Ключевым вопросом для понимания витаминной и антиоксидантной активности токоферолов является описание на молекулярном уровне механизмов их физиологического и биохимического действия. Токоферолы могут оказывать положительное биологическое действие путем регулирования экспрессии генов, трансдукции сигнала, модуляции клеточных функций путем белок-мембранных взаимодействий [1, 2].
Токоферолы существуют в виде 4 гомологов (α, β, δ и γ), отличающихся по структуре и выполняемым функциям. Например, α-токоферол обладает самой высокой биологической активностью, тогда как γ-токоферол проявляет только 10-30% витаминной активности. Биодоступность разных форм токоферолов определяется их способностью связываться со специфическими белками-транспортерами [3]. В частности, была показана линейная зависимость между сродством различных форм токоферолов к α-токоферол-транспортному белку (α-TTP) и известной биологической активностью токоферолов, полученной на моделях животных. Токоферол-ассоциированный белок 1 (TAP1) связывается с некоторыми гидрофобными молекулами, способствуя их переносу между различными компартментами клетки [5, 6]. Известно, что изоформы токоферолов, а также их метаболиты различным образом взаимодействуют с ферментами, наиболее значимые из которых цикло-оксигеназа-2 (COX-2), протеинфосфатаза 2А (PP2A) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (HMG-CoA) редуктаза.
Актуальной проблемой в настоящее время является отсутствие исследований, которые позволили бы в рамках одной системы оценить механизм биологического действия всех изомеров токоферолов, а также их метаболитов на ключевые белки, обусловливающие их биологическую, в том числе антиоксидантную, активность. Одним из методов, позволяющих охарактеризовать подобные механизмы, является молекулярный докинг, применению которого для решения обозначенной проблемы посвящена данная работа.
Материал и методы
Структурные модели. Модели белков-мишеней, полученные методом рентгеноструктурного анализа, были загружены из базы данных https://www.rcsb.org c соответствующими идентификационными номерами белков (PDB ID): 5MUE (α-TTP), 1OLM (TAP1), 3K7V (PP2A), 2R4F (HMG-CoA редуктаза), 5F1A (COX-2). Были использованы структурные файлы лигандов из базы https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ со следующими идентификационными номерами (CID): 14985 (α-токоферол), 6857447 (β-токоферол), 92094 (δ-токоферол), 92729 (γ-то-коферол), 9943542 (α-CEHC), 35027084 (δ-CEHC), 133098 (γ-CEHC). Структуры недостающих β-CEHC и α-, β-, δ-и γ-13'-карбоксихроманолом (13'-COOH) были составлены вручную на основе соответствующих предшественников с известной структурой (рис. 1).
Молекулярный докинг. Процедура молекулярного докинга была проведена с использованием сервиса http://www.swissdock.ch, работающего на базе метода EADock DSS и включающего следующие стадии анализа: установление предполагаемых полостей связывания до начала докинга, генерирование допустимых вариантов расположения лигандов в полостях связывания, применение оценочной функции и объединение полученных данных в единую оценочную систему для разделения полученных комплексов на кластеры по значению свободной энергии комплексов (ΔG) [7, 8].
Докинг был проведен в медленном режиме для получения наиболее точных результатов. В качестве результирующего значения AG было использовано наименьшее значение наиболее эффективного кластера. В качестве области поиска полостей в структуре белка была использована вся поверхность белковых молекул с целью выявления наиболее энергетически выгодных комплексов исследуемых лигандов, в том числе вне активных центров исследуемых белков.
С целью обеспечения воспроизводимости результатов проведенных исследований все первичные данные, полученные в ходе эксперимента по докингу, размещены в открытом доступе по постоянной ссылке: http://dx.doi.org/10.17632/8474w5676s.1.
Анализ результатов. Визуализация и анализ данных были проведены с использованием программы UCSF Chimera [9]. Сравнение значений AG полученных белок-лигандных комплексов было проведено при помощи U-критерия Манна-Уитни. Статистическая обработка и построение диаграмм были осуществлены с использованием программы RStudio 3.3.2 [10].
Результаты
Составленный пул лигандов представляет собой гомологичный ряд монофенолов, представленных четырьмя гомологами, которые отличаются друг от друга количеством и расположением метильных групп в их структурах и обладают четко выраженной динамикой изменения физико-химических характеристик (см. таблицу).
Как видно из представленных в таблице данных, одновременно со снижением молекулярной массы в ряду α>β=γ>δ наблюдается незначительное снижение значения коэффициента разделения (гидрофобности) лигандов. Одинаковое увеличение общей площади полярной поверхности для метаболитов связано с наличием карбоксильной группы на конце фитиловой цепи и ее остатка.
Согласно критериям Липинского, токоферолы и 13'-COOH-метаболиты в силу своих физико-химических свойств не способны усваиваться организмом в нативном виде, в то время как CEHC-метаболиты в силу своей гидрофильности не имеют подобных ограничений и могут абсорбироваться без специфических транспортных белков [11].
