Накопление данных о влиянии питания в целом и потребления отдельных пищевых продуктов в частности на организм здорового и больного человека привело в последние годы к формированию нового направления в науке о питании, связанного с изучением биотехнологии, профилактической и клинической эффективности так называемых функциональных пищевых продуктов [1-5].
Особую актуальность приобретает разработка технологических подходов к созданию функциональных пищевых продуктов, направленных на коррекцию различных нарушений жирового обмена, в частности гиперлипидемий, являющихся ведущим фактором риска развития ишемической болезни сердца и атеросклероза. В связи большим числом побочных эффектов препаратов гиполипидемического действия, сегодня все более пристальное внимание уделяется алиментарной коррекции гиперлипидемических состояний. Идет постоянный поиск сырья для функциональных пищевых продуктов, обладающих гиполипидемической активностью [6-8].
Перспективна в этом плане вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus), плодовые тела которой, имея высокую пищевую ценность, содержат природный статин и целый комплекс других биологически активных веществ, обладающих гиполипидемическими свойствами [9-11]. Однако, несмотря на уже неоднократно подтвержденные данные о липидснижающей активности вешенки, не до конца освещены вопросы технологии ее переработки, в частности высушивания как одного из перспективных методов сохранения пищевых и функциональных свойств сырья. Очень мало сведений об оптимальных способах сушки вешенки как потенциального сырья для получения функциональных пищевых продуктов или их ингредиентов, в то время как различные условия обезвоживания могут неоднозначно отразиться на ее пищевых и биологических свойствах. Целенаправленных исследований влияния различных способов высушивания на сохранность гиполипидемического потенциала вешенки не проводилось, что делает вопрос его изучения весьма актуальным. В связи с этим целью настоящего исследования являлась оценка влияния разных способов сушки на некоторые пищевые свойства и гиполипидемический потенциал вешенки.
Материал и методы
В качестве объекта исследования использовали свежие грибы вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus), закупленные в гипермаркете торговой сети г. Ставрополя (производитель ИП Изотова А.А., Ставропольский край, с. Покойное). Отбирали плодовые тела с диаметром шляпок 6,0-7,0 см темно-серого цвета.
Для высушивания вешенки использовали наиболее экономически выгодный и распространенный в пищевой промышленности способ суховоздушной сушки и способ сублимационного высушивания (лиофилизация), набирающий популярность в последние годы как предлагающий компромисс затраты - качество [12].
В связи с различиями химического состава плодовых частей грибов [13], для эксперимента отбирали только шляпки вешенки. Грибы измельчали до кусочков с размерами сторон 1,0 см и размещали в один слой на противни из нержавеющей стали. Одну часть вешенки высушивали при атмосферном давлении и температуре +55 °С в суховоздушном термостате ТС-1/80 СПУ (ОАО "Смоленское специальное конструкторско-технологическое бюро систем программного управления", РФ).
Вторую часть грибов подвергали сублимационной сушке вакуумным методом с предварительным замораживанием. Заморозку образцов производили в холодильной установке SE10-45 ("TEFCOLD", Дания) при температуре -40,0 °С на протяжении 72 ч. Последующее высушивание осуществляли в лиофильной сушилке ЛС-500 ("Проинтех", РФ), включающей сублиматор и вакуумную станцию. Среднее рабочее давление в камере высушивания достигало 80,5 Па, температура конденсора составляла -49,0 °С, нагревание образцов вешенки за весь процесс высушивания не превышало +30 °С.
Обезвоживание грибов осуществляли до остаточной влажности 6-8%. При этом продолжительность высушивания суховоздушным способом составила 16 ч, а общая длительность цикла сублимации насчитывала 26 ч.
Количество влаги в свежих и высушенных образцах вешенки измеряли с помощью анализатора влагосодержания MB 25 ("Ohaus", Китай) при выбранной опции автоматического измерения с температурой нагрева до +75 0С и временем измерения 5 мин.
