Биологическая ценность белка творога, изготовленного с применением трансглутаминазы, и особенности его влияния на растущих крыс

Резюме

Проведена сравнительная оценка биологической ценности белка творога, выра­ботанного по традиционной технологии и с применением микробной трансглутаминазы. Биологический эксперимент проведен на растущих лабораторных крысах стока Вистар, получавших в составе полусинтетического рациона в качестве белка (в количестве 10% от общей калорийности рациона) анали­зируемые образцы творога. На протяжении 22 сут анализировали показатели поедаемости корма и прироста массы тела животных. В обменный период (с 23-х по 24-е сутки), помимо перечисленных показателей, индивидуально учи­тывали количество экскретируемого с фекалиями и мочой азота. Биологическую ценность белков творога, выработанного с применением трансглутаминазы и по традиционной технологии, оценивали, определяя коэффициенты эффек­тивности белка, истинной усвояемости азота, азотного баланса. Помимо этого, по окончании обменного периода оценивали иммунную составляющую крови и катаболизм белков посредством биохимического анализа сыворотки крови. Результаты исследований in vivo позволяют высказать предположение об увеличении биологической ценности и усвояемости белка творога посредством ферментативной модификации белков молока. Выявленное достоверное увели­чение концентрации общего белка (на 4%), азота мочевины (свыше 20%) и уров­ня креатинина коррелирует с большим количеством белка опытного продукта, потребленного животными в обменный период. Отмеченное снижение количес­тва лейкоцитов и лимфоцитов в крови крыс, потреблявших опытные образцы творога, свидетельствует о целесообразности дополнительных исследований иммунных реакций. Расчет показателей, характеризующих биологическую ценность белка творога, исходя из его аминокислотного состава, показал увеличение аминокислотной несбалансированности в твороге, выработанном с применением трансглутаминазы, в основном за счет избытка лизина и соот­ветствующее снижение усвояемости на 1,7%.

Ключевые слова:трансглутаминаза, модификация белка, творог, аминокислотный состав, биологическая ценность, крысы, усвояемость азота, биохимические показатели крови

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 2. С. 44-52. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10018.

В настоящее время особое внимание уделяется раз­работкам стратегий по повышению биологической ценности пищевых продуктов, реализуемых путем моди­фикации состава и внесения различных функциональ­ных ингредиентов и модулей. Применение специализи­рованных видов пищевых добавок, модифицирующих белок, может способствовать повышению его биологи­ческой ценности, обусловленной дополнением лимити­рующими незаменимыми аминокислотами. Одним из путей повышения пищевой ценности молочных продук­тов может стать разработка технологий эффективно­го использования побочных продуктов, образующихся в процессе производства.

Стоит отметить, что при использовании современных технологий получения творога более 70% сыворотки практически не перерабатывается. При этом молочная сыворотка, в которую в процессе производства перехо­дит около 50% сухих веществ молока, содержит, кроме углеводов, липидов, органических кислот, минеральных солей, витаминов и ферментов, от 0,5 до 1,5% белка, включая казеин и сывороточные белки, являющиеся дополнительным источником триптофана, цистина, ли­зина, лейцина, гистидина, метионина, треонина [1].

Модификация белка путем ферментативного сши­вания с помощью трансглутаминазы (ТГ) позволяет улучшить его функционально-технологические свойства (термостабильность, гелеобразующая и эмульгирующая способность, растворимость и др.) [2-5]. Использование ТГ при производстве творога способствует также реше­нию проблемы увеличения выхода продукта, уменьше­ния потерь сухих веществ с сывороткой и, кроме того, снижения степени загрязнения сточных вод предпри­ятий [6, 7].

