Экспериментальная оценка in vivo гипогликемических свойств функционального пищевого ингредиента - полифенольной пищевой матрицы

Резюме

Целью данного исследования было изучение гипогликемического действия функ­ционального пищевого ингредиента (ФПИ) - полифенольной пищевой матрицы в 3-месячном эксперименте in vivo с использованием ожиревших мышей-самцов линии C57BL/6. Пищевую матрицу получали путем инкубации 2% раствора экстракта листьев черники (рН 3,6) с навеской гречневой муки в соотношении 1:50 в течение 45 мин при 25 оС. Содержание фенольных соединений в экспери­ментальной партии ФПИ составило 26,6±0,5 мг-экв галловой кислоты в 1 г муки коричневой гречки. Эксперимент проведен на 46 мышах-самцах линии C57BL/6c До проведения эксперимента у животных определяли концентрацию глюкозы в крови, проводили пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) натощак, в котором вычисляли показатель площади под кривой (ППК). Животные были рандомизированно разделены (по массе тела, уровню глюкозы и ППК) на 4 груп­пы: контрольную группу К1 (n=10, мыши получали стандартный полусинтети­ческий рацион), контрольную группу К2 (n=10) и 2 опытные группы Г3 и Г4 (n=13). Признаки сахарного диабета 2 типа у животных групп К2, Г3 и Г4 моделировали с применением изоазотистого высокожирового высокоуглеводного рациона (ВЖВУ-рацион, 30% жира, 20% сахарозы). В рацион животных групп Г3 и Г4 вносили ФПИ в количестве соответственно 2,5 и 5 г/100 г рациона. Повторный ПГТТ проводили на 40-е и 82-е сутки. На 15,54 и на 91-е сутки проводили тест на инсулинорезистентность. Вследствие потребления ВЖВУ-рациона у живот­ных группы К2 к 11-й неделе развилось ожирение, характеризуемое статисти­чески значимым увеличением прироста массы тела (37,1±4,9%) по сравнению с животными группы К1 (23,4±2,2%). Введение в рацион животных ФПИ замет­но снижало у них прибавку массы тела по сравнению с животными группы К2. К 8-й неделе эксперимента выявлено статистически значимое увеличение кон­центрации глюкозы в крови животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион (К2 - 8,2±0,3 ммоль/л, Г3 - 8,1±0,3 ммоль/л и Г4 - 8,5±0,3 ммоль/л), по сравне­нию с мышами группы К1 (7,1±0,3 ммоль/л). На 91-е сутки эксперимента эта разница оставалась значимой только для группы К2 (9,3±0,6 ммоль/л против 7,7±0,3 ммоль/л для группы К1), что свидетельствует о благоприятном гипогликемическом действии ФПИ в обеих дозировках (для группы Г3 8,5±0,2 ммоль/л и для группы Г4 8,4±0,3 ммоль/л). К 8-й неделе эксперимента у животных конт­рольной группы К2 выявлено нарушение толерантности к глюкозе, что являет­ся одним из проявлений сахарного диабета 2 типа. Профилактическое введение в рацион животных группы Г3 ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона тормозило раз­витие симптомов данного заболевания. Профилактическое введение в рацион животных группы Г4 высокой дозы ФПИ (5,0 г/100 г рациона) в определен­ной степени препятствовало увеличению инсулинорезистентности. Введение в рацион ФПИ не оказывало влияния на когнитивные функции животных, на кратко- и долгосрочную память.

Ключевые слова:полифенолы, экстракт листьев черники, пищевая матрица, мыши, гипергликемия, ожирение, инсулинорезистентность, глюкозотолерантность

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 5-13. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10036.

В области клинической диетологии и нутрициологии разработка новых специализированных пищевых продуктов, эффективность которых должна устанавли­ваться с позиций доказательной медицины, признана приоритетной. Перспективным подходом к созданию специализированных пищевых продуктов профилакти­ческого антидиабетического действия является вклю­чение в их состав природных функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), целенаправленно корригирующих нарушения углеводного и липидного обмена и тем самым снижающих риск развития сахарного диабета 2 типа и связанных с ним клинических проявлений. Экс­периментальная оценка эффективности и безопасности в экспериментах in vivo является необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям специали­зированных пищевых продуктов, позволяет оптимизи­ровать поиск входящих в их состав биологически актив­ных соединений [1].

