Изучение влияния интоксикации кадмием на модели витаминно-минеральной недостаточности у крыс

Резюме

В статье представлены результаты исследований, направленных на подтверж­дение эффективности модели снижения адаптационного потенциала крыс в условиях токсического воздействия солями кадмия. Эксперимент длитель­ностью 65 дней проведен на самцах и самках крыс линии Вистар. Животные были разделены на 6 групп - 3 контрольные и 3 опытные по 30 самцов и самок в каждой. Всего в эксперименте было использовано 360 крыс (180 самок и 180 сам­цов). Животные 1-й контрольной группы получали рацион с оптимальной (75% от уровня стандартного полусинтетического рациона) дозировкой витаминов В1, В2, В3, В6 и минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+, животные 2-й и 3-й контрольных групп - рационы с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозиров­ками эссенциальных пищевых веществ. Животные 1-3-й опытных групп получали с кормом Cd2+ на фоне оптимальной, маргинальной и субмарги­нальной обеспеченности эссенциальными микронутриентами. Были изуче­ны гематологические, биохимические, морфологические показатели, а также состояние антиоксидантного статуса крыс. Анализ полученных резуль­татов позволил выявить закономерности усиления эффекта токсического действия кадмия на фоне снижения обеспеченности эссенциальными микронутриентами (в ряду от оптимальной до субмаргинальной). Такие измене­ния демонстрировали эритроцитарный и тромбоцитарный профили крови, а также комплекс показателей системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов крови и печени. Так, активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов (глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы) у крыс 1-й опытной группы была в среднем на 23% выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й и 3-й опытных групп - выше соответственно на 62 и 67%. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени самцов и самок крыс демонстрировало сходную динамику: повышение на 5% в 1-й опытной группе, на 9 и 25% - во 2-й и в 3-й опытных группах соответственно. Таким образом, предложенная моди­фикация витаминно-минерального состава рационов может быть использована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсиколо­гических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой продукции.

Ключевые слова:нагрузочный тест, дефицит витаминов, адаптационный потенциал, витаминно-минеральный состав рационов, лабораторные животные, токсическая нагрузка солями кадмия

Вопр. питания. 2018. Т. 87. № 1. С. 63-71. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10007.

Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является использование раци­она, дефицитного по содержанию эссенциальных пище­вых веществ [1]. Данное исследование было направлено на подтверждение эффективности модели дефицита витаминов группы В (тиамина, рибофлавина, ниацина и пиридоксина), солей железа и магния, биологическая роль которых к настоящему времени хорошо известна, для использования в токсикологических исследованиях: поскольку дефицит эссенциальных веществ и связан­ные с ним метаболические нарушения приводят к сни­жению адаптационных возможностей организма [2, 3], есть все основания предполагать, что вследствие этого может повыситься чувствительность к токсическому воздействию.

В качестве токсического фактора был выбран кадмий -токсический агент, действие которого на физиолого-биохимические показатели организма млекопитающих не вызывает сомнения и подробно охарактеризовано [4, 5]. На основании данных о характере проявления токсического действия в зависимости от дозы и времени экспозиции [6] была использована доза кадмия, токсическое действие которой установлено - 1-2 мг на 1 кг массы тела в зависимости от возраста крыс (в пересчете на Cd2+).

Цели настоящей работы - подтверждение эффектив­ности модели последовательного снижения адаптаци­онного потенциала крыс в условиях токсического воз­действия солями кадмия, а также выявление наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей.

Материал и методы

Эксперимент длительностью 65 дней проводили на самцах и самках крыс линии Вистар, исходный возраст ~30 дней. Животные были разделены на 6 групп -3 контрольных и 3 опытных по 30 самцов и самок в каж­дой. Всего в эксперименте было использовано 360 крыс (180 самок и 180 самцов). Животные 1-й контрольной группы получали рацион с оптимальной (75% от уровня стандартного полусинтетического рациона) дозировкой эссенциальных микронутриентов (витаминов В1, В2, В3, В6 и минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+), животные 2-й и 3-й контрольных групп - рационы с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциальных веществ. Животные 1-3-й опытных групп получали с кормом Cd2+ (в виде CdCl2) на фоне оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности эссенциальными пищевыми веществами соответственно. Экспериментальные рационы, представляющие собой полусинтетический казеиновый рацион [7, 8] с модифи­цированным составом витаминно-минеральных смесей (табл. 1), крысы получали на протяжении всего срока исследований.