Однако, несмотря на многочисленные свидетельства преимуществ использования ТГ для сшивания функ­циональных молочных белков, данных о влиянии пот­ребления молочных продуктов, в частности творога, полученного с применением ферментативной модифи­кации, на усвоение нутриентов организмом недоста­точно. Известно, что использование ТГ может приводить к появлению дополнительных ковалентных перекрест­ных связей между белками пищи, вызывая тем самым существенные изменения в их структуре, и оказывать негативное влияние как на пищевые качества конечного продукта, так и на общее состояние организма [8]. Не­смотря на то что во всем мире проводятся исследования по изучению постпрандиальных эффектов ферментативно сшитых белков животного происхождения, появ­ляются публикации, в которых высказываются гипотезы о том, что микробные ТГ могут выступать в качестве нового экологического триггера глютеновой энтеропатии. Эти предположения преимущественно строятся на том, что микробные ТГ, так же как и эндогенные ТГ тканей человека, дезаминируют/трансаминируют глютен и способны, сшивая белки и другие макромолекулы, изменять их антигенные свойства за счет повышения стабильности белка против собственных протеиназ ор­ганизма и неполного гидролиза чужеродного белка, что при повышенной кишечной проницаемости может приводить к увеличению антигенной нагрузки на иммун­ную систему организма [8]. Помимо этого, опасения по поводу широкого применения ТГ связаны с вопросом биодоступности лизина обработанных продуктов, так как в результате воздействия ТГ образуются сшивки между глутамином и лизином [9].

Отдельно стоит отметить недостаточность исследова­ний по оценке качественных характеристик молочных продуктов, изготовленных с применением ТГ. Очевидно, что образование ковалентных перекрестных связей аминокислот в той же самой или в другой белковой молекуле белка может снизить усвояемость и биологи­ческую доступность незаменимых аминокислот, участ­вующих в реакции сшивания. В связи с этим актуально изучение биологической ценности и усвояемости белка конечного продукта, изготовленного с применением ТГ.

Цель исследований - сравнительное изучение биоло­гической ценности и усвояемости белка творога, под­вергавшегося ферментной модификации.

Материал и методы

Объектами исследований являлись образцы молоч­ного продукта - творога, изготовленного по тради­ционной технологии (КТ), и творога, изготовленного с использованием ТГ (ТТГ) [10].

Аминокислотный состав обоих видов творога опреде­ляли методом ионообменной хроматографии на амино­кислотном анализаторе LC-5000 ("Biotronik", Германия), расчет содержания аминокислот производили автомати­чески с помощью Chromatopac C-R3A ("Shimadzu", Япо­ния). Исходя из аминокислотного состава анализируе­мых продуктов с целью оценки его сбалансированности и биологической ценности белка были рассчитаны сле­дующие критерии: коэффициент избыточности незаме­нимых аминокислот, характеризующий общее количес­тво аминокислот, которое теоретически из-за взаимной несбалансированности не может быть утилизировано организмом на анаболические нужды; коэффициент сопоставимой избыточности, характеризующий сум­марную массу неутилизируемых аминокислот в таком количестве оцениваемого белка, которое эквивалентно их потенциально утилизируемому содержанию в 100 г белка-эталона; показатель усвояемости белка [11, 12].

Биологический эксперимент проводили на 33 расту­щих белых крысах-самцах стока Вистар, полученных из филиала "Андреевка" ФГБУН "Научный центр биоме­дицинских технологий" ФМБА России. После прохожде­ния карантина в течение 10 сут крыс произвольно раз­делили на 3 группы по 11 животных. Средняя масса тела крыс на начало эксперимента составила 88,0±10,0 г На протяжении всего срока проведения исследований экспериментальные животные получали изокалорийные (400 ккал/100 г сухого корма) полноценные рационы с содержанием расчетного уровня белка 10% по ка­лорийности, представленного для контрольных крыс 3-й группы казеином (К), для опытных крыс 1-й и 2-й групп - ТТГ и КТ (табл. 1). Рацион был рассчитан и скор­ректирован на основании химического состава иссле­дуемых образцов. Кормление животных осуществляли ежедневно в одно и то же время, в период с 15.00 до 16.00. Животные потребляли воду, полученную на ус­тановке водоподготовки ("Merck Millipore", Германия) и минерализованную путем добавления минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального состава.