Учитывая данный факт, а также принимая во внимание, что транспортные белки α-TTP и TAP1 относятся к классу Sec14-подобных белков, для которых характерно наличие липофильного домена CRAL-TRIO, в котором идет связывание и перенос липидных лигандов [4], с данными белками был проведен докинг только токоферолов и 13'-СООН-метаболитов. Для остальных белков был проведен докинг со всеми лигандами.
Результаты исследований α-TTP и TAP1 представлены на рис. 2. Как показано на рис. 2 А, Б, в случае обоих транспортных белков исследуемые лиганды связаны в липофильном домене в непосредственной близости с нативными лигандами (расположение нативных лигандов, определенное методом рентгенструктурного анализа, считается наиболее энергетически выгодным). В связи с этим выбранный метод молекулярного докинга применим по отношению к изучаемым структурам.
Наибольшее сродство к α-TTP проявил α-токоферол (ΔG=-11,40 ккал/моль), при этом характерно, что метаболиты всех форм токоферола обладали схожим или большим сродством к данному белку по сравнению со своим предшественником, но не большим, чем для α-токоферола. В случае TAP1 наибольшим сродством среди токоферолов обладал α-токоферол (ΔG=-10,28 ккал/моль), при этом γ-13'-СООН-метаболит обладал большим сродством к данному белку (ΔG=-10,64 ккал/моль) по сравнению с α-токоферолом и α-13'-СООН (ΔG=-10,10 ккал/моль).
Как видно на диаграммах размаха значений свободной энергии для комплексов белок-лиганд (рис. 2, В), отсутствуют значимые различия данного показателя между группой токоферолов и 13'-СООН-метаболитов. Стоит отметить, что для TAP1 имеется незначительная тенденция к снижению значения ΔG в группе 13'-СООН-метаболитов. В то же время, как показано на рис. 2, Г, форма гомолога токоферола или 13'-СООН-метаболита при связывании с транспортными белками существенно влияет на значения ΔG комплексов.
На рис. 3 (А-В) показаны комплексы исследуемых белков с лигандами, обладающие наименьшей свободной энергией.
Наибольшим сродством к HMG-CoA редуктазе обладает δ-13'-СООН-метаболит (ΔG=-9,46 ккал/моль). При этом отмечено, что докинг всех изученных лигандов происходит в области связывания белка с мембраной эндоплазматического ретикулума.
Наиболее устойчивые комплексы с белком PP2A образует β-токоферол (ΔG= -8,66 ккал/моль), при этом 13'-СООН-метаболиты обладают немного меньшим сродством к данному белку. Связывание лигандов происходило преимущественно между структурной А и каталитической С-субъединицами.
При анализе результатов докинга СОХ-2 было установлено, что среди изученных лигандов наибольшим сродством к нему обладает α-13'-COOH-метаболит (ΔG=-9,56 ккал/моль), находящийся в центре связывания протопорфирина IX - характерном домене для всех изучаемых лигандов. Ни один из исследованных лигандов не связался в каталитическом центре по причине стерических ограничений. Для 13'-СООН-метаболитов характерно снижение сродства к СОХ-2 по сравнению с предшественниками.
Как видно на диаграммах размаха значений свободной энергии комплексов (см. рис. 3, Г), для всех 3 белков характерно достоверно низкое сродство к СЕНС-метаболитам независимо от формы токоферола-предшественника. Для белков HMG-CoA редуктазы и СОХ-2 отмечена тенденция к снижению значения ΔG в группе 13'-СООН-метаболитов по сравнению с группой токоферолов. В отличие от комплексов с транспортными белками, в данном случае (см. рис. 3, Д) свободная энергия комплексов в меньшей степени зависит от формы гомолога.
Обсуждение
Связывание всех исследуемых токоферолов и 13'-СООН-метаболитов происходит непосредственно в активном центре aTTP, что свидетельствует о конкурентном связывании всех форм токоферолов и их метаболитов с данным белком. При этом α-токоферол и его 13'-СООН-метаболит обладают наибольшим сродством к транспортеру. Данный результат является показательным в свете объяснения механизма высокой биодоступности α-токоферола по сравнению с другими формами токоферола при поступлении с пищей. Таким образом, для восполнения дефицита токоферолов целесообразно использовать только пищевые источники, богатые α-токоферолом.
С другой стороны, результаты, полученные при изучении TAP1, свидетельствуют о высокой роли γ-13'-СООН в процессе внутриклеточного транспорта в связи с тем, что данный метаболит проявляет большую аффинность к TAP1 по сравнению как с α-токоферолом, так и с α-13'-СООН. Данный белок экспрессируется преимущественно в мозге, печени и почках, поэтому специфические биологические эффекты γ-13'-СООН в первую очередь целесообразно изучать при профилактике и диетотерапии заболеваний, связанных со снижением антиоксидантного статуса именно в этих органах, в том числе при нейродегенеративных заболеваниях и метаболическом синдроме.
Результаты моделирования взаимодействия изучаемых лигандов с СОХ-2 показали, что высоким сродством по отношению к данному ферменту обладают как α-, так и γ- формы токоферолов, при этом для γ-13'-COOH-метаболит обладал большим сродством, чем его предшественник. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что γ-токоферол может служить потенциальным ингибитором COX-2 при развитии воспалительных процессов, при этом для оценки эффективности его использования в качестве биомаркера целесообразно использовать концентрацию γ-13'-COOH в крови.
