Исследование метаболизма йодтирозинов, входящих в состав молочного йодированного белка, у крыс

Резюме

В ходе эволюции у животных и человека выработалась сложная и эффективная система по обеспечению организма йодом в виде различных органических и неор­ганических соединений. Метаболизм неорганического йода изучен достаточно хорошо, в отличие от механизма усвоения его органических соединений. Среди последних особый интерес вызывают йодтирозины, входящие в состав йодиро­ванных молочных белков. С целью установления особенностей биотрансформа­ции йодтирозинов в организме животных определяли их концентрацию, а также концентрацию тирозина в плазме крови крыс линии Вистар возрастом 8-10 нед после однократного введения йодированных молочных белков. Для сравнения параллельно группа животных получала йодид калия. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде водных растворов в дозе, эквивалент­ной 30 мкг йода на 1 кг массы тела. Содержание моно- и дийодтирозина в плазме крови крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хромато­графии с масс-спектрометрическим детектором, тирозина - на автомати­ческом аминокислотном анализаторе. Показатели регистрировали до введения и через 1, 4 и 24 ч после введения препаратов. В ходе проведенных исследований установлено, что при однократном введении йодированных молочных белков в плазме крови крыс наблюдается значительное увеличение концентраций моно- и дийодтирозина. Максимальный уровень йодированных аминокислот, превы­шающий контрольные значения более чем в 6 раз, зафиксирован через 4 ч после поступления в организм животных йодсодержащих органических соединений. В этот же временной интервал в одной из экспериментальных групп, получавшей йодированный молочный белок, наблюдалось увеличение концентрации тирозина. Одновременное присутствие в плазме крови тирозина и его йодиро­ванных производных может свидетельствовать о том, что моно- и дийодтирозин способны поступать в системный кровоток без метаболических превраще­ний в печени. При введении йодида калия увеличение в крови крыс концентрации монойодтирозина на 35% по сравнению с контролем наблюдалось только через 24 ч, что может быть следствием активизации работы щитовидной железы за счет поступления повышенного количества йода.

Ключевые слова:йод, молочный йодированный белок, метаболизм йодтирозинов, крысы

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 3. С. 12-17. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10026.

Уровень обеспечения организма человека и живот­ных поступающими с пищей биологически актив­ными веществами оказывает выраженное влияние на его метаболический и физиологический статус [1-3]. Общеизвестна роль йода в синтезе тироксина и трийодтиронина, а также зависимость образования этих гормонов щитовидной железы от снабжения организма йодом [4-8]. Соединения йода, которые могут служить источниками этого микроэлемента для организма, можно разделить на вещества неоргани­ческой природы, диссоциирующие с образованием йодид- и йодат-ионов, и органические соединения, в которых йод связан ковалентно с органической матрицей, чаще всего с аминокислотами, например с тирозином [9]. В ходе эволюции у животных и чело­века выработалась сложная и эффективная система по обеспечению организма йодом [10-13]. Считается, что в щитовидную железу йод может поступать толь­ко в форме йодид-иона, поскольку именно за счет окисления йодида в более реакционно-способную форму происходит йодирование тирозиновых остат­ков в молекуле тиреоглобулина [14]. Ковалентно свя­занный йод, поступая через пищеварительный тракт в печень, под действием ферментов отщепляется от органического носителя и в виде йодида поступает в системный кровоток и в щитовидную железу [9]. Данное утверждение основано на том, что печень спо­собна метаболизировать йодсодержащие соединения путем дейодирования [15]. Однако щитовидная желе­за также содержит микросомальную дегалогеназу, которая катализирует дейодирование моно- и дийодтирозина, образующихся при протеолизе тиреоглобулина [16, 17]. Таким образом, высказываемое многими исследователями мнение о главной регулирующей роли дегалогеназ печени в усвоении и метаболиз­ме органического йода сильно упрощено и спорно. Для правильного понимания процесса обмена органи­ческого йода в организме животных и человека необходимо проведение исследований для уточнения основ­ных физиолого-биохимических механизмов усвоения и метаболизма ковалентно связанного йода.

Цель данной работы - сравнительное изучение в опытах на крысах метаболизма йодтирозинов, вхо­дящих в состав йодированных молочных белков либо образующихся при введении йодида калия.