С 1-х по 22-е сутки включительно животных содер­жали в стандартных условиях вивария при свобод­ном доступе к воде и пище в пластмассовых клетках TECNIPLAST тип IV S, в которые помещали не более 6 крыс (в соответствии с нормами размещения живот­ных) [13]. Условия содержания животных были стандар­тизированы: температура - 20±3 °С, влажность - 48±2%, освещение режим день/ночь (с 6.00 до 18.00/с 18.00 до 6.00). В качестве подстила использовали березовую стружку. В этот период учитывали прирост массы тела животных с помощью электронных технических весов Ohaus ("Adventurer Pro", США) с точностью ±0,1 для оп­ределения массы тела животных.

С 23-х по 24-е сутки, в обменный период, животных всех групп пересаживали в индивидуальные метаболи­ческие клетки ("Techniplast", Испания). После пищевой депривации (10 ч) животным индивидуально скармли­вали соответствующие рационы, содержание белка в которых определяли методом Кьельдаля [14], исполь­зуя коэффициент пересчета с общего азота на белок (6,25). На протяжении 3 дней ежедневно учитывали массу тела животных, индивидуальные показатели поедаемости корма, собирали фекалии и мочу, определяя в них содержание азота на аппарате Кьельтек 2300 ("Foss Tecator", Швеция).

Для оценки влияния потребления КТ и ТТГ на расту­щих крыс рассчитывали следующие показатели [15, 16]:

- коэффициент эффективности белка (КЭБ) (PER):

где ΔΒ - прирост массы тела животного в процессе проведения эксперимента (г); Ip - суммарное количес­тво белка (г), потребленного животным за тот же пе­риод;

- истинную усвояемость (Dист) азота исследуемых об­разцов/казеина по формуле:

где I - общее количество азота (г), потребленного в составе рациона крысой в течение обменного периода; F - количество азота (г), экскретированного с калом крысой в течение обменного периода; F0 - эндоген­ный азот кала (г) крысы, гипотетически находившейся на безбелковой диете, в течение такого же обмен­ного периода. Значение показателя F0 принято равным 0,020 [17];

- биологическую ценность (БЦ) по формуле:

где U - количество азота (г), экскретированного с мочой крысой в течение обменного периода; U0 - эндоген­ный азот мочи (г) крысы, гипотетически находившейся на безбелковой диете, в течение такого же обмен­ного периода. Значение показателя U0 принято равным 0,005 [17];

- азотистый баланс (А) по формуле:

По окончании эксперимента (25-е сутки) животных усыпляли в камере для эвтаназии ("Vet Tech", Ве­ликобритания) с помощью углекислого газа, отби­рали из левого желудочка сердца кровь. Анализ проб цельной крови проводили на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacus junior vet 2.7 ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), исполь­зуя наборы реактивов Diatron, сыворотки крови - на автоматическом биохимическом анализаторе BioChem FC 360 ("HTI", США), используя наборы реактивов High Technology (США).

Эксперимент проводили в соответствии с требо­ваниями приказа Минздрава России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил надлежащей ла­бораторной практики", Директив Европейского сооб­щества 86/609EEC и 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей (Европейского парламента и Совета Европейского союза).

Статистическую обработку проводили с использо­ванием пакета программ Statistica 10.0. Результаты представлены в виде взвешенного среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверность различий сред­них величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, оценивали мето­дом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA с применением критерия Дункана). Критический уро­вень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Аминокислотный состав и скор незаменимых амино­кислот контрольного и опытного образцов творога отно­сительно идеального (эталонного) белка представлены в табл. 2.