Готовые образцы сухой вешенки помещали в сухую, герметично закрываемую тару и хранили на протяжении эксперимента при температуре не выше +25 °С.
Для характеристики пищевых качеств сухой вешенки оценивали цвет, морфологическую структуру, регидратационную способность, содержание общего количества жиров, водорастворимых белков, полисахаридов, свободных аминокислот и глюкозы.
Исследование гиполипидемического потенциала высушенных грибов включало измерение концентрации ловастатина и определение уровня антиоксидантной активности.
Для характеристики цвета сушеных образцов грибов изучали экстинкцию водно-спиртовых вытяжек при длине волны от 285 до 400 нм, с определением спектра, наиболее наглядно характеризующего окраску сухой вешенки [14].
Микроструктурную оценку высушенных образцов вешенки проводили с помощью гистологического метода. Для этого образцы вешенки заключали в парафиновые блоки с использованием медицинского парафина Histomix ("Biovitrum", РФ). Гистологические срезы толщиной 6-7 мкм производили на санном микротоме МС-2 ("АТМ-практика", РФ) и окрашивали метиленовым синим.
Оценку микропрепаратов вешенки проводили с использованием лабораторного микроскопа Axio Imager 2 (A2) ("Carl Zeiss Microscopy", Германия) при увеличении 400 с фиксацией изображений с помощью специализированной фотокамеры AxioCam MRc5 ("Carl Zeiss Microscopy", Германия) и программного обеспечения Zena 2012 Pro.
Объемные структурные свойства образцов вешенки оценивали новейшим методом рентгеновской микротомографии с использованием компьютерного микротомографа SkyScan 1176 ("Bruker", Бельгия) при следующих параметрах сканирования: ускоряющее напряжение источника рентгеновского излучения 40 кВ, ток источника рентгеновского излучения 600 мкА, фильтр не применяется, размер пикселя 8,77 мкм, томографическое вращение 180°, шаг съемки 0,3°.
Морфологический 3D-анализ образцов вешенки осуществляли с помощью программного обеспечения CTAn (версия 1.13.11.0, Bruker microCT, Бельгия).
С целью определения регидратационной способности высушенные образцы грибов взвешивали на прецизионных весах ML203Е (Mettler Toledo, Китай) и погружали в дистиллированную воду (1:50) при температуре +60 оС. С периодичностью 5 мин кусочки грибов извлекали и взвешивали, предварительно удаляя излишки воды с помощью фильтровальной бумаги. После того как образцы достигали постоянной конечной массы, раcсчитывали их регидратационную способность как отношения массы влажного образца к массе обезвоженного [15].
Измерение количества общих жиров в образцах вешенки проводили гравиметрическим методом, основанным на извлечении липидов алкогольно-эфирной смесью Блюра [16], определение массовой доли белка осуществляли биуретовым методом [17]. Уровень свободных аминокислот измеряли по модифицированной методике, основанной на реакции с нингидрином в пересчете на аспарагин [18]. Определение общего количества полисахаридов в грибах проводили по модифицированной методике в пересчете на глюкозу [19]. Уровень моносахаридов в грибах характеризовали по содержанию свободной глюкозы посредством глюкозо-оксидазного метода [20].
Концентрацию ловастатина в образцах вешенки оценивали гидроксамовым способом после предварительной экстракции ловастатина хлороформом и его концентрирования [21, 22]. Для этого навески измельченных грибов в количестве 0,1-0,2 г в пересчете на сухое сырье экстрагировали 5,0-10,0 см3 хлороформа и фильтровали. Фильтрат упаривали с помощью роторного вакуумного испарителя RV 10 Basic V (IKA, Германия). К его остатку приливали 1,0 см3 0,9 М спиртового щелочного раствора гидроксиламина, 5,0 см3 5,73 мМ раствора хлорнокислого железа (III) и после доведения до рН 1,2±0,2 2 М раствором соляной кислоты проводили измерение экстинкции образовавшегося пурпурного раствора на спектрофотометре СФ-102 (ИФФ, РФ) при длине волны λ=513 нм. Расчет проводился по калибровочной кривой.