Все возрастающий интерес к вопросу использова­ния индивидуальных растительных полифенолов как таковых или в составе экстрактов при метаболических нарушениях обусловлен результатами исследований, доказывающих эффективность и безопасность их при­менения за счет реализации одного из основных при­нципов фитотерапии: действия не только на поражен­ный орган, но и на сопряженные системы организма [2].

В серии наших предыдущих исследований были про­тестированы гипогликемические и гиполипидемические свойства водного раствора сухого экстракта листьев черники в опытах in vivo при использовании диабети­ческой генетической линии тучных крыс-самцов Zucker Diabetic Fatty [3] и крыс-самцов линии Wistar c развив­шимися диабетическими проявлениями, индуцирован­ными введением стрептозотоцина в сочетании с пот­реблением высокофруктозного рациона [4]. Полученные результаты, во-первых, свидетельствовали об опреде­ленном благоприятном воздействии экстракта листьев черники на углеводный и липидный обмен в организме использованных в эксперименте диабетических жи­вотных, а во-вторых, определили задачу, связанную с дальнейшим повышением эффективности разрабаты­ваемого полифенольного ингредиента. Одним из пер­спективных технологических подходов, позволяющих защищать полифенольные соединения от деградации в пищеварительном тракте, повышать стабильность при хранении и концентрировать в пищевом продукте является сорбция на белковых матриксах [5]. Путем сорбции водного раствора сухого экстракта листьев черники на муке коричневой гречки нами получена пищевая матрица [6] для дальнейшего использования в качестве ФПИ в составе специализированных пи­щевых продуктов для лиц с нарушениями углеводного и липидного обмена.

Цель данного исследования - изучить гипогликемическое действие полифенольной пищевой матрицы в 3-месячном эксперименте in vivo с использованием ожиревших мышей-самцов линии C57BL/6.

Материал и методы

Для получения пищевой матрицы использовали муку коричневой гречки (ООО "Хлебзернопродукт", Россия) с массовой долей белка 9,7% и сухой экстракт лис­тьев черники (ООО "Хармс", Россия) с содержанием полифенольных соединений 95,0±1,1 мг-экв галловой кислоты. ФПИ получали путем сорбции полифенольных соединений из водного раствора сухого экстракта листьев черники на муке коричневой гречки путем инкубации 2% раствора экстракта (рН 3,6) с навеской гречневой муки в соотношении 1:50 раствора в течение 45 мин при 25 °С [6].

Определение санитарно-химических и санитарно-микробиологических показателей экспериментальной партии ФПИ для проведения исследования in vivo под­твердило их соответствие требованиям ТР ТС 021/21

"О безопасности пищевой продукции". Содержание фенольных соединений в экспериментальной партии ФПИ составило 26,6±0,5 мг-экв галловой кислоты в 1 г муки коричневой гречки.

Эксперимент проведен на 46 мышах-самцах линии C57BL/6с, полученных из питомника лабораторных жи­вотных Филиал "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России. Иссле­дования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил лабораторной практики" и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надле­жащей лабораторной практики".

Животных содержали по 4 мыши в клетке в контро­лируемых условиях окружающей среды (температура 20-26 °C, относительная влажность 30-60%, 12-часовой цикл освещения).

Исходная масса тела животных на начало экспери­мента составила 20±2 г.

До проведения эксперимента у животных оценивали концентрацию глюкозы в крови (животных депривировали голодом 4 ч) и проводили пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) натощак для оценки состояния углеводного обмена.

Для определения концентрации глюкозы у животных отбирали кровь из хвостовой вены, уровень глюкозы оп­ределяли с помощью портативного электрохимического глюкометра ("OneTouch Select", США). При проведении ПГТТ животным всех экспериментальных групп вводили 2 г глюкозы на 1 кг массы тела животного в виде 30% раствора. Отбирали кровь для определения уровня глю­козы до введения глюкозы (0-я точка), через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости концентрации глюкозы в крови от времени после введения глюкозной нагрузки, определяли значение площади под кривой (ППК, ммоль/лх180 мин).