Впервые было показано, что 13'-COOH-метаболиты токоферолов обладают более высоким сродством к HMG-CoA редуктазе по сравнению с их предшественниками. Благодаря этому можно предположить, что 13'-COOH-метаболиты токоферолов могут выступать в роли пищевых биологически активных веществ гипохолестеринемического действия.
Низкое сродство изучаемых лигандов к С-концевому хвосту PP2A не позволяет сделать однозначных выводов о механизме действия различных форм токоферолов и их метаболитов как специфических активаторах данного фермента. Тем не менее на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что экспериментально подтвержденная активация PP2A связана с изменением конформации белка в данной области, что может привести к наблюдаемым эффектам.
Заключение
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность воздействия токоферолов и их метаболитов на организм человека зависит от химической природы действующего вещества. Для детализации механизма такого воздействия необходимо глубокое понимание природы воздействия конкретной формы токоферола или его метаболита на отдельные ферментные системы, обеспечивающие необходимый статус физиологических и биохимических функций организма.
В данной работе было показано, что 13'-COOH-метабо-литы могут обладать повышенным сродством к различным ферментам в зависимости от формы (α, β, γ или δ) предшествующего им токоферола. Результаты исследований дополнили представление о роли 13'-COOH-метабо-литов как эффективных ингибиторов COX-2 и активаторов PP2A. Таким образом, указанные ферменты представляют собой перспективные мишени для изучения свойств данных метаболитов в комплексе исследований, связанных с разработкой биологически активных добавок к пище и формированием оптимальных рационов питания с учетом вклада отдельных форм токоферолов.
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-16-00055).
Литература/References
1. Brigelius-Flohe R., Traber M.G. Vitamin E: function and metabolism. FASEB J. 1999; 13 (10): 1145-55.
2. Shahidi F., De Camargo A.C. Tocopherols and tocotrienols in common and emerging dietary sources: Occurrence, applications, and health benefits. Int J Mol Sci. 2016; 17 (10): 1745.
3. Hosomi A., Arita M., Sato Y., Kiyose C., Ueda T., Igarashi O., et al. Affinity for α-tocopherol transfer protein as a determinant of the biological activities of vitamin E analogs. FEBS Lett. 1997; 409 (1): 105-8.
4. Schmolz L. Complexity of vitamin E metabolism. World J Biol Chem. 2016; 7 (1): 14.
5. Yamauchi J., Iwamoto T., Kida S., Masushige S., Yamada K., Esashi T. Tocopherol-associated protein is a ligand-dependent transcriptional activator. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 285 (2): 295-9.
6. Zimmer S., Stocker A., Sarbolouki M.N., Spycher S.E., Sasso-on J., Azzi A. A novel human tocopherol-associated protein: Cloning, in vitro expression, and characterization. J Biol Chem. 2000; 275 (33): 25672-80.
7. Grosdidier A., Zoete V., Michielin O. Fast docking using the CHARMM force field with EADock DSS. J Comput Chem. 2011; 32 (10): 2149-59.
8. Grosdidier A., Zoete V., Michielin O. SwissDock, a protein-small molecule docking web service based on EADock DSS. Nucleic Acids Res. 2011; 39 (Suppl. 2): W270-7.
9. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., et al. UCSF Chimera - a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 2004; 25: 1605-12.
10. RStudio: integrated development for R. RStudio, Inc., Boston, MA. http//www. rstudio. com. 2015.
11. Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W., Feeney P.J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2001; 46 (1-3): 3-26.
12. Jiang Q., Elson-Schwab I., Courtemanche C., Ames B.N. Gamma-tocopherol and its major metabolite, in contrast to alpha-tocopherol, inhibit cyclooxygenase activity in macrophages and epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (21): 11494-9.
13. Jiang Q., Yin X., Lill M.A., Danielson M.L., Freiser H., Huang J. Long-chain carboxychromanols, metabolites of vitamin E, are potent inhibitors of cyclooxygenases. Proc Natl Acad Sci National Academy of Sciences. 2008; 105 (51): 20464-9.
14. Kamal-Eldin A., Pettersson D., Appelqvist L.-A. Sesamin (a compound from sesame oil) increases tocopherol levels in rats fedad libitum. Lipids. 1995; 30 (6): 499-505.
15. Wada S., Naito Y., Matsushita Y., Kawai M., Minami E., Aoi W., et al. δ-Tocotrienol suppresses tumorigenesis by inducing apoptosis and blocking the COX-2/PGE2 pathway that stimulates tumor-stromal interactions in colon cancer. J Funct Foods Elsevier. 2017; 35: 428-35.
16. Liu Y., Xu Z.M., Yang G.Y., Yang D.X., Ding J., Chen H., et al. Sesamin alleviates blood-brain barrier disruption in mice with experimental traumatic brain injury. Acta Pharmacol Sin. 2017; 38 (11): 1445-55.