Материал и методы

При выполнении работы были использованы экс­периментальный йодированный молочный белок (ЭБ) (ООО "Фонд развития науки", РФ) [18], йодирован­ный молочный белок "Йодказеин" (ЙК) (ООО "НПК Медбиофарм", РФ) [19], а также йодид калия (ПАО "НПО "Йодобром", РФ). В ЭБ матрицей для йодиро­вания выступают сывороточные белки, в ЙК - казеин. Основной ароматической аминокислотой, вступающей с йодом в реакцию замещения, при производстве обоих йодированных молочных белков является тирозин. Гидроксил тирозина, связанный с ароматическим кольцом, представляет собой сильнейший орто-пара-ориентант, особенно в щелочной среде. Валентные электроны атома кислорода оказываются частично рассредоточен­ными в орто-положения бензольного ядра, и тем самым создаются условия для прохождения реакции электрофильного замещения. Йод встраивается в молекулу тирозина, образуя прочную связь с углеродом, и одно­временно приобретает положительную степень окис­ления Результатом взаимодействия йодирующего агента с тирозином является образование как моно-, так и дийодпроизводного (монойодтирозин и дийодтирозин соответственно).

Проведенное исследование структуры и подлинности йодированных молочных белков подтвердили наличие в их составе моно- и дийодтирозинов. Характеристика йодированных молочных белков представлена в табл. 1.

Исследование проведено на крысах линии Вистар возрастом 8-10 нед, полученных из лицензированного источника (филиал "Андреевка" ФГБНУ "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России). Поступив­ших животных до начала эксперимента содержали в те­чение 5 дней в карантинной комнате для адаптации при групповом содержании в клетках. Содержание грызунов и все манипуляции с ними проводили в условиях вивария ФГБНУ "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН с учетом существующих эти­ческих норм и правил в строгом соответствии с протоколом исследований и действующей нормативной документацией [20-22]. Животных размещали группами по 6 особей в пластиковых клетках ("TECNIPLAST", Ита­лия) тип IV S на подстилке из мелкой древесной стружки при свободном доступе к воде и пище. Для кормления использовали стандартный полнорационный комбикорм по ГОСТ Р 50258 (ООО "Лабораторкорм", РФ). В качес­тве питья крысы получали водопроводную воду. Корм и воду животные получали ad libitum.

После прохождения карантина животных произвольно распределяли на 4 группы: 1-я группа состояла из интактных крыс (n=16); 2-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЭБ; 3-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЙК; крысам (n=12) 4-й группы вводили йодид калия. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде водных растворов однократно. Дозировки составили для ЭБ - 1500 мкг/кг; для ЙК -429 мкг/кг; для йодида калия - 39 мкг/кг, что соответс­твует 30 мкг йода на 1 кг массы тела (эквивалент 300 мкг йода в сутки для человека средней массой тела 60 кг с учетом коэффициента межвидового переноса доз, равного 6). После введения препаратов животные под­вергались пищевой депривации не более чем на 24 ч.

Перед введением исследуемых образцов, через 1, 4 и 24 ч после введения по 4 животных из каждой группы подвергали эвтаназии в СО2-камере ("VetTech", Ве­ликобритания) и отбирали биологический материал. Плазму крови для определения йодтирозинов хранили при -30 С°. Содержание моно- и дийодтирозина в плазме крови крыс определяли методом высокоэффетивной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором по ГОСТ 33422-2015 [23]; содержание тирозина определяли на автоматическом аминокис­лотном анализаторе LC 3000 ("Eppendorf - Biotronilc", Германия).

Результаты исследований обрабатывали пара­метрическими методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента для несвязан­ных совокупностей [24]. Для расчета достоверности различий двух выборок при уровне значимости р<0,05 определяли среднее арифметическое (M), среднее квадратичное отклонение (σ), коэффициент вариации (V), среднюю ошибку средней арифметической (m).

Результаты и обсуждение

Метаболизм аминокислот в организме животных на­чинается с их высвобождения из белков пищи в ходе протеолиза последних в желудочно-кишечном тракте. Свободные аминокислоты быстро всасываются в ки­шечнике, попадают в портальную систему и, следова­тельно, в печень [19].

Возможно 2 пути пресистемного метаболизма йодтирозинов, образующихся при протеолизе йодированных молочных белков. Первый путь связан с дейодированием йодтирозинов под действием дегалогеназ печени с образованием тирозина и йодид иона. Второй путь предполагает поступление в системный кровоток не­измененных моно- и дийодтирозина. В первом случае с течением времени в крови должна увеличиваться кон­центрация только тирозина, во втором - будет расти кон­центрация как тирозина (поскольку он входит в состав йодированных молочных белков), так и йодтирозинов.