Для оценки антиоксидантной активности измельченный до однородного состояния материал вешенки экстрагировали бидистиллированной водой при температуре +50-60 оС в течение 3 ч с последующей фильтрацией [23]. Определение антиоксидантной активности экстракта проводилось in vitro с использованием тест-системы "ОксиСтат" (Институт биоорганической химии НАН, Беларусь), принцип которой состоит в одноэтапной оценке степени восстановления антиоксидантами предварительно сформированного радикала АБТС-+ [2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфо-новая кислота], что описано следующей схемой [24]: АБТС-+ + АО → АБТС + АО-+.
При взаимодействии антиоксидантов с АБТС-+ наблюдается уменьшение экстинкции раствора катион-радикала в диапазоне длин волн 600-800 нм пропорционально концентрации и активности антиоксиданта. Измерение экстинкции проводили на спектрофотометре с использованием кювет с длиной оптического пути 1 см.
Количественную оценку общей антиоксидантной активности производили расчетным путем относительно стандартного антиоксиданта тролокс - водорастворимого аналога витамина Е, по следующим формулам:
1) % ингибирования = 100 χ (1 - ΔАо/ΔАк);
2) АА = [Сст] / %ингибирования стандарта χ % ингибирования пробы, где АА - антиоксидантная активность, ΔАо - экстинкция опытной пробы, ΔАк - экстинкция контрольной пробы (буфер), Сст - концентрация стандарта (тролокс).
Содержание и активность веществ выражали в пересчете на абсолютное сухое вещество сырья. Определение всех количественных параметров проводили в троекратной аналитической повторности. Полученные результаты фиксировали в виде среднего значения ± стандартное отклонение (M±m) и подвергали статистической обработке с использованием критерия однофакторного дисперсионного анализа и программы Biostat (версия 4.03). О достоверности различий величин исследуемых показателей судили при р≤0,05.
Результаты и обсуждение
Цветность выступает одним из показателей качества готового продукта, изменение которого при высушивании может вызываться деградацией пигментов и ферментативным потемнением [25].
Результаты анализа цветности водно-спиртовых вытяжек сухих грибов вешенки показали, что экстинкция экстрактов при длине волны 295 нм наиболее наглядно характеризует окраску высушенной вешенки (табл. 1).
Визуально по цвету полученные сублимационным способом сухие образцы вешенки оказались более близки к свежим грибам. Интенсивность окраски экстрактов сублиматов была значительно ниже, чем грибов, высушенных суховоздушным способом. Это может объясняться низким содержанием кислорода в вакуумной камере лиофильной сушилки и, как следствие, менее интенсивным протеканием ферментативных реакций, которые являются основной причиной изменения цвета сухих грибов [26]. Более темная окраска образцов сухой вешенки, полученных суховоздушным способом, может также происходить и за счет реакции Майяра, протекающей между аминокислотами и сахарами при нагревании, дающей коричневый цвет [27].
Условия высушивания влияют на морфологию и микроструктуру продукта, и ее сохранение выступает важной задачей в процессе сушки, так как от ее целостности зависит ряд показателей качества [28, 29]. Происходящие микроструктурные перестройки могут оказывать влияние на процесс тепло- и массопереноса и, как следствие, приводить к биохимическим изменениям, а также влиять на степень высвобождения соединений из пищевой матрицы [30]. Поэтому для более полного представления о влиянии выбранных способов сушки на свойства вешенки проводили морфологическое изучение ее сухих образцов.
Согласно полученным гистологическим данным условия суховоздушной и сублимационной сушки неодинаково отразились на микроструктуре вешенки (рис. 1). По микропрепаратам установлено, что при суховоздушной сушке происходит сильное разрушение клеточной структуры гриба (рис. 1, Б). Для этих образцов характерно наличие корочки подсыхания и формирование плотной слоистой структуры, причиной чего может выступать неравномерное во времени удаление влаги -быстрое на начальном этапе и медленное при последующем высушивании [31].