Животных рандомизировали (по массе тела, уровню глюкозы и показателю ППК) на 4 группы: контрольную группу К1 (n=10 мышей), контрольную группу К2 (n=10) и 2 опытные группы Г3 и Г4 (n=13). Результаты распре­деления представлены в табл. 1. На рис. 1 приведены кривые, полученные в ПГТТ.

Животные группы К1 на протяжении всего экспери­мента получали стандартный полусинтетический рацион. Животные групп К2 и Г3, Г4 получали модифицированный изоазотистый высокожировой высокоуглеводный рацион (ВЖВУ-рацион). В рацион животных опытной группы Г3 вносили ФПИ (разработанную пищевую мат­рицу) в количестве 2,5 г на 100 г корма и в рацион опыт­ной группы Г4 вносили ФПИ в количестве 5 г/100 г раци­она. Состав рационов представлен в табл. 2.

Животные всех групп на протяжении эксперимента по­лучали питьевую воду, фильтруемую системой RiOS 30 ("Merck", Германия), ad libitum. 2 раза в неделю контро­лировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали. 1 раз в 2 нед у животных измеряли концен­трацию глюкозы в крови. Повторный ПГТТ проводили на 40-е и 82-е сутки.

На 15, 54 и на 91-е сутки проводили тест на чувствитель­ность к инсулину (инсулинорезистентность). Животных депривировали голодом в течение 4 ч. Отбирали кровь из хвостовой вены и определяли концентрацию глюкозы (0-я точка). Животным всех экспериментальных групп вводили инсулин внутрибрюшинно в дозе 0,25 Ед на 1 кг массы тела. Измеряли концентрацию глюкозы в крови через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости уровня глюкозы от времени после введения инсулина, определяли значение ППК (в ммоль/лх180 мин).

В тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ) изучали поведение животных в условиях переменной стрессогенности, т.е. при свободном выборе комфортных условий, что позволяет оценить их уровень тревожности. При тестировании регистрировали число заходов и время пребывания в закрытых (ЗР) и открытых рукавах (ОР), общую исследовательскую активность [7]. 1-е тестирова­ние проводили на 40-й день эксперимента, 2-е - на 90-й день эксперимента. Перемещение мышей по лабиринту регистрировали с помощью системы видеонаблюдения "Smart 3.0.04" (Panlab Harvard Apparatus, Испания).

Поведение и память животных оценивали, используя тест "Условный рефлекс пассивного избегания" (УРПИ) [8]. При обучении мышь однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Регистрировали латентный период пребывания в светлом отсеке камеры. Как только мышь переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,2 мА в течение не более 8 с). Через 24 ч после обу­чения у животных проверяли сохранность памятного следа. Латентный период пребывания в светлом отсеке камеры при тестировании является показателем, ха­рактеризующим степень запоминания мышью отрица­тельного опыта - удара током, который она приобрела в темном отсеке камеры во время его первого посещения при обучении. С целью оценки влияния эксперименталь­ных рационов на процессы забывания тестирование сохранения памятного следа проводили спустя отдален­ный интервал времени - через 3 нед. Обучение прово­дили на 49-е сутки эксперимента, проверку обучения -на 50-е сутки эксперимента и оценку долгосрочной па­мяти проводили на 70-е сутки периода кормления.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20 ("IBM", США), используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистичес­кой гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Общее состояние животных контрольной группы К1 по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости роста при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным. Общее со­стояние животных контрольной группы К2 и опытных групп Г3, Г4 по внешнему виду и качеству шерстного покрова отличалось от такового контрольной группы К1, шерсть у животных была жирная, тонкая, редкая и взъерошенная. Животные группы Г4, получавшие ФПИ в дозе 5 г на 100 г корма, отличались повышенной агрессивностью.

Потребление корма животными всех групп представ­лено на рис. 2.

На протяжении всего эксперимента мыши, получав­шие ВЖВУ-рацион, достоверно меньше потребляли корма по сравнению с животными контрольной группы К1, получавшими стандартный рацион, что, вероятно, связано с большей калорийностью ВЖВУ-корма. При этом животные опытных групп Г3 и Г4 потребляли досто­верно меньше корма по сравнению с животными конт­рольной группы К2. Такой результат можно объяснить снижением аппетита на фоне потребления ФПИ.