Полученные результаты показали, что содержание практически всех незаменимых аминокислот одинаково в обоих видах творога, за исключением лизина, содер­жание которого в ТТГ выше почти на 21 мг в 1 г белка. В обоих образцах творога минимальный скор определен у изолейцина. Относительно казеина, выбранного в ка­честве контроля сравнения, можно отметить высокое со­держание глутаминовой кислоты, лизина и изолейцина (превышает значения исследуемых продуктов более чем на 20%) согласно данным изготовителя, а также источникам литературы [18].

Показатели, характеризующие биологическую цен­ность белка рационов, исходя из аминокислотного со­става, рассчитанные по методике, разработанной ака­демиками Н.Н. Липатовым-младшим и И.А. Роговым на основе развития принципа Митчелла-Блока, пред­ставлены в табл. 3. Анализ аминокислотной сбалан­сированности показал, что в диете с использованием в качестве источника белка образца творога, изготовленного с применением ТГ, сопоставимая избыточ­ность содержания незаменимых аминокислот выше на 1,2 г/100 г белка, при этом показатель усвояемости незаменимых аминокислот на анаболические цели ниже на 1,7 г/100 г. Таким образом, рациональное использова­ние и, соответственно, биологическая ценность белка ТТГ ниже, чем КТ, вследствие большей аминокислотной разбалансированности, обусловленной в основном уве­личением количества лизина (на ~30%). Это объясня­ется, очевидно, специфичностью действия ТГ.

При проведении биологического эксперимента было выявлено увеличение среднесуточной прибавки массы тела у животных всех групп (см. рисунок), при этом в период с 1-х по 22-е сутки установлен достоверный прирост массы тела крыс 3-й группы. По окончании обменного периода масса тела крыс 1-й и 2-й групп была ниже, чем у животных, получавших в качестве источника белка казеин, однако различия не достигали уровня статистической значимости. Эффективность утилизации белка, выражаемая КЭБ, как в период с 1-х по 22-е сутки, так и в обменный период была также выше у контрольных крыс 3-й группы. Стоит отметить, что усредненные значения коэффициента эффектив­ности белка за 22 сут статистически значимо не раз­личались у крыс всех групп. Результаты определения истинной усвояемости белка крысами и биологической ценности анализируемых продуктов (табл. 4) свидетель­ствуют о том, что среднее количество белка, потреблен­ного в составе рациона за сутки обменного периода, было одинаковым для животных 1-й и 2-й групп и незна­чительно больше, чем у животных контрольной группы. При этом экскреция азота с мочой была меньше у крыс 1-й и 2-й групп, а с фекалиями - у животных 3-й группы. Следует отметить, что у животных 3-й группы при на­именьшем количестве азота, выделенного с фекалиями, наблюдалась более выраженная элиминация азотсо­держащих продуктов с мочой. Выявлено, что белок ТТГ обладает большей биологической ценностью, чем белок КТ и К. Коэффициент истинной усвояемости белка ТТГ был ниже, чем белка казеина, но выше белка КТ. При этом азотистый баланс экспериментальных крыс всех групп достоверно не различался.

Для выявления нежелательных эффектов, сопряжен­ных с потреблением продукта с частично "сшитым" белком, по окончании обменного опыта был проведен анализ показателей крови, характеризующий состояние лейкоцитов (табл. 5). Полученные результаты показали, что у крыс 1-й группы (ТТГ) концентрация лейкоцитов была снижена на 20,4% по сравнению с показателем животных 3-й группы (К) преимущественно за счет снижения содержания лимфоцитов (свыше 25%). При этом у крыс этой группы выявлено недостоверное увеличе­ние относительного содержания гранулоцитов. У живот­ных 2-й группы анализируемые показатели статисти­чески значимо не отличались от показателей животных 3-й группы, однако выявлено статистически значимое снижение содержания моноцитов практически в 2 раза. Выявленная тенденция может указывать на возмож­ность образования при расщеплении белков ТТГ не­большой доли негидролизованных коротких пептидов, опосредованно оказывающих влияние на активацию иммунных реакций.