Наблюдающаяся усадка может объясняться и термической деструкцией структурных компонентов за счет солюбилизации полимеров клеточной стенки, как это часто наблюдается при термической сушке фруктов [32].
На микрофотографиях видны слипания волокон и конгломераты. Встречаются многочисленные разрывы клеточных стенок и образование микрополостей, происходящие, по ряду мнений [33, 34], вследствие возможного в процессе высушивания развития усадочного напряжения, возникающего в результате неравномерного распределения полей влагосодержания и температуры внутри продукта.
Образцы вешенки, высушенные сублимационным способом, обладали меньшей степенью деформированности (рис. 1, В). В структуре тканей сублиматов, как и свежих образцов, выделяются клеточные стенки, характеризующиеся упорядоченной структурой и размером клеток, варьирующих в пределах 15-30 мкм. Лиофилизация вешенки сопровождалась гораздо меньшей усадкой тканей грибов. Это, вероятно, связано с предварительной заморозкой, которая обеспечивает структурную жесткость замороженного продукта и тем самым предотвращает распад твердой матрицы гриба, сохраняя ее структуру. Вместе с тем в сублиматах вешенки, так же как и в образцах, высушенных суховоздушным способом, по сравнению со свежими образцами отмечалось образование микрополостей и трещин, возможно, вызываемое разрушением клеточных стенок кристаллами льда в процессе замораживания.
Не менее важными структурными перестройками, которые могут происходить во время процесса дегидратации и непосредственно влиять на свойства конечного продукта, являются уменьшение объема и изменение пористости [35-37]. Гистологический метод недостаточно информативен для полноценной характеристики этих параметров. Поэтому для описания реальных величин пористости образцов вешенки использовали метод компьютерной микротомографии, позволяющий без разрушения материала сканировать образец рентгеновским излучением в разных плоскостях и производить последующую обработку снимков для получения трехмерной модели внешнего и внутреннего строения и автоматический расчет параметров.
Полученные с помощью рентгеновского микротомографа и программного обеспечения CTAn изображения, отражающие влияние условий сушки на состояние пористости высушенных образцов, представлены на рис. 2.
При сублимационной сушке частицы грибов в большей степени сохраняли свой первоначальный объем. Уменьшение его величин для сублиматов вешенки в среднем составило 10,3 против 46,4% у образцов высушенных суховоздушным способом.
Лиофильно высушенные грибы имели рыхлую структуру (рис. 2, В), характеризовались равномерным объемным распределением небольших пор, размеры и общее количество которых почти вдвое превышало таковые в свежей вешенке. Образцы, полученные сухо-воздушным способом, имели в своей структуре крупные каверны (рис. 2, Б).
Результаты количественной микротомографической оценки пористости высушенных плодовых тел вешенки представлены в табл. 2.
Структура разных образцов высушенной вешенки характеризовалась значимыми различиями в обеих системах пористости: открытой и закрытой. Столь отличающиеся параметры позволяют говорить о разных причинах возникновения пористости. Открытые поры, доля которых значительно преобладала в высушенных грибах по сравнению со свежими, явно являются дефектом сушки и выступают так называемой вторичной технологической пористостью. При этом максимальное количество открытых пор было зарегистрировано в сухих образцах, полученных суховоздушным способом.
Количество закрытых пор в сублиматах вешенки статистически не отличалось от такового в свежих образцах и почти вдвое превышало их представительство в частицах грибов, высушенных суховоздушным способом. Данная система пор, вероятно, напротив, имеет природное происхождение, а потому может характеризоваться как первичная и наиболее отражать значение истинной пористости.
Гистологически и рентгенологически зарегистрированные структурные различия образцов сухой вешенки сочетались с неодинаковой их гидратационной способностью, которая выступает своего рода мерой структурного повреждения продукта во время сушки. Выявленные у грибов, высушенных суховоздушным способом, структурный коллапс и наличие корочки подсыхания, которая может закрывать капиллярные ходы, подтверждались меньшей регидратационной способностью этих образцов.
