Исследование лигнанов и антоцианинов как основных биологически активных веществ полифенольной природы плодов лимонника китайского

Резюме

Впервые изучены содержание и состав дибензоциклооктадиеновых лигнанов и антоцианинов в 10 образцах плодов китайского лимонника, собранных в Московской области, Хабаровском и Приморском краях. Профиль лигнанов определяли в соответствии с разработанной методикой высокоэффектив­ной жидкостной хроматографии с диодно-матричным спектрометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Была проведена валидация методики по показателям линейности, правильности и прецизионности. Во всех образцах обнаружены 11 характеристических для лимонника китай­ского лигнанов. В сушеных плодах основным лигнаном был схизандрин, в све­жезамороженных плодах - ангелоилгомизин O. Общее содержание лигнанов в свежезамороженных плодах составило 5,50 мг/г, в сушеных плодах варьи­ровало от 12,50 до 18,95 мг/г. Антоцианины лимонника китайского в основ­ном представлены гликозидами цианидина, среди которых преобладает циа-нидин-3-ксилозилрутинозид. Общее содержание антоцианинов, определенное с помощью рН-дифференциальной спектрофотометрии, составило от 0,21 мг/г в свежезамороженных плодах до 0,35-0,72 мг/г в сушеных плодах. Полученные результаты могут быть использованы для идентификации и стандартизации п лодов китайского лимонника и продуктов их переработки.

Ключевые слова:лимонник китайский, лигнаны, антоцианины, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 3. С. 79-87.

Плоды лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.] - вьющейся листопадной лианы семейс­тва лимонниковые (Schizandraceae) - являются бога­тым источником биологически активных веществ (БАВ). Наряду с использованием плодов лимонника (Fructus Schizandrae) в качестве лекарственного растительного сырья их также употребляют в пищу в виде соков, пюре, варенья, джемов и настоек. Сок лимонника применяют для винного букетирования. В качестве вкусоароматического ингредиента плоды лимонника добавляют в чай. Сушеные плоды и экстракты лимонника используют при производстве специализированных пищевых продуктов, в том числе для питания спортсменов.

В результате ряда фитохимических исследований из плодов лимонника были выделены и идентифициро­ваны различные БАВ, такие как лигнаны, полисахариды, флавоноиды, в частности антоцианины, эфирные масла, органические кислоты, витамины [1]. Основной и наибо­лее характеристической группой БАВ для растений се­мейства лимонниковые являются лигнаны. В растениях рода лимонник присутствуют 5 классов лигнанов: дибензоциклооктадиеновые (тип А), спиробензофураноидные дибензоциклооктадиеновые (тип В), 4-арилтетралино-вые (тип С), 2,3-диметил-1,4-диарилбутановые (тип D) и 2,5-диарилтетрагидрофурановые (тип Е) [2]. Однако наибольшей биологической активностью обладают дибензоцикооктадиеновые лигнаны (рис. 1), которые в свою очередь могут подразделяться на 2 типа в за­висимости от стереоструктуры: R- или S-бифенильной конфигурации. Кроме того, циклооктеновые кольца этих лигнанов представлены в виде конформаций твист-ванна-кресло или твист-ванна. Множество хиральных особенностей и стереоизомеров приводит к образова­нию очень сложных структур соединений данного типа.

Фармакологические исследования показали, что экс­тракты и настойки лимонника оказывают гепатопротекторное, антиоксидантное, нейропротекторное, неспеци­фическое общеукрепляющее (адаптогенное) действие, повышают остроту зрения, особенно ночного [1-3]. В случае использования плодов лимонника китайского значимый вклад в биологическую активность вносят антоцианины, наличие которых также является одним из критериев подлинности [4].

Цель данной работы - определение содержания и со­става основных дибензоциклооктадиеновых лигнанов и антоцианинов плодов лимонника китайского.

Материал и методы

Изучено 10 образцов плодов лимонника китайского, произрастающих в Московской области и Дальневос­точном регионе (табл. 1).

Профиль лигнанов и антоцианинов в лимоннике ис­следовали c использованием системы жидкостной хро­матографии Agilent 1100 ("Agilent Technologies", США), оснащенной дегазатором, бинарным насосом, термо­статом колонок, термостатируемым автосамплером, спектрофотометрическим диодно-матричным детекто­ром (ДМД) и времяпролетным масс-селективным детек­тором Agilent 6210 LC/MS-TOF (ВЭЖХ-МС-TOF). Суммар­ное содержание антоцианинов определяли с помощью спектрофотометра Shimadzu 1800 ("Shimadzu", Япония) с диапазоном длин волн 190-1100 нм.

