответствуют требованиям Международной лаборатории Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Предел обнаружения и количественного обнаружения геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 составляет соответственно 0,019% (11 копий геномной ДНК ГМ-картофеля) и 0,06% (36 копий геномной ДНК ГМ-картофеля) из расчета на 100 нг суммарной ДНК.

Ключевые слова:генно-инженерно-модифицированный картофель, методы контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами, трансформационное событие PH05-026-0048

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 25-31. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10038.

В соответствии с законодательством РФ и Евразий­ского экономического союза (ТР ТС 015/2011, ТР ТС 021/2011, ТР ТС 022/2011, ТР ТС 023/2011, ТР ТС 024/2011, ТР ТС 027/2012, ТР ТС 029/2012, постановле­ние Правительства РФ от 23.09.2013 № 839) пищевая продукция, полученная с использованием генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО), отно­сится к категории новых пищевых продуктов, которая до выхода на рынок проходит процедуру государс­твенной регистрации. В рамках данной процедуры должны быть выполнены молекулярно-генетические исследования и санитарно-эпидемиологическая экс­пертиза ГМО, предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов [1, 2]. Молекулярно-генетические исследования пре­дусматривают проведение медико-генетической оцен­ки, а также характеристику и оценку специфичности методов идентификации ГМО. Исследования включа­ют BLAST-анализ праймеров и зондов, определение характеристик и показателей точности метода, экспе­риментальное подтверждение специфичности метода в исследованиях с другими ГМО.

Исходя из сложившейся практики контроля основным методом обнаружения, идентификации и количествен­ного определения ГМО является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Несмотря на то что для не подвергавшихся технологической переработке пищевых продуктов и продовольственного сырья могут быть использованы иммунологические методы детек­ции специфичных для ГМО белков, универсальность, специфичность и простота ПЦР делают ее методом вы­бора при лабораторных исследованиях.

Генно-инженерно-модифицированный (ГМ) картофель линии PH05-026-0048 содержит в геноме кассеты экс­прессии генов CS-rpi и Ahas, детерминирующих устой­чивость соответственно к фитофторозу и к гербициду имидазолинону. Экспрессию CS-rpi регулируют промо­тор p-rpi и терминатор t-rpi, которые не входят в перечень регуляторных генетических элементов, определяемых в рамках рутинного контроля за ГМО; экспрессию Ahas регулируют промотор pNOS и терминатор tNOS, кото­рые, напротив, могут быть выявлены в процессе скри-нинговых лабораторных исследований пищевой продук­ции. Таким образом, обнаружение ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 на основании детекции маркерных регу-ляторных элементов не представляет проблемы, однако метод идентификации трансформационного события и количественного определения этого ГМО в настоящее время не входит в список утвержденных в Российской Федерации.

Цель настоящей работы - подтверждение харак­теристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, что необходимо для внедрения данного метода в прак­тику надзорной службы.

Материал и методы

Исследования проведены с использованием сертифи­цированных стандартных образцов (Сertified Reference Material, CRM) ERM-BF435a (0% ГМО, немодифицированный картофель) и ERM-BF435b (100% ГМ-картофель линии PH05-026-0048).

Метод идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR, позволяет определять содержание рекомбинантной ДНК относительно общей ДНК картофеля, присутствующей в образце. Протокол ПЦР разработан и валидирован European Commission Joint Research Centre [3].

Идентификация трансформационного события вы­полнена с использованием пары праймеров, один из них расположен внутри перенесенной генетичес­кой конструкции, другой - в области геномной ДНК картофеля, прилегающей к трансгенной вставке, и олигонуклеотидного зонда с репортерным флуорес­центным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5'-конце и гасителем BHQ1, относящемся к семейс­тву красителей Black Hole Quenchers, - на 3'-конце (табл. 1) [3].

Для обнаружения целевого (референсного) гена кар­тофеля (гена fru, кодирующего β-фруктозидазу) исполь­зовали пару ген-специфичных праймеров и зонд, мечен­ный FAM на 5'-конце, и BHQ1 - на 3'-конце [3].

Праймеры и зонды синтезированы Научно-производс­твенной компанией (НПК) "Синтол" (РФ). ПЦР-РВ проводили с использованием аналога 2x TaqMan Universal PCR Master Mix - 2,5x реакционной смеси для ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ROX (НПК "Синтол", РФ), содержащего праймеры и зонды в концентра­циях, указанных в табл. 2.

Для выделения ДНК применяли модифицирован­ный метод щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии ("Promega", США) [4]. Пригодность полученных препаратов ДНК для ампли­фикации при последующей ПЦР подтверждали методом ПЦР по [5].

Для постановки ПЦР использовали амплификатор CFX96TM Real-Time PCR System ("Bio-Rad", США) (табл. 3). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные об­рабатывали с помощью пакета CFX ManagerTM Software, версия 1.6 ("Bio-Rad", США).

Проверку специфичности праймерной системы для выявления генетической мишени в трансформационном событии РН05-026-0048 проводили с помощью качес­твенного анализа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени по технологии TaqMan на препара­тах ДНК ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, а также других ГМ-линий картофеля: ЕН92-527-1 (CRM, ERM-BF421b), AV43-6-G7 (CRM, ERM-BF431e) и традиционного аналога (CRM, ERM-BF435a). В качестве отрицательного контроля использовали пробу без ДНК-матрицы.

