Уровень обеспечения организма человека и животных поступающими с пищей биологически активными веществами оказывает выраженное влияние на его метаболический и физиологический статус [1-3]. Общеизвестна роль йода в синтезе тироксина и трийодтиронина, а также зависимость образования этих гормонов щитовидной железы от снабжения организма йодом [4-8]. Соединения йода, которые могут служить источниками этого микроэлемента для организма, можно разделить на вещества неорганической природы, диссоциирующие с образованием йодид- и йодат-ионов, и органические соединения, в которых йод связан ковалентно с органической матрицей, чаще всего с аминокислотами, например с тирозином [9]. В ходе эволюции у животных и человека выработалась сложная и эффективная система по обеспечению организма йодом [10-13]. Считается, что в щитовидную железу йод может поступать только в форме йодид-иона, поскольку именно за счет окисления йодида в более реакционно-способную форму происходит йодирование тирозиновых остатков в молекуле тиреоглобулина [14]. Ковалентно связанный йод, поступая через пищеварительный тракт в печень, под действием ферментов отщепляется от органического носителя и в виде йодида поступает в системный кровоток и в щитовидную железу [9]. Данное утверждение основано на том, что печень способна метаболизировать йодсодержащие соединения путем дейодирования [15]. Однако щитовидная железа также содержит микросомальную дегалогеназу, которая катализирует дейодирование моно- и дийодтирозина, образующихся при протеолизе тиреоглобулина [16, 17]. Таким образом, высказываемое многими исследователями мнение о главной регулирующей роли дегалогеназ печени в усвоении и метаболизме органического йода сильно упрощено и спорно. Для правильного понимания процесса обмена органического йода в организме животных и человека необходимо проведение исследований для уточнения основных физиолого-биохимических механизмов усвоения и метаболизма ковалентно связанного йода.
Цель данной работы - сравнительное изучение в опытах на крысах метаболизма йодтирозинов, входящих в состав йодированных молочных белков либо образующихся при введении йодида калия.
Материал и методы
При выполнении работы были использованы экспериментальный йодированный молочный белок (ЭБ) (ООО "Фонд развития науки", РФ) [18], йодированный молочный белок "Йодказеин" (ЙК) (ООО "НПК Медбиофарм", РФ) [19], а также йодид калия (ПАО "НПО "Йодобром", РФ). В ЭБ матрицей для йодирования выступают сывороточные белки, в ЙК - казеин. Основной ароматической аминокислотой, вступающей с йодом в реакцию замещения, при производстве обоих йодированных молочных белков является тирозин. Гидроксил тирозина, связанный с ароматическим кольцом, представляет собой сильнейший орто-пара-ориентант, особенно в щелочной среде. Валентные электроны атома кислорода оказываются частично рассредоточенными в орто-положения бензольного ядра, и тем самым создаются условия для прохождения реакции электрофильного замещения. Йод встраивается в молекулу тирозина, образуя прочную связь с углеродом, и одновременно приобретает положительную степень окисления Результатом взаимодействия йодирующего агента с тирозином является образование как моно-, так и дийодпроизводного (монойодтирозин и дийодтирозин соответственно).
Проведенное исследование структуры и подлинности йодированных молочных белков подтвердили наличие в их составе моно- и дийодтирозинов. Характеристика йодированных молочных белков представлена в табл. 1.
Исследование проведено на крысах линии Вистар возрастом 8-10 нед, полученных из лицензированного источника (филиал "Андреевка" ФГБНУ "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России). Поступивших животных до начала эксперимента содержали в течение 5 дней в карантинной комнате для адаптации при групповом содержании в клетках. Содержание грызунов и все манипуляции с ними проводили в условиях вивария ФГБНУ "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН с учетом существующих этических норм и правил в строгом соответствии с протоколом исследований и действующей нормативной документацией [20-22]. Животных размещали группами по 6 особей в пластиковых клетках ("TECNIPLAST", Италия) тип IV S на подстилке из мелкой древесной стружки при свободном доступе к воде и пище. Для кормления использовали стандартный полнорационный комбикорм по ГОСТ Р 50258 (ООО "Лабораторкорм", РФ). В качестве питья крысы получали водопроводную воду. Корм и воду животные получали ad libitum.
После прохождения карантина животных произвольно распределяли на 4 группы: 1-я группа состояла из интактных крыс (n=16); 2-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЭБ; 3-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЙК; крысам (n=12) 4-й группы вводили йодид калия. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде водных растворов однократно. Дозировки составили для ЭБ - 1500 мкг/кг; для ЙК -429 мкг/кг; для йодида калия - 39 мкг/кг, что соответствует 30 мкг йода на 1 кг массы тела (эквивалент 300 мкг йода в сутки для человека средней массой тела 60 кг с учетом коэффициента межвидового переноса доз, равного 6). После введения препаратов животные подвергались пищевой депривации не более чем на 24 ч.