Для определения содержания и состава лигнанов была разработана оригинальная ВЭЖХ-методика с ДМД и МС. Условия ВЭЖХ: колонка ProteCol C18 НРН125 250x4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза: 0,1% раствор мура­вьиной кислоты (А), ацетонитрил (В); линейный гради­ент: 0 мин - 50% В, 50 мин - 95% В, 51-60 мин - 50% В; скорость потока растворителя 0,5 см3/мин, температура колонки 25 °С, температура автосамплера 20 °С, объем вводимой пробы 10 мм3; детектирование при λ=254 нм и λ=235 нм. Спектры снимали в диапазоне от 190 до 400 нм. Параметры масс-спектрометрии: напряжение на капилляре - 3,5 кВ, поток газа-осушителя (азот) - 9 дм3/мин, температура - 325 °С, давление на рас­пылителе - 0,27 МПа, сканирование масс - в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне от 100 до 1500 m/z.

Подготовка проб: около 3,0 г измельченных заморо­женных плодов лимонника или около 1,0 г измельченных сушеных плодов лимонника помещали в круглодонную колбу объемом 100 см3, добавляли 80 см3 70% этанола и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем обрабатывали на ультразвуковой (УЗ) бане Codyson CD-4820 ("Shenzhen Codyson Electrical Co., Ltd.", Китай) при комнатной тем­пературе в течение 5 мин, охлаждали до комнатной температуры, перемещали в мерную колбу объемом 100 см3, доводили объем 70% этанолом. 1,5-2 см3 из­влечения помещали в центрифужную пробирку и цент­рифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5424 ("Eppendorf", Германия) при 15 000 об./мин в течение 10 мин.

Количественную оценку содержания лигнанов в пло­дах лимонника осуществляли методом внешнего стан­дарта.

Стандартный раствор схизандрина (схизандрол А, ≥98,0%, "ZHONGXIN INNOVA®", Китай) (0,98 мг/см3) готовили в метаноле, помещая на 3 мин в УЗ-баню. Рабочие растворы получали путем разбавления в 2, 10, 100 и 1000 раз. Все растворы хранили в холодильнике при температуре +4 °С.

Суммарное содержание мономерных антоцианинов определяли рН-дифференциальным методом, под­готовку проб осуществляли по методике, описанной ранее [5]. Профиль антоцианинов определяли по разра­ботанной нами ранее методике [6].

Результаты и обсуждение

Лигнаны

В исследованных образцах обнаружено более 20 ин­дивидуальных лигнанов, среди которых выделяют 11 ос­новных и наиболее характеристичных лигнанов (рис. 2), по содержанию которых фармакопейный вид лимонника Schizandra chinensis (Turcz.) Baill. (Bei-Wuweizi, северный лимонник) можно отличить от нефармакопейного вида Schizandra sphenanthera Rehd. et Wils. (Nan-Wuweizi, южный лимонник) [7, 8].

Типичные хроматограммы извлечения из плодов ли­монника китайского изображены на рис. 3.

Номера пиков 11 основных лигнанов и ангелоилгомизина О на хроматограмме соответствуют их номерам в табл. 2 и на рис. 3.

Времена удерживания, УФ-максимумы и результаты масс-спектрометрического анализа 11 основных лигнанов лимонника представлены в табл. 2.

Были определены некоторые валидационные характе­ристики разработанной методики определения лигнанов.

Линейность. В подобранных хроматографических условиях были трижды введены рабочие растворы схизандрина в 5 концентрациях. Калибровочная кри­вая концентрации схизандрина (мг/см3) от площади пика (мА) имела линейный характер (у=23592х+42,195; RI=0,9999).

Правильность и прецизионность. Для оценки правиль­ности и внутрилабораторной прецизионности методики были проанализированы стандартные растворы схизандрина с низкой (0,0098 мг/см3), средней (0,098 мг/см3) и вы­сокой (0,490 мг/см3) концентрациями и рассчитано отно­сительное стандартное отклонение (RSD). Правильность определяли по результатам 6 параллельных измерений рабочих растворов схизандрина. Среднее значение было использовано для расчета RSD. Промежуточная преци­зионность определялась повторным анализом тех же растворов один раз в день в течение 5 дней.

Относительное стандартное отклонение повторяе­мости для низкой концентрации составило 0,53%, для средней - 0,33%, для высокой - 0,15%. Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизион­ности для низкой концентрации было 0,51%, для сред­ней - 0,30%, для высокой - 0,25%.

Результаты исследования содержания схизандрина представлены в табл. 3. Ошибка определения по резуль­татам 3 параллельных исследований для всех лигнанов не превышала 7,2%.

