Витаминные и антиоксидантные свойства токоферолов: характеристика молекулярных механизмов действия

Резюме

Методом молекулярного докинга проведено исследование структурных характеристик, обусловливающих конкурентный транспорт в кровь, а также последующее связывание с ферментами токоферолов и их метаболитов для проявления специфической биологической активности. В качестве белков-мишеней использованы α-токоферол-транспортный белок (α-TTP), токоферол-ассоциированный белок 1 (TAP1), циклооксигеназа-2 (COX-2), протеинфосфатаза 2А (PP2A) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (HMG-CoA) редуктаза. В качестве лигандов были использованы RRR-токоферол (α-, β-, γ- и δ-формы), RRR-13-карбоксихроманол (α-, β-, γ- и δ-формы) и карбоксиэтилгидроксихроманол (α-, β-, γ- и δ-формы). Проведенные исследования подтвердили, что среди всех гомологов наибольшее сродство к транспортным белкам α-TTP и TAP1 имеет α-токоферол (ΔG=-11,40 и ΔG=-10,28 ккал/моль соответственно). Было показано, что во всех случаях карбоксиэтилгидроксихроманол-метаболиты обладают наибольшей свободной энергией связывания (ΔG>-8 ккал/моль), в связи с чем сделан вывод о том, что они не являются эффективными лигандами для изучаемых белков. Напротив, метаболиты 13-карбоксихроманола при связывании как с α-TTP, так и с TAP1 преимущественно образовывали более устойчивые комплексы по сравнению со своими предшественниками. Впервые было показано, что комплекс γ-13-карбоксихроманола с TAP1 имеет меньшую свободную энергию связывания (ΔG=-10,64 ккал/моль) по сравнению с комплексом α-токоферола (ΔG=-10,28 ккал/моль). Также показано, что 13-карбоксихроманол-метаболиты более эффективно связывались с ферментами COX-2 (ΔG=-9,56 ккал/моль для комплекса с α-13-карбоксихроманолом) и HMG-CoA редуктазой (ΔG=-9,46 ккал/моль для комплекса с δ-13-карбоксихроманолом). По отношению к белку PP2A 13-карбоксихроманол-метаболиты обладали схожим сродством, что и их предшественники. Результаты работы свидетельствуют о возможности 13-карбоксихроманолов конкурентно связываться с транспортерами α-токоферола и выступать в качестве эффективных лигандов COX-2 и HMG-CoA, что может быть использовано с целью коррекции пищевого статуса при состояниях, сопровождающихся дефицитом токоферолов.

Ключевые слова:токоферолы, метаболизм токоферолов, карбоксиэтил-гидроксихроманол, карбоксихроманол, антиоксидантная и витаминная активность, молекулярный докинг

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 3. С. 5-11. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10025.

Ключевым вопросом для понимания витаминной и антиоксидантной активности токоферолов явля­ется описание на молекулярном уровне механизмов их физиологического и биохимического действия. Токофе­ролы могут оказывать положительное биологическое действие путем регулирования экспрессии генов, трансдукции сигнала, модуляции клеточных функций путем белок-мембранных взаимодействий [1, 2].

Токоферолы существуют в виде 4 гомологов (α, β, δ и γ), отличающихся по структуре и выполняемым функциям. Например, α-токоферол обладает самой вы­сокой биологической активностью, тогда как γ-токоферол проявляет только 10-30% витаминной активности. Биодоступность разных форм токоферолов определя­ется их способностью связываться со специфическими белками-транспортерами [3]. В частности, была пока­зана линейная зависимость между сродством различ­ных форм токоферолов к α-токоферол-транспортному белку -TTP) и известной биологической активностью токоферолов, полученной на моделях животных. Токоферол-ассоциированный белок 1 (TAP1) связывается с некоторыми гидрофобными молекулами, способствуя их переносу между различными компартментами клетки [5, 6]. Известно, что изоформы токоферолов, а также их метаболиты различным образом взаимодействуют с ферментами, наиболее значимые из которых цикло-оксигеназа-2 (COX-2), протеинфосфатаза 2А (PP2A) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А (HMG-CoA) редуктаза.

Актуальной проблемой в настоящее время является отсутствие исследований, которые позволили бы в рам­ках одной системы оценить механизм биологического действия всех изомеров токоферолов, а также их мета­болитов на ключевые белки, обусловливающие их био­логическую, в том числе антиоксидантную, активность. Одним из методов, позволяющих охарактеризовать подобные механизмы, является молекулярный докинг, применению которого для решения обозначенной про­блемы посвящена данная работа.