Анализ нуклеотидных последовательностей праймеров относительно референсного генома картофеля Solanum tuberosum проводили с помощью онлайн-сервиса BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [6] базы данных GenBank, алгоритм BLASTN.

Относительное количество ГМ-картофеля PH05-026-0048 определяли на основании калибровочной кривой (график зависимости логарифма % концентрации от ве­личины для каждой калибровочной точки), для по­строения которой использовали стандарты - контроль­ные растворы с известным содержанием ДНК картофеля.

Эффективность, линейность, правильность, прецизи­онность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой троек­ратной амплификации.

Результаты и обсуждение

Специфичность праймерной системы для идентифи­кации трансформационного события PH05-026-0048 методом ПЦР-РВ экспериментально подтверждена в ис­следованиях с другими ГМ-линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Данные анализа продук­тов ПЦР с ГМ-специфичными и таксон-специфичными праймерами представлены на рис. 1 и в табл. 4.

Появление продукта ПЦР в реакции с праймерами, специфичными для конкретного трансформационного события, подтверждает присутствие в анализируемом образце искомой генетической конструкции, соответс­твующей линии PH05-026-0048, при этом отсутствие продукта ПЦР в реакциях с другими ГМ-линиями карто­феля свидетельствует о специфичности данной праймерной системы.

Результаты определения относительного количества ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 с помощью калиб­ровочной кривой представлены на рис. 2 и в табл. 5.

Как видно из табл. 5, значения систематической ошибки (bias, systematic error) лежат в интервале зна­чений ±25% для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что говорит о близости полученных результатов к истинному зна­чению. Кроме того, значения относительного стан­дартного отклонения (relative within laboratory standard deviation - RSDr) для каждого стандартного образца, полученные в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, также нахо­дятся в допустимом интервале значений ≤25%.

Для определения диапазона применения метода [интервала между наибольшей и наименьшей концен­трациями (количествами) определяемого вещества в образце (включая эти концентрации), при котором ана­литическая методика имеет приемлемый уровень пре­цизионности, правильности и линейности] для построе­ния калибровочной кривой использовали стандартные растворы с содержанием ГМ-картофеля РН05-026-0048 от 0,1 до 50% (рис. 3).

Как показано на рис. 3, в диапазоне рабочих концен­траций угол наклона стандартной кривой составляет -3,392, коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) равен 0,99, эффективность амплификации состав­ляет 90,7%. Полученные результаты подтверждают пря­мую пропорциональную зависимость аналитического сигнала от количества определяемого вещества в об­разце и, соответственно, линейность метода.

Предел обнаружения геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048, представляющий собой наименьшее количество определяемого аналита в образце, которое может быть обнаружено с использованием данного метода, составляет 0,019%, или 11 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25%. Предел количествен­ного обнаружения, представляющий собой наименьшее количество аналита в образце, которое можно количес­твенно определить с надлежащим уровнем достовер­ности и точности, составляет 0,06%, или 36 копий геном­ной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25% (рис. 4).

Эффективность, линейность и правильность метода соответствуют требованиям Международной лаборато­рии Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Согласно полученным данным при всех трех независимых амплификациях значение коэффициента корреляции линейной регрессии (R2) было выше 0,98, а угол наклона стандартной кривой, получен­ной методом линейной регрессии, лежал в допустимых пределах (от -3,1 до -3,6). Результаты представлены в табл. 6.

Относительные стандартные отклонения результатов отдельных определений, полученные в условиях повто­ряемости (RSDr) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, пред­ставлены в табл. 7.

Результаты независимых индивидуальных испытаний представлены в табл. 8.

Как видно из табл. 8, относительное стандартное отклонение для каждого стандартного образца, по­лученное в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, находилось в допустимом интервале значений <25%.

Таким образом, результаты проведенных исследова­ний подтвердили характеристики, определенные для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048. Высокая специфичность праймеров, специфичность, линейность и точность метода свидетельствуют о его надежности и пригодности для обеспечения эффективного надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Рос­сийского научного фонда (проект № 16-16-04123).

Литература

1. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения : методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М. : Федераль­ный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

2. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками : методические указания (МУ 2.3.2.3388-16). М. : Федеральный центр гигиены и эпидеми­ологии Роспотребнадзора, 2016. 30 с.

3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.

4. Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифи­цированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.

5. ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кис­лот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с.

6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (дата обра­щения 4.06.2018).

References

1. Methodical Guidelines 2.3.2.2306-07 "Medical and biological safety assessment of genetically modified organisms of plant origin*. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2008: 21 p. (in Russian)

2. Methodical Guidelines 2.3.2.3388-16 "Medical and biological safety assessment of stacked genetically modified organisms of plant origin". Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2016: 30 p. (in Russian)

3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.

4. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extrac­tion from different food products using the modified alkaline method. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2009; (2): 83-90. (in Rus­sian)

5. GOST R ISO 21571-2014 [ISO 21571:2005]. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived prod­ucts. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)

6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (date of access June 04, 2018)