Доза кадмия различалась в зависимости от возраста крыс и составляла 1 мг на 1 кг массы тела с 0-го по 35-й день эксперимента и 2 мг на 1 кг массы тела с 36-го по 65-й день эксперимента. Для данного эксперимента были выбраны заведомо действующие дозы кадмия, не вызывающие острого токсического ответа [6]. Исходя из длительности исследования суммарная доза кад­мия, которую получило каждое подопытное животное, составляла 19,1-24,3 мг у самцов и 17,2-18,9 мг у самок (в зависимости от массы тела).

Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом по­мещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение эксперимента вели наблю­дения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмортальную некропсию и отбор материала для гематоло­гических и биохимических исследований проводили на 65-й день эксперимента.

Для определения гематологических показателей использовали гематологический анализатор "Coulter AcTTM 5 diff OV" и реактивы ("Beckman Coulter", США). Биохимические показатели сыворотки крови определяли на биохимическом анализаторе ("Konelab 20i", Финлян­дия) с использованием реактивов фирмы "Thermo Fisher Scientific". Активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы опреде­ляли спектрофотометрическим методом, содержание малонового диальдегида (МДА) в крови и печени - спектрофотометрическим методом по [9-17]. В статье приве­дены только те показатели, которые демонстрировали значимые отличия от контроля.

Результаты приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, а m - стандартная ошибка, а также в долях (в %) или в абсолютных числах.

Полученные данные обработаны методами парамет­рической статистики: характер распределения количес­твенных признаков определен с помощью х2-критерия Пирсона, равенство дисперсий - с помощью F-критерия Фишера. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсии, оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости (p) принят равным 0,05 [18]. В соответствии со структурой иссле­дования сравнивали количественные признаки опытных групп с соответствующими им контрольными группами.

Результаты и обсуждение

Общее состояние крыс контрольных и опытных групп было удовлетворительным, по внешнему виду, пове­дению и качеству шерстного покрова различий между группами не выявлено. Поедаемость корма самцами контрольных и опытных групп составляла ~14 г/сут на одно животное в начале эксперимента и ~21 г/сут в конце эксперимента, самками ~14 и ~16 г/сут соответственно. При анализе динамики массы тела эксперименталь­ных животных было отмечено, что масса тела самцов и самок 1-3-й опытных групп была во всех случаях ниже, чем у соответствующих животных 1-3-й контрольных групп (в диапазоне от 3 до 12% у самцов и от 1 до 9% у самок) (см. рисунок). Следует отметить, что разли­чия массы тела животных в контрольных группах были более выражены у самцов и варьировали от 5 до 18% и менее выражены у самок - от 9 до 11%.

При сравнении относительной массы внутренних ор­ганов самцов 1-й опытной группы с соответствующими показателями 1-й контрольной группы отмечены до­стоверные различия массы селезенки и легких; у жи­вотных 2-й опытной группы были выявлены различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, мозга, семенников, надпочечников, гипофиза по сравнению с живот­ными 2-й контрольной группы; у животных 3-й опытной группы - различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, легких, тимуса, мозга, семенников, надпочечни­ков, гипофиза по сравнению с животными 3-й контроль­ной группы. При сравнении массы внутренних органов самок 1-й опытной группы с соответствующими показа­телями 1-й контрольной группы отмечены достоверные различия массы печени, почек, сердца, легких; у жи­вотных 2-й опытной и 2-й контрольной групп выявлены различия массы печени, почек, сердца, легких, тимуса, мозга, надпочечников, гипофиза; у животных 3-й опыт­ной и 3-й контрольной групп - различия в массе пе­чени, сердца, легких, мозга, надпочечников, гипофиза (табл. 2). Следует отметить, что все отмеченные измене­ния массы внутренних органов находились в пределах физиологических колебаний (от 1 до 27%), характерных для крыс линии Вистар, и поскольку массы внутрен­них органов у животных опытных групп в большинстве случаев были выше, чем у животных соответствующихконтрольных групп, можно сделать вывод, что различия обусловлены снижением массы тела животных опытных групп (см. рисунок), а это повлияло на расчетный пока­затель относительной массы внутренних органов. Таким образом, выявленные различия нельзя расценивать как свидетельство негативного влияния токсического фактора.