На рис. 3 представлена кривая прироста массы тела животных.

Несмотря на большую потребляемость ВЖВУ-рациона животными контрольной группы К2, прирост массы тела животных этой группы до 77-х суток статистически значимо не отличался от прироста массы тела животных других групп. Также на данном этапе эксперимента не выявлено отличий по показателю прироста массы тела у животных, получавших стандартный рацион (группа К1), и животных, получавших ВЖВУ-рацион (все остальные группы). На 77-е сутки эксперимента статистически значимо выше по сравнению с группой контроля К1 была прибавка массы тела животных группы К2, получав­ших ВЖВУ-рацион. Полученный результат может сви­детельствовать о начале развития признаков ожирения у животных контрольной группы К2, получавших ВЖВУ-рацион, к 11-й неделе эксперимента. К 13-й неделе эксперимента разница между вышеуказанными группами оставалась значимой. При этом видно, что начиная с 10-й недели эксперимента прибавка массы тела жи­вотных контрольной группы К1 оставалась практически неизменной, тогда как поедаемость корма не снижа­лась. Животные всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, продолжали равномерно набирать массу тела, при этом ее прирост у животных групп Г3 и Г4, получавших ФПИ в различных дозировках, вплоть до 13-й недели статис­тически значимо не отличался от показателя контроль­ной группы К1.

На рис. 4 представлена динамика концентрации глю­козы в крови.

На 42-е сутки эксперимента (6-я неделя кормления) разница в концентрации глюкозы для всех групп нивели­ровалась, наметилась тенденция к увеличению концен­трации глюкозы в крови животных контрольной группы К2 и опытных групп Г3 и Г4. На 54-е сутки эксперимента концентрация глюкозы в крови животных контрольной группы К2 и животных опытных групп Г3 и Г4 статисти­чески значимо отличалась от таковой для животных кон­трольной группы К1, получавших стандартный рацион.

Выявленное различие говорит о развитии гипергликемии к 8-й неделе эксперимента на фоне приема животными ВЖВУ-рациона. На 91-е сутки эксперимента статисти­чески значимо выше концентрация глюкозы в крови была только у животных группы К2 по сравнению с таковой у животных группы К1. Концентрация глюкозы в крови животных опытных групп Г3 и Г4 от животных группы К1 достоверно не отличалась и, в отличие от группы К2, не только не продолжила расти, но и начала снижаться.

В табл. 3 представлены результаты ПГТТ и инсулино-резистентного теста.

Глюкозотолерантность

Из данных, представленных в табл. 3, следует, что у животных контрольной группы К1 показатель ППК оставался постоянным. На 40-е сутки эксперимента у животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, был отмечен рост ППК, причем у животных групп К2 и Г4 уве­личение было достоверным. На 82-е сутки эксперимента ППК только для животных группы Г3, получавших ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона, не отличалась статистически значимо от ППК для животных группы К1.

Инсулинорезистентность

Показатель ППК в тесте на инсулинорезистентность на 15-е и 45-е сутки был наименьшим у животных группы Г4, получавших ФПИ в дозе 5,0 г/100 г рациона. К 90-м суткам эксперимента у мышей всех опытных групп по­казатель ППК достоверно возрос по сравнению с конт­рольной группой К1.

Результаты физиологических тестов

Как видно из данных, представленных в табл. 4, при 1-м тестировании, проводимом на 40-е сутки кормления, не было отмечено достоверных различий между всеми группами по показателям общей активности: общему числу переходов между рукавами лабиринта и пройден­ной дистанции; время, проведенное в ОР и ЗР, между группами также достоверно не различалось.

