В соответствии с законодательством РФ и Евразийского экономического союза (ТР ТС 015/2011, ТР ТС 021/2011, ТР ТС 022/2011, ТР ТС 023/2011, ТР ТС 024/2011, ТР ТС 027/2012, ТР ТС 029/2012, постановление Правительства РФ от 23.09.2013 № 839) пищевая продукция, полученная с использованием генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО), относится к категории новых пищевых продуктов, которая до выхода на рынок проходит процедуру государственной регистрации. В рамках данной процедуры должны быть выполнены молекулярно-генетические исследования и санитарно-эпидемиологическая экспертиза ГМО, предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов [1, 2]. Молекулярно-генетические исследования предусматривают проведение медико-генетической оценки, а также характеристику и оценку специфичности методов идентификации ГМО. Исследования включают BLAST-анализ праймеров и зондов, определение характеристик и показателей точности метода, экспериментальное подтверждение специфичности метода в исследованиях с другими ГМО.
Исходя из сложившейся практики контроля основным методом обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Несмотря на то что для не подвергавшихся технологической переработке пищевых продуктов и продовольственного сырья могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков, универсальность, специфичность и простота ПЦР делают ее методом выбора при лабораторных исследованиях.
Генно-инженерно-модифицированный (ГМ) картофель линии PH05-026-0048 содержит в геноме кассеты экспрессии генов CS-rpi и Ahas, детерминирующих устойчивость соответственно к фитофторозу и к гербициду имидазолинону. Экспрессию CS-rpi регулируют промотор p-rpi и терминатор t-rpi, которые не входят в перечень регуляторных генетических элементов, определяемых в рамках рутинного контроля за ГМО; экспрессию Ahas регулируют промотор pNOS и терминатор tNOS, которые, напротив, могут быть выявлены в процессе скри-нинговых лабораторных исследований пищевой продукции. Таким образом, обнаружение ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 на основании детекции маркерных регу-ляторных элементов не представляет проблемы, однако метод идентификации трансформационного события и количественного определения этого ГМО в настоящее время не входит в список утвержденных в Российской Федерации.
Цель настоящей работы - подтверждение характеристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, что необходимо для внедрения данного метода в практику надзорной службы.
Материал и методы
Исследования проведены с использованием сертифицированных стандартных образцов (Сertified Reference Material, CRM) ERM-BF435a (0% ГМО, немодифицированный картофель) и ERM-BF435b (100% ГМ-картофель линии PH05-026-0048).
Метод идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR, позволяет определять содержание рекомбинантной ДНК относительно общей ДНК картофеля, присутствующей в образце. Протокол ПЦР разработан и валидирован European Commission Joint Research Centre [3].
Идентификация трансформационного события выполнена с использованием пары праймеров, один из них расположен внутри перенесенной генетической конструкции, другой - в области геномной ДНК картофеля, прилегающей к трансгенной вставке, и олигонуклеотидного зонда с репортерным флуоресцентным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5'-конце и гасителем BHQ1, относящемся к семейству красителей Black Hole Quenchers, - на 3'-конце (табл. 1) [3].
Для обнаружения целевого (референсного) гена картофеля (гена fru, кодирующего β-фруктозидазу) использовали пару ген-специфичных праймеров и зонд, меченный FAM на 5'-конце, и BHQ1 - на 3'-конце [3].
Праймеры и зонды синтезированы Научно-производственной компанией (НПК) "Синтол" (РФ). ПЦР-РВ проводили с использованием аналога 2x TaqMan Universal PCR Master Mix - 2,5x реакционной смеси для ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ROX (НПК "Синтол", РФ), содержащего праймеры и зонды в концентрациях, указанных в табл. 2.
Для выделения ДНК применяли модифицированный метод щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии ("Promega", США) [4]. Пригодность полученных препаратов ДНК для амплификации при последующей ПЦР подтверждали методом ПЦР по [5].
Для постановки ПЦР использовали амплификатор CFX96TM Real-Time PCR System ("Bio-Rad", США) (табл. 3). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета CFX ManagerTM Software, версия 1.6 ("Bio-Rad", США).
Проверку специфичности праймерной системы для выявления генетической мишени в трансформационном событии РН05-026-0048 проводили с помощью качественного анализа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени по технологии TaqMan на препаратах ДНК ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, а также других ГМ-линий картофеля: ЕН92-527-1 (CRM, ERM-BF421b), AV43-6-G7 (CRM, ERM-BF431e) и традиционного аналога (CRM, ERM-BF435a). В качестве отрицательного контроля использовали пробу без ДНК-матрицы.