С целью установления особенностей биотрансформа­ции йодтирозинов при первичном прохождении печени определяли их концентрацию, а также концентрацию ти­розина в плазме крови крыс после однократного введе­ния йодированных белков. Для сравнения параллельно животные 4-й группы получали йодид калия. Результаты представлены в табл. 2.

Проведенная оценка содержания моно-, дийодтирозина и тирозина в плазме крови крыс контрольной группы в течение 24 ч не выявила значимых измене­ний концентрации указанных аминокислот в различные временные интервалы, что свидетельствует об относи­тельно постоянном уровне данных соединений в крови животных.

Из данных табл. 2 видно, что через 1 ч после введения препаратов наблюдалось увеличение по сравнению с контролем концентрации монойодтирозина в крови крыс только 3-й группы (на 40,8%), уровни дийодтирозина и тирозина у всех опытных животных были сопоста­вимы с показателями крыс контрольной группы.

Через 4 ч после введения исследуемых субстан­ций концентрация монойодтирозина у животных 2-й группы выросла в 8,6 раза, 3-й группы - в 6,9 раза, в 4-й группе не изменилась. Концентрация дийодтирозина увеличилась только у крыс 2-й группы (в 7,1 раза). В 3-й группе, хотя и наблюдалось уве­личение концентрации дийодтирозина, значимых от­личий не установлено. Уровень тирозина изменился в сторону увеличения только у животных 2-й группы (на 28%), у животных других групп он соответствовал контролю.

Через 24 ч после однократного введения йодирован­ных белков концентрация монойодтирозина у животных 2-й и 3-й групп хотя и снизилась по сравнению с пока­зателем после 4 ч, по-прежнему превышала контроль­ный уровень в 3,6 и 3,2 раза соответственно. Выше контрольного значения был уровень монойодтирозина и в 4-й группе на 35,3%. Концентрация дийодтирозина у крыс 2-й группы уменьшилась по отношению к 4 ч, но все равно была выше, чем в контроле, в 3,9 раза. В 3-й и 4-й группах по этому показателю различий с контролем не установлено. Содержание тирозина было одинаково во всех экспериментальных группах.

Анализ полученных данных показывает, что введение в организм животных ЭБ приводит к значительному уве­личению концентрации в крови как монойодтирозина, так и дийодтирозина. Более высокая концентрация в плазме монойодтирозина по сравнению с дийодтирозином соответствует содержанию аминокислот в йодиро­ванном белке: 1,32% монойодтирозина и 0,64% дийодтирозина. Максимальная концентрация йодированных аминокислот (из зафиксированных) была установлена через 4 ч после поступления в организм животных ЭБ. В этот же временной интервал наблюдается увеличение концентрации тирозина. Эти данные согласуются с тем, что время переваривания сывороточных белков молока составляет 2-3 ч. Соответственно, по истечении этого времени концентрация аминокислот в крови будет мак­симальной, а затем начнет снижаться, что и подтверж­дается полученными результатами. Одновременное при­сутствие в плазме крови тирозина и его йодированных производных может свидетельствовать о том, что моно- и дийодтирозин способны поступать в системный крово­ток без метаболических превращений в печени.

При введении животным ЙК в плазме крови наблю­дался рост концентрации только монойодтирозина. Ка­зеин переваривается дольше, чем сывороточные белки: время переваривания казеина составляет порядка 6 ч. Измерение показателей осуществлялось через 1, 4 и 24 ч после приема йодированного белка, что, возможно, не позволило зафиксировать изменения концентрации тирозина и дийодтирозина. Можно предположить, что монойодтирозин, находясь на поверхности белковой молекулы, легче и быстрее высвобождается из состава белка. Наличие в крови монойодтирозина в высокой концентрации подтверждает возможность поступления в системный кровоток йодированных аминокислот.

Некоторое увеличение в крови концентрации монойодтирозина через 24 ч после введения йодида калия можно объяснить более активным синтезом тиреоидных гормонов после поступления повышенного количества йода в виде йодид-иона в щитовидную железу. Моно- и дийодтирозины образуются в железе при протеолизе тиреоглобулина и могут поступать в кровоток вместе с гормонами.

Таким образом, в ходе проведенных исследований ус­тановлено, что при однократном введении йодированных молочных белков, содержащих йодированные амино­кислоты, в плазме крови крыс значительно повышаются концентрации моно- и дийодтирозина. Это свидетельс­твует о том, что йодтирозины при первом прохождении через печень могут не подвергаться биотрансформации и поступать в системный кровоток в неизмененном виде. Данные, полученные в настоящем исследовании, расши­ряют имеющиеся представления о путях пресистемного метаболизма органических соединений йода.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутс­твии конфликта интересов.