Материал и методы

Структурные модели. Модели белков-мишеней, по­лученные методом рентгеноструктурного анализа, были загружены из базы данных https://www.rcsb.org c соответствующими идентификационными номерами белков (PDB ID): 5MUE -TTP), 1OLM (TAP1), 3K7V (PP2A), 2R4F (HMG-CoA редуктаза), 5F1A (COX-2). Были использованы структурные файлы лигандов из базы https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ со следующими иден­тификационными номерами (CID): 14985 -токоферол), 6857447 -токоферол), 92094 -токоферол), 92729 -то-коферол), 9943542 -CEHC), 35027084 -CEHC), 133098 -CEHC). Структуры недостающих β-CEHC и α-, β-, δ-и γ-13'-карбоксихроманолом (13'-COOH) были состав­лены вручную на основе соответствующих предшест­венников с известной структурой (рис. 1).

Молекулярный докинг. Процедура молекулярного докинга была проведена с использованием сервиса http://www.swissdock.ch, работающего на базе метода EADock DSS и включающего следующие стадии ана­лиза: установление предполагаемых полостей связы­вания до начала докинга, генерирование допустимых вариантов расположения лигандов в полостях связы­вания, применение оценочной функции и объединение полученных данных в единую оценочную систему для разделения полученных комплексов на кластеры по зна­чению свободной энергии комплексов (ΔG) [7, 8].

Докинг был проведен в медленном режиме для по­лучения наиболее точных результатов. В качестве ре­зультирующего значения AG было использовано на­именьшее значение наиболее эффективного кластера. В качестве области поиска полостей в структуре белка была использована вся поверхность белковых молекул с целью выявления наиболее энергетически выгодных комплексов исследуемых лигандов, в том числе вне ак­тивных центров исследуемых белков.

С целью обеспечения воспроизводимости результатов проведенных исследований все первичные данные, по­лученные в ходе эксперимента по докингу, размещены в открытом доступе по постоянной ссылке: http://dx.doi.org/10.17632/8474w5676s.1.

Анализ результатов. Визуализация и анализ данных были проведены с использованием программы UCSF Chimera [9]. Сравнение значений AG полученных белок-лигандных комплексов было проведено при помощи U-критерия Манна-Уитни. Статистическая обработка и построение диаграмм были осуществлены с использо­ванием программы RStudio 3.3.2 [10].

Результаты

Составленный пул лигандов представляет собой гомо­логичный ряд монофенолов, представленных четырьмя гомологами, которые отличаются друг от друга количес­твом и расположением метильных групп в их структурах и обладают четко выраженной динамикой изменения физико-химических характеристик (см. таблицу).

Как видно из представленных в таблице данных, одновременно со снижением молекулярной массы в ряду α>β=γ>δ наблюдается незначительное снижение значения коэффициента разделения (гидрофобности) лигандов. Одинаковое увеличение общей площади по­лярной поверхности для метаболитов связано с нали­чием карбоксильной группы на конце фитиловой цепи и ее остатка.

Согласно критериям Липинского, токоферолы и 13'-COOH-метаболиты в силу своих физико-химических свойств не способны усваиваться организмом в нативном виде, в то время как CEHC-метаболиты в силу своей гидрофильности не имеют подобных ограничений и могут абсорбироваться без специфических транспорт­ных белков [11].

Учитывая данный факт, а также принимая во внима­ние, что транспортные белки α-TTP и TAP1 относятся к классу Sec14-подобных белков, для которых ха­рактерно наличие липофильного домена CRAL-TRIO, в котором идет связывание и перенос липидных лигандов [4], с данными белками был проведен докинг только токоферолов и 13'-СООН-метаболитов. Для остальных белков был проведен докинг со всеми лигандами.

Результаты исследований α-TTP и TAP1 представлены на рис. 2. Как показано на рис. 2 А, Б, в случае обоих транспортных белков исследуемые лиганды связаны в липофильном домене в непосредственной близости с нативными лигандами (расположение нативных лигандов, определенное методом рентгенструктурного анализа, считается наиболее энергетически выгодным). В связи с этим выбранный метод молекуляр­ного докинга применим по отношению к изучаемым структурам.

Наибольшее сродство к α-TTP проявил α-токофе­рол G=-11,40 ккал/моль), при этом характерно, что метаболиты всех форм токоферола обладали схожим или большим сродством к данному белку по срав­нению со своим предшественником, но не большим, чем для α-токоферола. В случае TAP1 наибольшим сродством среди токоферолов обладал α-токоферол G=-10,28 ккал/моль), при этом γ-13'-СООН-метаболит обладал большим сродством к данному белку G=-10,64 ккал/моль) по сравнению с α-токоферолом и α-13'-СООН G=-10,10 ккал/моль).