Анализ нуклеотидных последовательностей праймеров относительно референсного генома картофеля Solanum tuberosum проводили с помощью онлайн-сервиса BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [6] базы данных GenBank, алгоритм BLASTN.
Относительное количество ГМ-картофеля PH05-026-0048 определяли на основании калибровочной кривой (график зависимости логарифма % концентрации от величины для каждой калибровочной точки), для построения которой использовали стандарты - контрольные растворы с известным содержанием ДНК картофеля.
Эффективность, линейность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой троекратной амплификации.
Результаты и обсуждение
Специфичность праймерной системы для идентификации трансформационного события PH05-026-0048 методом ПЦР-РВ экспериментально подтверждена в исследованиях с другими ГМ-линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Данные анализа продуктов ПЦР с ГМ-специфичными и таксон-специфичными праймерами представлены на рис. 1 и в табл. 4.
Появление продукта ПЦР в реакции с праймерами, специфичными для конкретного трансформационного события, подтверждает присутствие в анализируемом образце искомой генетической конструкции, соответствующей линии PH05-026-0048, при этом отсутствие продукта ПЦР в реакциях с другими ГМ-линиями картофеля свидетельствует о специфичности данной праймерной системы.
Результаты определения относительного количества ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 с помощью калибровочной кривой представлены на рис. 2 и в табл. 5.
Как видно из табл. 5, значения систематической ошибки (bias, systematic error) лежат в интервале значений ±25% для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что говорит о близости полученных результатов к истинному значению. Кроме того, значения относительного стандартного отклонения (relative within laboratory standard deviation - RSDr) для каждого стандартного образца, полученные в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, также находятся в допустимом интервале значений ≤25%.
Для определения диапазона применения метода [интервала между наибольшей и наименьшей концентрациями (количествами) определяемого вещества в образце (включая эти концентрации), при котором аналитическая методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности] для построения калибровочной кривой использовали стандартные растворы с содержанием ГМ-картофеля РН05-026-0048 от 0,1 до 50% (рис. 3).
Как показано на рис. 3, в диапазоне рабочих концентраций угол наклона стандартной кривой составляет -3,392, коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) равен 0,99, эффективность амплификации составляет 90,7%. Полученные результаты подтверждают прямую пропорциональную зависимость аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце и, соответственно, линейность метода.
Предел обнаружения геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048, представляющий собой наименьшее количество определяемого аналита в образце, которое может быть обнаружено с использованием данного метода, составляет 0,019%, или 11 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25%. Предел количественного обнаружения, представляющий собой наименьшее количество аналита в образце, которое можно количественно определить с надлежащим уровнем достоверности и точности, составляет 0,06%, или 36 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25% (рис. 4).
Эффективность, линейность и правильность метода соответствуют требованиям Международной лаборатории Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Согласно полученным данным при всех трех независимых амплификациях значение коэффициента корреляции линейной регрессии (R2) было выше 0,98, а угол наклона стандартной кривой, полученной методом линейной регрессии, лежал в допустимых пределах (от -3,1 до -3,6). Результаты представлены в табл. 6.
Относительные стандартные отклонения результатов отдельных определений, полученные в условиях повторяемости (RSDr) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, представлены в табл. 7.
Результаты независимых индивидуальных испытаний представлены в табл. 8.
Как видно из табл. 8, относительное стандартное отклонение для каждого стандартного образца, полученное в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, находилось в допустимом интервале значений <25%.
Таким образом, результаты проведенных исследований подтвердили характеристики, определенные для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048. Высокая специфичность праймеров, специфичность, линейность и точность метода свидетельствуют о его надежности и пригодности для обеспечения эффективного надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04123).
Литература
1. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения : методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.
2. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками : методические указания (МУ 2.3.2.3388-16). М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. 30 с.
3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.
4. Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.
5. ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с.
6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (дата обращения 4.06.2018).
References
1. Methodical Guidelines 2.3.2.2306-07 "Medical and biological safety assessment of genetically modified organisms of plant origin*. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2008: 21 p. (in Russian)
2. Methodical Guidelines 2.3.2.3388-16 "Medical and biological safety assessment of stacked genetically modified organisms of plant origin". Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2016: 30 p. (in Russian)
3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.
4. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extraction from different food products using the modified alkaline method. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2009; (2): 83-90. (in Russian)
5. GOST R ISO 21571-2014 [ISO 21571:2005]. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)
6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (date of access June 04, 2018)