Литература

1. Kim H.J., Kim N.K., Park H.K. et al. Strong association of relatively low and extremely excessive iodine intakes with thyroid cancer in an iodinereplete area // Eur. J. Nutr. 2017. Vol. 56, N 3. P. 965-971. doi:10.1007/ s00394-015-1144-2.

2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Анализ отечественного и международного опыта использования обогащенных витаминами пищевых продуктов // Вопр. питания. 2016. № 2. С. 31-50.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник Д.В., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 113-124.

4. Bost M., Martin A., Orgiazzi J. Iodine deficiency: epidemiology and nutri­tional prevention // Trace Elem. Med. 2014. Vol. 15, N 4. P. 3-7.

5. Carvalho D.P., Dupuy C. Thyroid hormone biosynthesis and release // Mol. Cell. Endocrinol. 2017. Vol. 458. P. 6-15.

6. Di Jeso B., Arvan P. Thyroglobulin from molecular and cellular biology to clinical endocrinology // Endocr. Rev. 2016. Vol. 37, N 1. P. 2-36. doi: 10.1210/er.2015-1090.

7. Targovnik H.M, Citterio C.E, Rivolta C.M. Iodide handling disorders (NIS, TPO, TG, IYD) // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2017. Vol. 31, N 2. P. 195-212. doi: 10.1016/j.beem.2017.03.006. Epub 2017 Apr 4.

8. WHO. World Health Organization, United Nations Children's Fund &International Council for the Control of Iodine Deficiency Disor­ders. Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination. A guide for programme managers. 3rd ed. Geneva : World Health Organization, 2007. URL: http://whqlibdoc.who.int/publica-tions/2007/9789241595827_eng.pdf.

9. Применение йодказеина для предупреждения йоддефицитных забо­леваний в качестве средства популяционной,групповой и индивиду­альной профилактики йодной недостаточности : методические реко­мендации. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 12 c.

10. Dohan O., De la Vieja A., Paroder V., Riedel C., Artani M., Reed M. et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation and medical significance // Endocr. Rev. 2003. Vol. 24. P. 48-77.

11. Toth G., Noszal B. Thyroid hormones and their precursors I. Biochemical properties // Acta Pharm. Hung. 2013. Vol. 83, N 2. P. 35-45.

12. Rodriguez A-M., Perron B., LaCroix L. Identification and characterization of a putative human iodide transporter located at the apical membrane of thyrocytes // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 87. P. 3500-3503.

13. Portulano C., Paroder-Belenitsky M., Carrasco N. The Na+/I-symporter (NIS): mechanism and medical impact // Endocr. Rev. 2014. Vol. 35. P. 106-149.

14. de Vijlder J.J.M. Primary congenital hypothyroidism: defects in iodine pathways // Eur. J. Endocrinol. 2003. Vol. 149. P. 247-256.

15. Трошина Е. А. К вопросу о недостатке и избытке йода в организме человека // Клин. и экспер. тиреоидология. 2010. № 4. С. 9-16.

16. Larsen P.R., Zavacki A.M. The role of the iodothyronine deiodinases in the physiology and pathophysiology of thyroid hormone action // Eur. Thyroid J. 2012. Vol. 1. P. 232-242.

17. Ruf J., Carayon P. Structural and functional aspects of thyroid peroxi­dase // Arch. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 445. P. 269-277.

18. Люблинский С.Л., Савчик С.А., Смирнов С.В. Способ получения биологически активной добавки к пище. Пат. РФ № 2212155, 2002.

19. Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Скворцов В.Г., Клепов А.Н., Скобелев И.В., Ус П.П. и др. Средство для регулирования йодного обмена или профилактики йоддефицитных состояний. Пат. РФ № 2151611, 2000.

20. ГОСТ 31886-2012. Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP). Применение принципов GLP к краткосрочным исследованиям. М. : Стандартинформ, 2013. 10 с.

21. ГОСТ 33044-2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. М. : Стандартинформ, 2015. 12 с.

22. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington, DC : National Academy Press, 1996. URL: http://dx.doi.org/10.17226/10498.

23. ГОСТ 33422-2015. Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. М. : Стандартинформ, 2016. 10 с.

24. Гланц С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. М. : Практика, 1998. 459 с.