Как видно на диаграммах размаха значений свобод­ной энергии для комплексов белок-лиганд (рис. 2, В), отсутствуют значимые различия данного показателя между группой токоферолов и 13'-СООН-метаболитов. Стоит отметить, что для TAP1 имеется незначительная тенденция к снижению значения ΔG в группе 13'-СООН-метаболитов. В то же время, как показано на рис. 2, Г, форма гомолога токоферола или 13'-СООН-метаболита при связывании с транспортными белками существенно влияет на значения ΔG комплексов.

На рис. 3 (А-В) показаны комплексы исследуемых белков с лигандами, обладающие наименьшей свобод­ной энергией.

Наибольшим сродством к HMG-CoA редуктазе обла­дает δ-13'-СООН-метаболит G=-9,46 ккал/моль). При этом отмечено, что докинг всех изученных лигандов происходит в области связывания белка с мембраной эндоплазматического ретикулума.

Наиболее устойчивые комплексы с белком PP2A об­разует β-токоферол G= -8,66 ккал/моль), при этом 13'-СООН-метаболиты обладают немного меньшим сродством к данному белку. Связывание лигандов происходило преимущественно между структурной А и каталитической С-субъединицами.

При анализе результатов докинга СОХ-2 было ус­тановлено, что среди изученных лигандов наиболь­шим сродством к нему обладает α-13'-COOH-метаболит G=-9,56 ккал/моль), находящийся в центре связыва­ния протопорфирина IX - характерном домене для всех изучаемых лигандов. Ни один из исследованных лигандов не связался в каталитическом центре по причине стерических ограничений. Для 13'-СООН-метаболитов характерно снижение сродства к СОХ-2 по сравнению с предшественниками.

Как видно на диаграммах размаха значений сво­бодной энергии комплексов (см. рис. 3, Г), для всех 3 белков характерно достоверно низкое сродство к СЕНС-метаболитам независимо от формы токофе­рола-предшественника. Для белков HMG-CoA редуктазы и СОХ-2 отмечена тенденция к снижению значе­ния ΔG в группе 13'-СООН-метаболитов по сравнению с группой токоферолов. В отличие от комплексов с транспортными белками, в данном случае (см. рис. 3, Д) свободная энергия комплексов в меньшей степени зави­сит от формы гомолога.

Обсуждение

Связывание всех исследуемых токоферолов и 13'-СООН-метаболитов происходит непосредственно в активном центре aTTP, что свидетельствует о кон­курентном связывании всех форм токоферолов и их метаболитов с данным белком. При этом α-токофе­рол и его 13'-СООН-метаболит обладают наибольшим сродством к транспортеру. Данный результат является показательным в свете объяснения механизма высокой биодоступности α-токоферола по сравнению с другими формами токоферола при поступлении с пищей. Таким образом, для восполнения дефицита токоферолов це­лесообразно использовать только пищевые источники, богатые α-токоферолом.

С другой стороны, результаты, полученные при изуче­нии TAP1, свидетельствуют о высокой роли γ-13'-СООН в процессе внутриклеточного транспорта в связи с тем, что данный метаболит проявляет большую аффинность к TAP1 по сравнению как с α-токоферолом, так и с α-13'-СООН. Данный белок экспрессируется преимущест­венно в мозге, печени и почках, поэтому специфические биологические эффекты γ-13'-СООН в первую очередь целесообразно изучать при профилактике и диетотера­пии заболеваний, связанных со снижением антиоксидантного статуса именно в этих органах, в том числе при нейродегенеративных заболеваниях и метаболическом синдроме.

Результаты моделирования взаимодействия изучае­мых лигандов с СОХ-2 показали, что высоким сродством по отношению к данному ферменту обладают как α-, так и γ- формы токоферолов, при этом для γ-13'-COOH-метаболит обладал большим сродством, чем его предшес­твенник. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что γ-токоферол может служить потенциальным ингибитором COX-2 при развитии воспалительных про­цессов, при этом для оценки эффективности его исполь­зования в качестве биомаркера целесообразно исполь­зовать концентрацию γ-13'-COOH в крови.

Впервые было показано, что 13'-COOH-метаболиты токоферолов обладают более высоким сродством к HMG-CoA редуктазе по сравнению с их предшест­венниками. Благодаря этому можно предположить, что 13'-COOH-метаболиты токоферолов могут выступать в роли пищевых биологически активных веществ гипохолестеринемического действия.