При 2-м тестировании, проводимом на 90-е сутки кормления, отмечено статистически значимое сниже­ние показателей общей исследовательской активности: общего числа переходов у животных всех групп по сравнению с 1-м тестированием и общей пройденной дистанции у мышей из групп К1, К2, Г3 по сравнению с 1-м тестированием. Статистически значимое отли­чие по показателю пройденной дистанции не выяв­лено только для животных группы Г4, получавших ФПИ в дозе 5 г на 100 г рациона. По показателям тревож­ности не выявлено различий между группами в 1-м и во 2-м тестировании. Однако животные группы К2 проводили достоверно больше времени в ОР и досто­верно меньше в ЗР по сравнению с мышами контроль­ной группы К1 на 90-е сутки эксперимента. Полученный результат говорит о возможном снижении тревожности у животных контрольной группы К2 по сравнению с жи­вотными группы К1.

В табл. 5 представлены результаты выработки УРПИ на 49, 50 и 70-е сутки эксперимента.

Во время 1-го тестирования - выработки УРПИ живот­ные всех групп входили в темный отсек камеры (100% выработка рефлекса). На 2-е сутки тестирования крат­косрочной памяти статистически значимых различий во времени латентного входа в темную камеру животных всех групп не выявлено. Через 3 нед при тестировании долгосрочной памяти также не выявлено значимых раз­личий между группами.

Таким образом, полученные нами данные хорошо согласуются с результатами работы [9], в которой в опытах in vivo также с использованием мышей линии C57BL/6J было установлено выраженное гипогликемическое действие комплекса обезжиренной соевой муки с полифенолами сока черники. Этими же авторами было показано, что сорбция полифенолов на обезжиренной соевой муке повышала их устойчивость к разложению при высоких температурах и низких значениях pH [10]. Комплексная оценка стабильности разработанного ФПИ при различных условиях хранения составит предмет наших дальнейших исследований

Выводы

1. Потребление ВЖВУ-рациона животными группы К2 привело к развитию у них к 11-й неделе ожирения, харак­теризуемого статистически значимым увеличением массы тела по сравнению с животными контрольной группы К1, получавшей стандартный полусинтетический рацион. Вве­дение в рацион животных ФПИ (полифенольной пищевой матрицы) заметно снижало у них прибавку массы тела по сравнению с животными контрольной группы К2.

2. К 8-й неделе эксперимента выявлено статисти­чески значимое увеличение концентрации глюкозы в крови животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, по сравнению с контрольной группой К1. На 91-е сутки эксперимента эта разница оставалась значимой только для контрольной группы К2, что говорит о благоприятном гипогликемическом действии ФПИ в обеих дозировках.

3. К 8-й неделе эксперимента у животных контроль­ной группы К2 выявлено нарушение толерантности к глюкозе, что является одним из проявлений сахарного диабета 2 типа. Профилактическое введение в рацион животных группы Г3 ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона тор­мозило развитие симптомов данного заболевания.

4. Профилактическое введение в рацион животных группы Г4 высокой дозы ФПИ (5,0 г/100 г рациона) в определенной степени препятствовало увеличению инсулинорезистентности. Показатель ППК в тесте на инсулинорезистентность на 15-е и 45-е сутки был на­именьшим у группы Г4.

5. Введение в рацион функционального пищевого ингредиента не оказывало влияния на когнитивные функции животных, на краткосрочную и долгосрочную память.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутс­твие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-36-00041).

Литература

1. Мазо В.К., Сидорова Ю.С., Шипелин В.А., Петров Н.А., Кочеткова А.А. Полифенольные растительные экстракты: влияние на нарушения углеводного и липидного обмена у лабора­торных грызунов // Пробл. эндокринол. 2016. Т. 62, № 4. С. 38-44.

2. Тутельян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А. Растительные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов антидиабетического действия / под ред. В.А. Тутельяна, Т.Л. Киселевой, А.А. Кочетковой. М. : БИБЛИО-ГЛОБУС, 2016. 422 с.

3. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Comparative studies of antidiabetic activity of bilberry leaf extract in Wistar rats with STZ-induced diabetes and Zucker diabetic fatty rats // Int. Food Res. J. 2018. Vol. 25, N 3. P. 1288-1294.

4. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vaccinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats // Nutrition. 2017. Vol. 41. P. 107-112.

5. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B. et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activ­ity of a grape polyphenol-soybean flour complex // J. Agric. Food Chem. 2012. Vol. 60, N 36. P. 8860-8865. doi: 10.1021/ jf300232h.