Для более полного понимания катаболизма белка исследуемых продуктов были проанализированы био­химические показатели сыворотки крови животных, характеризующие белковый обмен (табл. 6). У крыс 1-й и 2-й групп (ТТГ и КТ) относительно контрольных жи­вотных 3-й группы выявлено статистически значимое увеличение концентрации общего белка на 4,3 (ТТГ) и 4,1% (КТ) и азота мочевины на 21,5 и 30,3% соответст­венно. Интересно отметить незначительное (до 6%, p<0,05) повышение уровня креатинина в сыворотке крыс 1-й группы относительно показателей животных 2-й и 3-й групп. Данная тенденция может быть связана с не­обходимостью катаболизма большего количества белка, потребленного животными в обменный период.

На основании выполненных исследований необхо­димо отметить, что показатели, характеризующие био­логическую ценность белка опытных образцов про­дукта, изготовленного с применением ТГ, полученные расчетным путем, расходятся с результатами проведен­ного эксперимента на модели биологической системы. Увеличение аминокислотной несбалансированности в твороге, выработанном с применением ТГ, в основном за счет избытка лизина, не приводило к увеличению ко­личества неутилизируемого азота крысами, что может объясняться более высокими потребностями крыс в лизине. Снижения усвояемости белка с учетом вновь образованных дополнительных глутаминил-лизиновых связей, судя по биометрическим показате­лям животных, не отмечено. Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов, которые выявили, что изопептидная связь, индуцированная ТГ между глутамином и лизином, расщепляется под дейс­твием ферментов желудочно-кишечного тракта и почек крыс [20, 21].

Проведенная сравнительная оценка кисломолочных продуктов - творога, изготовляемого с применением ТГ и по традиционной технологии, на растущих крысах сви­детельствует о том, что значения таких показателей, как потребление и экскреция азота, коэффициент эффек­тивности белка, коэффициент биологической ценности, истинная усвояемость азота, азотистый баланс и при­рост массы тела крыс, потреблявших в составе рациона творог, изготовленный с применением ТГ, незначительно (на 1,3-4,9%) превышали значения, полученные для кон­трольного образца творога. Колебания анализируемых гематологических и биохимических показателей крови экспериментальных животных не выходили за пределы физиологической нормы.

Полученные результаты имеют важное значение, по­скольку показывают, что перекрестная "сшивка" белка, повышающая степень использования пищевого сырья при производстве творога, по крайней мере не ока­зывает при этом отрицательное влияние на его усво­яемость и биологическую ценность, что согласуется с данными C.F.V. de Souza и др. [22], которые из экспе­риментов на крысах Вистар, потреблявших в составе рациона "сшитый" ТГ белок сухого молока, получили значения БЦ 94,59 и 94,19% для контрольной и опытной групп соответственно.

Таким образом, можно заключить, что введение в рацион растущим крысам Вистар молочного продукта (в количестве 10% белка от общей калорийности ра­циона) не вызывало отрицательных эффектов на анализируемые ростовые показатели животных. При этом отмеченное перераспределение иммунных клеток крови крыс, потреблявших творог, изготовленный с примене­нием микробной ТГ, указывает на необходимость про­ведения дальнейших исследований, в том числе на­правленных на понимание реакций взаимодействия ТГ с казеинами и сывороточными белками, процессов гидро­лиза пищеварительными ферментами модифицирован­ных белков и путей образования биоактивных пептидов, обладающих как позитивными (например, GMP-подоб-ные пептиды), так и негативными (модифицированные трансаминированные пептиды Glu-C) эффектами.

Литература

1. Храмцов А.Г., Молчанов Г.И., Жидков В.Е., Лунькова Л.В. Производство и использование белков молочной сыворотки в лечебно-диетическом питании: обзорная информация. Сер. Молочная промышленность. М. : АгроНИИТЭИПП, 1993. 32 с.