Низкое сродство изучаемых лигандов к С-концевому хвосту PP2A не позволяет сделать однознач­ных выводов о механизме действия различных форм токоферолов и их метаболитов как специфических активаторах данного фермента. Тем не менее на осно­вании полученных результатов можно сделать вывод о том, что экспериментально подтвержденная актива­ция PP2A связана с изменением конформации белка в данной области, что может привести к наблюдаемым эффектам.

Заключение

Таким образом, полученные результаты свидетельст­вуют о том, что эффективность воздействия токоферолов и их метаболитов на организм человека зависит от хими­ческой природы действующего вещества. Для детализа­ции механизма такого воздействия необходимо глубокое понимание природы воздействия конкретной формы то­коферола или его метаболита на отдельные ферментные системы, обеспечивающие необходимый статус физиоло­гических и биохимических функций организма.

В данной работе было показано, что 13'-COOH-метабо-литы могут обладать повышенным сродством к различ­ным ферментам в зависимости от формы (α, β, γ или δ) предшествующего им токоферола. Результаты исследо­ваний дополнили представление о роли 13'-COOH-метабо-литов как эффективных ингибиторов COX-2 и активаторов PP2A. Таким образом, указанные ферменты представляют собой перспективные мишени для изучения свойств дан­ных метаболитов в комплексе исследований, связанных с разработкой биологически активных добавок к пище и формированием оптимальных рационов питания с уче­том вклада отдельных форм токоферолов.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-16-00055).

Литература/References

1. Brigelius-Flohe R., Traber M.G. Vitamin E: function and metabolism. FASEB J. 1999; 13 (10): 1145-55.

2. Shahidi F., De Camargo A.C. Tocopherols and tocotrienols in com­mon and emerging dietary sources: Occurrence, applications, and health benefits. Int J Mol Sci. 2016; 17 (10): 1745.

3. Hosomi A., Arita M., Sato Y., Kiyose C., Ueda T., Igarashi O., et al. Affinity for α-tocopherol transfer protein as a determinant of the biological activities of vitamin E analogs. FEBS Lett. 1997; 409 (1): 105-8.

4. Schmolz L. Complexity of vitamin E metabolism. World J Biol Chem. 2016; 7 (1): 14.

5. Yamauchi J., Iwamoto T., Kida S., Masushige S., Yamada K., Esashi T. Tocopherol-associated protein is a ligand-dependent transcriptional activator. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 285 (2): 295-9.

6. Zimmer S., Stocker A., Sarbolouki M.N., Spycher S.E., Sasso-on J., Azzi A. A novel human tocopherol-associated protein: Clon­ing, in vitro expression, and characterization. J Biol Chem. 2000; 275 (33): 25672-80.

7. Grosdidier A., Zoete V., Michielin O. Fast docking using the CHARMM force field with EADock DSS. J Comput Chem. 2011; 32 (10): 2149-59.

8. Grosdidier A., Zoete V., Michielin O. SwissDock, a protein-small molecule docking web service based on EADock DSS. Nucleic Acids Res. 2011; 39 (Suppl. 2): W270-7.

9. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., et al. UCSF Chimera - a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 2004; 25: 1605-12.

10. RStudio: integrated development for R. RStudio, Inc., Boston, MA. http//www. rstudio. com. 2015.

11. Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W., Feeney P.J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeabil­ity in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2001; 46 (1-3): 3-26.

12. Jiang Q., Elson-Schwab I., Courtemanche C., Ames B.N. Gamma-tocopherol and its major metabolite, in contrast to alpha-tocopherol, inhibit cyclooxygenase activity in macrophages and epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (21): 11494-9.

13. Jiang Q., Yin X., Lill M.A., Danielson M.L., Freiser H., Huang J. Long-chain carboxychromanols, metabolites of vitamin E, are potent inhibitors of cyclooxygenases. Proc Natl Acad Sci National Academy of Sciences. 2008; 105 (51): 20464-9.

14. Kamal-Eldin A., Pettersson D., Appelqvist L.-A. Sesamin (a com­pound from sesame oil) increases tocopherol levels in rats fedad libitum. Lipids. 1995; 30 (6): 499-505.

15. Wada S., Naito Y., Matsushita Y., Kawai M., Minami E., Aoi W., et al. δ-Tocotrienol suppresses tumorigenesis by inducing apoptosis and blocking the COX-2/PGE2 pathway that stimulates tumor-stromal interactions in colon cancer. J Funct Foods Elsevier. 2017; 35: 428-35.

16. Liu Y., Xu Z.M., Yang G.Y., Yang D.X., Ding J., Chen H., et al. Sesamin alleviates blood-brain barrier disruption in mice with experimental traumatic brain injury. Acta Pharmacol Sin. 2017; 38 (11): 1445-55.