Перед введением исследуемых образцов, через 1, 4 и 24 ч после введения по 4 животных из каждой группы подвергали эвтаназии в СО2-камере ("VetTech", Великобритания) и отбирали биологический материал. Плазму крови для определения йодтирозинов хранили при -30 С°. Содержание моно- и дийодтирозина в плазме крови крыс определяли методом высокоэффетивной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором по ГОСТ 33422-2015 [23]; содержание тирозина определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе LC 3000 ("Eppendorf - Biotronilc", Германия).
Результаты исследований обрабатывали параметрическими методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей [24]. Для расчета достоверности различий двух выборок при уровне значимости р<0,05 определяли среднее арифметическое (M), среднее квадратичное отклонение (σ), коэффициент вариации (V), среднюю ошибку средней арифметической (m).
Результаты и обсуждение
Метаболизм аминокислот в организме животных начинается с их высвобождения из белков пищи в ходе протеолиза последних в желудочно-кишечном тракте. Свободные аминокислоты быстро всасываются в кишечнике, попадают в портальную систему и, следовательно, в печень [19].
Возможно 2 пути пресистемного метаболизма йодтирозинов, образующихся при протеолизе йодированных молочных белков. Первый путь связан с дейодированием йодтирозинов под действием дегалогеназ печени с образованием тирозина и йодид иона. Второй путь предполагает поступление в системный кровоток неизмененных моно- и дийодтирозина. В первом случае с течением времени в крови должна увеличиваться концентрация только тирозина, во втором - будет расти концентрация как тирозина (поскольку он входит в состав йодированных молочных белков), так и йодтирозинов.
С целью установления особенностей биотрансформации йодтирозинов при первичном прохождении печени определяли их концентрацию, а также концентрацию тирозина в плазме крови крыс после однократного введения йодированных белков. Для сравнения параллельно животные 4-й группы получали йодид калия. Результаты представлены в табл. 2.
Проведенная оценка содержания моно-, дийодтирозина и тирозина в плазме крови крыс контрольной группы в течение 24 ч не выявила значимых изменений концентрации указанных аминокислот в различные временные интервалы, что свидетельствует об относительно постоянном уровне данных соединений в крови животных.
Из данных табл. 2 видно, что через 1 ч после введения препаратов наблюдалось увеличение по сравнению с контролем концентрации монойодтирозина в крови крыс только 3-й группы (на 40,8%), уровни дийодтирозина и тирозина у всех опытных животных были сопоставимы с показателями крыс контрольной группы.
Через 4 ч после введения исследуемых субстанций концентрация монойодтирозина у животных 2-й группы выросла в 8,6 раза, 3-й группы - в 6,9 раза, в 4-й группе не изменилась. Концентрация дийодтирозина увеличилась только у крыс 2-й группы (в 7,1 раза). В 3-й группе, хотя и наблюдалось увеличение концентрации дийодтирозина, значимых отличий не установлено. Уровень тирозина изменился в сторону увеличения только у животных 2-й группы (на 28%), у животных других групп он соответствовал контролю.
Через 24 ч после однократного введения йодированных белков концентрация монойодтирозина у животных 2-й и 3-й групп хотя и снизилась по сравнению с показателем после 4 ч, по-прежнему превышала контрольный уровень в 3,6 и 3,2 раза соответственно. Выше контрольного значения был уровень монойодтирозина и в 4-й группе на 35,3%. Концентрация дийодтирозина у крыс 2-й группы уменьшилась по отношению к 4 ч, но все равно была выше, чем в контроле, в 3,9 раза. В 3-й и 4-й группах по этому показателю различий с контролем не установлено. Содержание тирозина было одинаково во всех экспериментальных группах.
Анализ полученных данных показывает, что введение в организм животных ЭБ приводит к значительному увеличению концентрации в крови как монойодтирозина, так и дийодтирозина. Более высокая концентрация в плазме монойодтирозина по сравнению с дийодтирозином соответствует содержанию аминокислот в йодированном белке: 1,32% монойодтирозина и 0,64% дийодтирозина. Максимальная концентрация йодированных аминокислот (из зафиксированных) была установлена через 4 ч после поступления в организм животных ЭБ. В этот же временной интервал наблюдается увеличение концентрации тирозина. Эти данные согласуются с тем, что время переваривания сывороточных белков молока составляет 2-3 ч. Соответственно, по истечении этого времени концентрация аминокислот в крови будет максимальной, а затем начнет снижаться, что и подтверждается полученными результатами. Одновременное присутствие в плазме крови тирозина и его йодированных производных может свидетельствовать о том, что моно- и дийодтирозин способны поступать в системный кровоток без метаболических превращений в печени.
При введении животным ЙК в плазме крови наблюдался рост концентрации только монойодтирозина. Казеин переваривается дольше, чем сывороточные белки: время переваривания казеина составляет порядка 6 ч. Измерение показателей осуществлялось через 1, 4 и 24 ч после приема йодированного белка, что, возможно, не позволило зафиксировать изменения концентрации тирозина и дийодтирозина. Можно предположить, что монойодтирозин, находясь на поверхности белковой молекулы, легче и быстрее высвобождается из состава белка. Наличие в крови монойодтирозина в высокой концентрации подтверждает возможность поступления в системный кровоток йодированных аминокислот.