2. Zhu Y., Rinzema A., Tramper J., Bol J. Microbial transglutaminase -a review of its production and application in food processing // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. Vol. 44. P. 277-282.

3. Liu M., Damodaran S. Effect of transglutaminase-catalyzed polymer­ization of beta-casein on its emulsifying properties // J. Agric. Food Chem. 1999. Vol. 47, N 4. P. 514-519.

4. Lorenzen P.C. Renneting properties of transglutaminase-treated milk // Milchwissenshaft. 2000. Vol. 55. P. 433-437.

5. O'Sullivan M.M., Kelly A.L., Fox P.F. Effects of transglutaminase on the heat stability of milk: a possible mechanism // J. Dairy Sci. 2002. Vol. 8. P. 1-7.

6. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Шарапова Т.А. Технологические и медико-биологические аспекты действия трансглутаминазы // Изв. СПбГУНиПТ. 2009. № 3, 4. С. 47-49.

7. Зенина Д.В. Современные тенденции в повышении качества традиционного творога // Мол. пром-сть. 2012. № 5. С. 16-17.

8. Lerner A., Torsten M. Possible association between celiac disease and bacterial transglutaminase in food processing: a hypothesis // Nutr. Rev. 2015. Vol. 73, N 8. Р. 544-552.

9. Monogioudi E., Faccio G., Lille M., Poutanen K., Buchert J., Mattinen M.-L. Effect of enzymatic cross-linking of β-casein on proteolysis by pepsin // Food Hydrocolloids. 2011. Vol. 25. P. 71-81.

10. Зобкова З.С., Зенина Д.В. О влиянии микробной трансглутаминазы на процессы модификации молочных белков при производстве творога // Научное обеспечение молочной промышленности : сборник научных трудов. М. : ГНУ ВНИМИ, 2012. С. 79-84.

11. Покровский А.А. Биохимические обоснования разработки продуктов повышенной биологической ценности // Вопр. питания. 1994. № 1. С. 1-3.

12. Липатов Н.Н. Принципы и методы проектирования рецептур пищевых продуктов, балансирующих рационы питания // Изв. вузов. Пищевая технология. 1990. № 6. С. 5-10.

13. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washing­ton, DC : National Academies Press, 2011. 248 р.

14. Скурихин И.М., Тутельян В.А. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. М. : Медицина, 1998. 142 с.

15. Покровский А.А. О биологической и пищевой ценности продуктов питания // Вопр. питания. 1975. № 3. С. 25-39.

16. Pellett P.L., Young V.R. Nutritional Evaluation of Protein Foods. Tokyo : The United Nations University, 1980. 162 p.

17. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопр. питания. 1979. № 3. С. 48-52.

18. Просеков А.Ю., Курбанова М.Г. Анализ состава и свойств белков молока с целью использования в различных отраслях пищевой промышленности // Техника и технология пищевых производств. 2009. № 4. С. 68-71.

19. Evans G.O., George A. Animal Clinical Chemistry: A Practical Hand­book for Toxicologists and Biomedical Researchers. 2nd ed. UK : CRC Press, 2009. 368 р.

20. Seguro K., Kumazawa Y., Kuraishi C., Sakamoto H., Motoki M. The epsi-lon-(gamma-glutamyl)lysine moiety in cross-linked casein is an avail­able source of lysine for rats // J. Nutr. 1996. Vol. 126. P. 2557-2562.

21. Hultsch C., Bergmann R., Pawelke B., Pietzsch J., Wuest F., Johannsen B. et al. Biodistribution and catabolism of 18 F-labelled isopeptide Ne-(c-glutamyl)-L-lysine // Amino Acids. 2005. Vol. 29. Р. 405-413.

22. De Souza C.F.V., Venzka J.G., Flores S.H.,.Ayub M.A.Z. In vivo evalu­ation of cross-linked milk and wheat proteins mediated by microbial transglutaminase in white Wistar rats // Am. J. Food Technol. 2009. Vol. 4, N 3. P. 96-107.