6. Петров Н.А., Семин М.О. Разработка методики получения комп­лекса полифенолов экстракта листьев черники, сорбированных на белковом матриксе // Актуальные вопросы нутрициологии, биотехнологии и безопасности пищи : материалы Всероссийс­кой конференции молодых ученых с международным участием. М., 2017. С. 97-101.

7. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Саркисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценка обогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, 5. С. 46-55.

8. Valcheva-Kuzmanova S.V., Eftimov M.T., Tashev R.E., Belcheva I.P., Belcheva S.P. Memory effects of Aronia melanocarpa fruit juice in a passive avoidance test in rats // Folia Med. (Plovdiv). 2014. Vol. 56, N 3. P. 199-203.

9. Roopchand D.E., Kuhn P., Rojo L.E., Lila M.A., Raskin I. Blueberry polyphenol-enriched soybean flour reduces hyperglycemia, body weight gain and serum cholesterol in mice // Pharmacol. Res. 2013. Vol. 68, N 1. doi: 10.1016/j.phrs.2012.11.008.

10. Roopchand D.E., Grace M.H., Kuhn P., Cheng D.M., Plundrich N., Poulev A. et al. Efficient sorption of polyphenols to soybean flour enables natural fortification of foods // Food Chem. 2012. Vol. 131, N 4. P. 1193-1200. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.09.103.

References

1. Mazo V.K., Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Polyphenol plant extracts: the impact on carbohydrate and lipid metabolism disorders in laboratory animals. Problemy endokrinologii [Problems of Endocrinology]. 2016; 62 (4): 38-44. (in Russian)

2. Tutelyan V.A., Kiseleva T.L., Kochetkova A.A. Plant sources of phytonutrients for specialized food products with antidiabetic activity. In: V.A. Tutelyan, T.L. Kiseleva, A.A. Kochetkova (eds). Moscow: BIBLIO-GLOBUS, 2016: 422 p. (in Russian)

3. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Comparative studies of antidiabetic activity of bilberry leaf extract in Wistar rats with STZ-induced diabetes and Zucker diabetic fatty rats. Int Food Res J. 2018; 25 (3): 1288-94.

4. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vaccinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats. Nutrition. 2017; 41: 107-12.

5. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B., et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activity of a grape polyphenol-soybean flour complex. J Agric Food Chem. 2012; 60 (36): 8860-5. doi: 10.1021/jf300232h.

6. Petrov N.A., Semin M.O. The development of method for obtaining the complex of polyphenols from bilberry leaves extract, sorbed on protein matrix. In: Aktualnye voprosy nutritsiologii, biotehnologii i bezopsanosti pitschi materialy Vserossiiskoy konferentsii molodyh uchenyh s mezhdunarodnym uchastiem [Actual Problems of Nutri­tion, Biotechnology and Food Safety. The proceedings of Russian Conference for Young Scientists with International Participation]. Moscow, 2017: 97-101. (in Russian)

7. Sidorova Yu.S., Zorin S.N., Petrov N.A., Makarenko M.A., Sarkisyan V.A., Mazo V.K., et al. Physiological and biochemichal evalu­ation of enrichment the rats diet with docosahexaenoic acid and astaxanthin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (5): 46-55. (in Russian)

8. Valcheva-Kuzmanova S.V., Eftimov M.T., Tashev R.E., Belcheva I.P., Belcheva S.P. Memory effects of Aronia melanocarpa fruit juice in a passive avoidance test in rats. Folia Med (Plovdiv). 2014; 56 (3): 199-203.

9. Roopchand D.E., Kuhn P., Rojo L.E., Lila M.A., Raskin I. Blueberry polyphenol-enriched soybean flour reduces hyperglycemia, body weight gain and serum cholesterol in mice. Pharmacol Res. 2013; 68 (1). doi: 10.1016/j.phrs.2012.11.008.

10. Roopchand D.E., Grace M.H., Kuhn P., Cheng D.M., Plundrich N., Poulev A., et al. Efficient sorption of polyphenols to soybean flour enables natural fortification of foods. Food Chem. 2012; 131 (4): 1193-200. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.09.103.