Некоторое увеличение в крови концентрации монойодтирозина через 24 ч после введения йодида калия можно объяснить более активным синтезом тиреоидных гормонов после поступления повышенного количества йода в виде йодид-иона в щитовидную железу. Моно- и дийодтирозины образуются в железе при протеолизе тиреоглобулина и могут поступать в кровоток вместе с гормонами.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что при однократном введении йодированных молочных белков, содержащих йодированные аминокислоты, в плазме крови крыс значительно повышаются концентрации моно- и дийодтирозина. Это свидетельствует о том, что йодтирозины при первом прохождении через печень могут не подвергаться биотрансформации и поступать в системный кровоток в неизмененном виде. Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют имеющиеся представления о путях пресистемного метаболизма органических соединений йода.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
1. Kim H.J., Kim N.K., Park H.K. et al. Strong association of relatively low and extremely excessive iodine intakes with thyroid cancer in an iodinereplete area // Eur. J. Nutr. 2017. Vol. 56, N 3. P. 965-971. doi:10.1007/ s00394-015-1144-2.
2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Анализ отечественного и международного опыта использования обогащенных витаминами пищевых продуктов // Вопр. питания. 2016. № 2. С. 31-50.
3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник Д.В., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 113-124.
4. Bost M., Martin A., Orgiazzi J. Iodine deficiency: epidemiology and nutritional prevention // Trace Elem. Med. 2014. Vol. 15, N 4. P. 3-7.
5. Carvalho D.P., Dupuy C. Thyroid hormone biosynthesis and release // Mol. Cell. Endocrinol. 2017. Vol. 458. P. 6-15.
6. Di Jeso B., Arvan P. Thyroglobulin from molecular and cellular biology to clinical endocrinology // Endocr. Rev. 2016. Vol. 37, N 1. P. 2-36. doi: 10.1210/er.2015-1090.
7. Targovnik H.M, Citterio C.E, Rivolta C.M. Iodide handling disorders (NIS, TPO, TG, IYD) // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2017. Vol. 31, N 2. P. 195-212. doi: 10.1016/j.beem.2017.03.006. Epub 2017 Apr 4.
8. WHO. World Health Organization, United Nations Children's Fund &International Council for the Control of Iodine Deficiency Disorders. Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination. A guide for programme managers. 3rd ed. Geneva : World Health Organization, 2007. URL: http://whqlibdoc.who.int/publica-tions/2007/9789241595827_eng.pdf.
9. Применение йодказеина для предупреждения йоддефицитных заболеваний в качестве средства популяционной,групповой и индивидуальной профилактики йодной недостаточности : методические рекомендации. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 12 c.
10. Dohan O., De la Vieja A., Paroder V., Riedel C., Artani M., Reed M. et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation and medical significance // Endocr. Rev. 2003. Vol. 24. P. 48-77.
11. Toth G., Noszal B. Thyroid hormones and their precursors I. Biochemical properties // Acta Pharm. Hung. 2013. Vol. 83, N 2. P. 35-45.
12. Rodriguez A-M., Perron B., LaCroix L. Identification and characterization of a putative human iodide transporter located at the apical membrane of thyrocytes // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 87. P. 3500-3503.
13. Portulano C., Paroder-Belenitsky M., Carrasco N. The Na+/I-symporter (NIS): mechanism and medical impact // Endocr. Rev. 2014. Vol. 35. P. 106-149.
14. de Vijlder J.J.M. Primary congenital hypothyroidism: defects in iodine pathways // Eur. J. Endocrinol. 2003. Vol. 149. P. 247-256.
15. Трошина Е. А. К вопросу о недостатке и избытке йода в организме человека // Клин. и экспер. тиреоидология. 2010. № 4. С. 9-16.
16. Larsen P.R., Zavacki A.M. The role of the iodothyronine deiodinases in the physiology and pathophysiology of thyroid hormone action // Eur. Thyroid J. 2012. Vol. 1. P. 232-242.
17. Ruf J., Carayon P. Structural and functional aspects of thyroid peroxidase // Arch. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 445. P. 269-277.
18. Люблинский С.Л., Савчик С.А., Смирнов С.В. Способ получения биологически активной добавки к пище. Пат. РФ № 2212155, 2002.
19. Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Скворцов В.Г., Клепов А.Н., Скобелев И.В., Ус П.П. и др. Средство для регулирования йодного обмена или профилактики йоддефицитных состояний. Пат. РФ № 2151611, 2000.
20. ГОСТ 31886-2012. Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP). Применение принципов GLP к краткосрочным исследованиям. М. : Стандартинформ, 2013. 10 с.
21. ГОСТ 33044-2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. М. : Стандартинформ, 2015. 12 с.
22. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington, DC : National Academy Press, 1996. URL: http://dx.doi.org/10.17226/10498.
23. ГОСТ 33422-2015. Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. М. : Стандартинформ, 2016. 10 с.
24. Гланц С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. М. : Практика, 1998. 459 с.