Расчетный показатель регидратации для вешенки, высушенной методом сублимации, составил 5,4±0,1, против 3,2±0,1 для образцов, полученных суховоздушным способом. Время максимального влагопоглощения, определяемое при температуре воды +60 °С, составило соответственно 22,7±1,8 и 45,3±2,9 мин.
Это показывает, что условия сублимационной сушки по сравнению с суховоздушной увеличивают коэффициент и скорость водопоглощения сухой вешенки и могут обеспечивать значительное сокращение времени ее кулинарной обработки, облегчать включение в качестве пищевых ингредиентов и повышать эффективность экстракции биологически активных веществ при получении компонентов для функциональных пищевых продуктов [38].
Данные по влиянию способов сушки на показатели пищевой ценности образцов сухой вешенки, полученных разными способами дегидратации, приведены в табл. 3.
Оба способа сушки вешенки позволяют получить образцы сухих грибов с одинаковым содержанием общих липидов. При этом количество водорастворимых белков в сухой вешенке, полученной суховоздушным способом, превышало в 3 раза таковое в свежих грибах. Это, вероятно, объясняется тем, что термическая обработка вызывает деградацию большинства белков, стабилизированных слабыми связями и, как следствие, приводит к увеличению их растворимости и диффузии в раствор [39].
Вместе с тем, несмотря на меньшую температуру лиофильного высушивания, количество экстрагируемого белка из сублиматов вешенки почти 4,5 раза превышало его в экстрактах необработанных грибов и в 1,5 раза оказалось выше, чем в экстрактах грибов, высушенных суховоздушным способом. Это подтверждает ранее полученные данные [40] и объясняется изменением свойств клеточных стенок грибов при замораживании и последующей дегидратацией в вакууме, способствующих лучшему высвобождению белковых веществ. Также это может быть связано с большей активностью воды при суховоздушном способе обезвоживания грибов и, как следствие, с более интенсивно происходящими ферментативными процессами автогидролиза белков, что подтверждается достоверно значимым преобладанием на 65,7% концентрации свободных аминокислот в этих образцах вешенки по сравнению с сублиматами.
Содержание полисахаридов в грибах, высушенных суховоздушным и сублимационным способами, по сравнению со свежими образцами оказалось меньше на 49,2 и 20,7% соответственно, что подтверждает сведения о снижении полисахаридного компонента в биологических объектах при дегидратации, особенно длительной [41]. Значительная разница в количестве полисахаридов между образцами сухих грибов в пользу сублиматов может обусловливаться как более высокой температурой суховоздушного высушивания, приводящей к процессам карамелизации и реакциям меланоидинообразования [42, 43], так и меньшей активностью воды при лиофилизации и, как следствие, снижением скорости ферментативных реакций, приводящих к переводу сложных высокомолекулярных полисахаридов в простые [44, 45]. Это логически подтверждается выявленным достоверно меньшим количеством моно- и дисахаридов в лиофильно высушенной вешенке по сравнению с образцами, полученными суховоздушным способом. Разница между данными значениями в пересчете на свободную глюкозу составила 22%.
Таким образом, сопоставляя полученные результаты, можно говорить о том, что способ сублимационного высушивания в большей степени обеспечивает сохранение белкового и полисахаридного компонентов вешенки, которые обеспечивают ее высокую биологическую активность [46, 47]. Более выраженные реакции автогидролиза, происходящие в грибах в процессе сухо-воздушного высушивания, характеризуют данный способ сушки как более эффективный в плане обеспечения доступности и повышения усвояемости содержащихся в плодовых телах вешенки трудноперевариваемых белков и полисахаридов.
Одними из основных показателей, определяющих гиполипидемический потенциал вешенки, являются концентрация ловастатина и уровень антиоксидантной активности [48, 49]. Ловастатин - это природный статин, содержащийся как в мицелии, так и в плодовых телах вешенки, гиполипидемическое действие которого основано на снижении выработки эндогенного холестерина в организме [50].