В сушеных плодах лимонника (образцы № 2-10) пре­обладал схизандрин (25,7-37,2% от суммы лигнанов), количество которого варьировало от 3,59 до 6,22 мг/г (см. табл. 3). В свежезамороженных плодах лимонника в качестве основного лигнана был найден ангелоилгомизин О - 1,05 мг/г (24,7% от суммы лигнанов), а содер­жание схизандрина составило 0,99 мг/г (18,0% от суммы лигнанов). Во всех образцах, кроме № 2 и 3, обнару­жено относительно высокое содержание схизандрина В (14,8-24,2% от суммы лигнанов) - 1,05-3,34 мг/г. Все образцы, за исключением образца № 2, отличаются достаточно высоким количеством гомизина А - от 0,39 мг/г в свежих плодах до 0,79-1,98 мг/г в сушеных (4,7-12,9% от суммы лигнанов). К другим мажорным лигнанам относятся схизандрин А, схизандрин С и ангелоилгомизин Н. Схизандрин А был найден в исследо­ванных образцах в количестве 0,26-1,76 мг/г (4,7-9,3% от суммы лигнанов). Относительно высокое содержа­ние схизандрина С отмечено в образцах № 3 и 8-10 -1,11-1,20 мг/г (6,8-8,6% от суммы лигнанов). Наиболее высоким содержанием ангелоилгомизина Н отличались образцы № 5-10 - 0,81-1,09 мг/г (4,6-6,8% от суммы лигнанов).

В умеренных количествах в образцах лимонника об­наружены γ-схизандрин, схизантерин В и гомизин J. В замороженных плодах выявлено 0,24 мг/г γ-схизанд-рина, в сушеных - 0,45-0,77 мг/г. Содержание схизантерина В варьировало от 0,18 мг/г в образце № 1 до 0,43-0,72 мг/г в образцах № 2-10. Количество гоми-зина J в образце № 1 составило 0,10 мг/г, в сушеных образцах - 0,24-0,55 мг/г.

Меньше других основных лигнанов в исследуемых образцах было схизантерина А и гомизина G - 0,05-0,24 и 0,14-0,30 мг/г соответственно.

Суммарное содержание лигнанов в свежих плодах составило 5,50 или 550 мг/100 г, в сушеных - 12,50­18,95 мг/г.

Антоцианины

Впервые был определен профиль индивидуальных антоцианинов плодов лимонника китайского, произ­растающих в Московской области, Хабаровском и Приморском краях. Типичная хроматограмма антоцианинов лимонника изображена на рис. 4. Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС антоцианинов лимонника представлены в табл. 4.

Профиль антоцианинов в образцах лимонника отра­жен в табл. 5. Исследуемые образцы имели одинаковый профиль антоцианинов с выраженным преобладанием цианидин-3-ксилозилрутинозида (78,5-87,5% от общего содержания антоциановых пигментов) и в замороженных, и в сушеных плодах. Среди минорных антоцианинов идентифицированы 3-латирозид-5-глюкозиды, 3,5-диглю-козиды, 3-латирозид-5-ксилозиды, и 3-латирозиды цианидина, а также 3-рутинозиды цианидина и пеларгонидина.

Суммарное содержание антоцианинов в свежезамо­роженных плодах лимонника (образец № 1) составило 0,21 мг/г, что соответствует их содержанию в пло­дах лимонника китайского, заготовленного в Китае, -0,15-0,23 мг/г [9, 10], в высушенных плодах - от 0,35 до 0,72 мг/г.

Заключение

Полученные данные о количестве и профиле лигнанов и антоцианинов могут быть использованы при хемотаксономической идентификации и стандартизации плодов лимонника китайского, а также для оценки био­логической ценности лимонника в качестве сырья для производства специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище.

Финансирование. Исследование выполнено при фи­нансовой поддержке Российского научного фонда (про­ект № 14-36-00041).

Литература

1. Hwang D.Y. Chapter 20. Therapeutic effects of lignans and blend isolated from Schisandra chinesis on hepatic carcinoma // Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine / ed. H. Kuang. 2012. P. 389-402.

2. Panossian A., Wikman G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of Russian research and uses in medicine // J. Ethnopharmacol. 2008. Vol. 118. P. 183-212.

3. Szopa A., Ekiert R., Ekiert H. Current knowledge of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Chinese magnolia vine) as a medicinal plant species: a review on the bioactive components, pharmacological properties, analytical and biotechnological studies // Phytochem. Rev. 2017. Vol. 16. P. 195-218.

4. Jo S.-H., Ha K.-S., Moon K.-S. et al. In vitro and in vivo anti-hyper-glycemic effects of omija (Schizandra chinensis) fruit // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 1359-1370.

5. Перова И.Б., Жогова А.А., Черкашин А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества плодов калины обыкновенной // Хим.-фарм. журн. 2014. Т. 48, № 5. С. 32-39.

6. Перова И.Б., Жогова А.А., Полякова А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества кизи­ла (Cornus mas L.) // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 86-93.

7. American Herbal Pharmacopoeia. Schisandra Berry, Shisandra Chinensis. Analytical, Quality Control, and Therapeutic Monograph / ed. R. Upton. Santa Crus, 1999. P. 1-23.

8. Lu Y., Chen D.-F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera // J. Chromatogr. A. 2009. Vol. 1216. P. 1980-1990.

9. Ma C., Yang L., Yang F. et al. Content and color stability of anthocyanins isolated from Schisandra chinensis fruit // Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13. P. 14 294-14 310.

10. Wu X., Yu X., Jing H. Optimization of phenolic antioxidant extraction from Wuweizi (Schisandra chinensis) pulp using random-centroid optimazation methodology // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 6255-6266.