Биохимические показатели сыворотки крови у самцов 1-й опытной группы не имели достоверных отличий от контроля. Животные 2-3-й опытных групп демонстри­ровали целый ряд статистически значимых различий с аналогичными показателями у крыс соответствующих контрольных групп [концентрация глобулина, уровни триглицеридов, общего билирубина, мочевины, креатинина, глюкозы, холестерина, активности лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы, аланинамино-трансферазы (АЛТ), содержание кальция, магния, железа, фосфора]. Выявленные различия находились в диапа­зоне физиологических колебаний и варьировали от 4 до 63%, что, согласно опыту наших предыдущих иссле­дований, не является однозначным свидетельством при­сутствия негативного воздействия, поскольку различия биохимических показателей могут быть весьма значи­тельны и у животных, получавших идентичные по со­ставу рационы без токсической нагрузки. В то же время было отмечено, что содержание железа в сыворотке крови самцов 2-й и 3-й опытных групп было ниже нормы в 2,2 и 2,5 раза соответственно. По сравнению с анало­гичными показателями животных 2-й и 3-й контрольных групп концентрация железа была соответственно на 59 и 63% (p<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содер­жание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контрольных значений на 13% (p>0,05) (табл. 3).

Биохимические показатели сыворотки крови у самок 1-3-й опытных групп также демонстрировали статистически значимые различия с аналогичными показате­лями у крыс соответствующих контрольных групп (кон­центрация глобулина, уровни триглицеридов, общего и прямого билирубина, мочевины, мочевой кислоты, креатинина, глюкозы, холестерина, активности лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы, АЛТ, аспартатаминотрансферазы, содержание кальция, магния, железа, фосфора). Выявленные различия в целом находились в диапазоне физиологических колебаний и варьировали от 6 до 67%. Уровень содержания железа в сыворотке крови самок 2-й и-3-й опытных групп был ниже нормы в 1,1 и 1,4 раза соответственно. По сравнению с анало­гичными показателями 2-й и 3-й контрольных групп уро­вень железа был соответственно на 63 и 67% (p<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содержание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контроль­ных значений на 28% (p<0,05) (табл. 3).

Оценка результатов гематологических исследований животных 1-3-й опытных групп позволила выявить оп­ределенные закономерности изменений показателей эритроцитарного профиля: концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее со­держание гемоглобина в эритроците в целом были на 11-44% (p<0,05) ниже, чем соответствующие показатели животных 1-3-й контрольных групп. Общее количество эритроцитов у животных 2-й и 3-й групп было ниже кон­трольных значений на 23 и 25% у самцов и на 10 и 16% у самок соответственно, при этом в 1-й опытной группе значение данного показателя было на ~10% выше, чем у самцов и самок контрольных групп. Средняя концент­рация гемоглобина в эритроците животных 2-3-й опыт­ных групп была выше на 5-6% у самцов и 1-6% (p<0,05) у самок, а животных 1-й опытной группы - на 3 и 3% (p<0,05) ниже таковой у самцов и самок соответствую­щих контрольных групп. Значения показателей тромбоцитарного профиля у крыс опытных групп были зна­чительно выше, чем у крыс контрольных групп: общее количество тромбоцитов и тромбокрит - на 40-156% (р<0,05), средний объем тромбоцита - на 8-26% (р<0,05) (табл. 4).

Показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов эритроцитов у крыс 1-3-й опытных групп проявляли линейные изменения (повышения концентрации) в ряду понижения содер­жания эссенциальных микронутриентов в рационах (табл. 5). Так, у самцов 1-3-й опытных групп активность глутатионпероксидазы возрастала на 38, 71 и 100%, каталазы - на 27, 62 и 117%, супероксиддисмутазы -на 25, 68 и 82% (р<0,05), у самок - на 19, 63 и 69%; 9, 62 и 81%; 19, 55 и 60% (р<0,05) соответственно. Активность глутатионредуктазы в эритроцитах самцов и самок 1-й и 2-й опытных групп демонстрировала сходную тен­денцию и была выше аналогичных показателей у крыс 1-2-й контрольных групп на 26 и 64% (у самцов) и 18 и 52% (у самок). Вопреки сложившемуся тренду у сам­цов 3-й опытной группы активность глутатионредуктазы была лишь на 18% (р<0,05) выше, чем у самцов 3-й контрольной группы, у самок разница составляла 6% (р>0,05).

Содержание МДА в печени крыс опытных групп также повышалось от 1-й к 3-й группе: у самцов отличия от соответствующих показателей 1-3-й контрольных групп составляли 14, 21 и 35% <0,05), у самок - 6, 11 и 25% <0,05). Содержание МДА в эритроцитах самцов 1-3-й опытных групп было выше, чем у контрольных животных на 4, 4 и 24% <0,05), у самок - на 7, 16 и 35% <0,05) соответственно. Концентрация МДА в сыворотке крови самцов и самок 1-2-й опытных групп не имела значимых отличий от контроля, животные 3-й опытной группы демонстрировали некоторое повышение этого показателя: самцы - на 16%, самки - на 14% (р<0,05).

Таким образом, основные цели данного эксперимента были достигнуты: подтверждено снижение адаптацион­ного потенциала и формирование у крыс гипо-, нормо- и гиперчувствительности к воздействию токсических факторов (на примере воздействия солями кадмия), сформирован проект перечня физиолого-биохимических параметров (биомаркеров), реагирующих на токси­ческое воздействие, включающий показатели эритроцитарного и тромбоцитарного профиля крови, содержание железа в сыворотке крови, показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов крови и печени. В последующих двух модельных исследованиях, которые будут проведены по аналогич­ной схеме с этанолом и четыреххлористым углеродом в качестве токсикантов, будет окончательно опреде­лен перечень биомаркеров, подлежащих обязательному изучению в токсикологических экспериментах.

Работа проведена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).

Литература

1. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии, при оценке опасности химических соединений. М. : Медицина, 1975. 328 с.

2. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. 2014. Т.83, № 5. С. 20-25.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

4. Волкова Н.А., Карплюк И.А. Изучение мутагенной активности кадмия при пероральном поступлении // Вопр. питания. 1990. № 1. С. 74-76.

5. Goyer R., Klaassen C., Waalkes M. Metal toxicology. Michigan: Aca­demic Press, 1995. 525 p.

6. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S. et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity // Biotech. Histochem. 2016. Vol. 91, N 3. P. 170-181.

7. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

8. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: Методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

9. Костюк В.А., Потапович А.И. Определение продуктов перекисного окисления липидов с помощью тиобарбитуровой кислоты в анаэ­робных условиях // Вопр. мед. химии. 1987. Т. 33, № 3. С. 115-118.

10. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, № 2. С. 56-58.

11. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, 2. С. 59-61.

12. Ernster L., Nordenbrandt K. Microsomal lipid peroxidation // Meth­ods in Enzymology. Oxidation and Phosphorylation. New York: Ac. Press. 1967. Vol. 10. P. 574-580.

13. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol. 23, N 3. P. 302-311.

14. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. P. 502-506.

15. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46, N 2. P. 849-854.

16. Oshino N., Chance B. The role of H2O2 generation in perfused rat liver and the reaction of catalase compound I and hydrogen donors // Arch Biochem Biophys. 1973. Vol. 154, N 1. P. 117-131.

17. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. Effect of riboflavin depletion and repletion on the erythrocyte glutathione reductase in the rat // J. Nutr. 1971. Vol. 101, N 11. P. 1459-1466.

18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.

19. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. 2. С. 10-16.

20. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam: Elsevier, Norrth-Holland biochemical, 1981. P. 358.

21. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington: Elsevier Academic Press, 2006. 912 p.

22. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. Lond.: Taylor & Francis Limited, 1997. 272 p.