Полученные результаты количественной оценки содержания ловастатина в грибах показывают, что условия применяемых способов сушки не одинаково отразились на его сохранности. Содержание ловастатина в образцах свежей вешенки составило 348±8,7 мг/кг, что согласуется с данными литературы [50, 51] для плодовых тел вешенки (Pleurotus ostreatus). Концентрация ловастатина в сублиматах не имела существенных отличий от таковой в необработанных образцах, составила 342±9,0 мг/кг и достоверно в 1,8 раза превышала ее значение в образцах, полученных суховоздушным способом (190±6,0 мг/кг). Такая статистически значимая разница свидетельствует о том, что ловастатин, содержащийся в вешенке, подвергается деградации или химическим превращениям в процессе суховоздушной сушки и позволяет считать сочетания температуры, не превышающей 30 0С, и вакуума сублимации оптимальными условиями в плане обеспечения его высокой сохранности.
Антиоксидантные свойства препятствуют накоплению липоперекисей, являющихся фактором патогенеза гиперлипидемий [52]. Применение порошка высушенной вешенки в качестве диетической добавки в количестве 30 г в сутки сопровождается гиполипидемическим эффектом за счет способности поглощать радикалы кислорода и ингибировать циклооксигеназу [53]. Данная активность вешенки обеспечивается целым комплексом входящих в ее состав веществ: фенольные соединения, полисахариды, токоферолы и стеролы [54-56]. В связи с чем в настоящем исследовании была проведена оценка суммарной антиоксидантной активности сухих грибов.
Согласно полученным данным, применяемые способы сушки оказали отрицательное влияние на антиоксидантную способность плодовых тел вешенки, что согласуется с рядом исследований [57, 58]. Измеренная in vitro величина антиоксидантной активности свежих грибов составила 4,10±0,04 ммоль/100 г. Для вешенки, высушенной суховоздушным и сублимационным способами, этот показатель оказался статистически значимо ниже и насчитывал соответственно 2,0±0,03 и 3,83± 0,02 ммоль/100 г. По мнению некоторых авторов [41], это может быть обусловлено вызванными нагреванием процессами деструкции термолабильных веществ, отвечающих за антиоксидантную активность, в частности полисахаридов, что подтверждается результатами, приведенными выше, а также, согласно экспериментальным сведениям [55, 57], может быть связано с ферментативной деградацией антиоксидантных соединений при использовании длительных низкотемпературных способов высушивания. При этом величина антиоксидантной активности грибов, высушенных суховоздушным способом, почти вдвое оказалась меньше по сравнению с таковой лиофилизированных образцов, что позволяет характеризовать условия сублимационной сушки более щадящими по сравнению с суховоздушной в плане сохранения биологически активных веществ, обеспечивающих антиоксидантные свойства плодовых тел вешенки.
Заключение
Проведен анализ некоторых пищевых свойств и гиполипидемического потенциала сухой вешенки, полученной двумя способами: сублимационным и суховоздуш-ным. Выявлено, что сублимационный способ высушивания по сравнению с суховоздушным в большей степени позволяет сохранять цвет, клеточную целостность, пористость, размер и форму грибов, а также повышает регидратационную способность.
Доказано, что сублимация способствует сохранению биологически активных белкового и полисахаридного компонентов вешенки, а условия суховоздушной сушки, напротив, за счет более выраженных реакций автогидролиза могут обеспечивать доступность и легкую усвояемость сухих грибов.
Установлено, что для вешенки как биологически активного сырья для получения функциональных пищевых продуктов липидкорригирующей направленности выбор условий дегидратации как способа переработки имеет принципиальное значение. Содержание природного статина (ловастатин) и уровень суммарной антиоксидантной активности, обеспечивающие гиполипидемический потенциал вешенки, максимально сохраняются при использовании сублимационной сушки.
Полученные результаты расширяют сведения об эффективных способах высушивания грибного сырья и могут учитываться при разработке новых функциональных пищевых продуктов на основе плодовых тел вешенки.
Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/216).