Оценка биологической ценности и антигенности коагулированного белка куриного яйца

Резюме

Целью работы явилось исследование биологической ценности коагулированно­го белка куриного яйца in vivo на растущих крысах-самцах и сравнительная иммунохимическая оценка его антигенности in vitro. Эксперимент проводили на 50 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г. Животных рандомизировали на 3 группы (n=16): контрольную группу (Г1) и 2 опытные группы (Г2 и Г3). Животные всех трех групп получали изокалорийные и изоазотистые рационы: крысы группы Г1 получали базовый полусин­тетический рацион на основе казеина (20% белка казеина по калорийности); крысы опытных групп Г2 и Г3 получали такие же полусинтетические рационы, в которых казеин был полностью заменен соответственно на белок кури­ного яйца (БКЯ) и коагулят БКЯ. Средняя поедаемость корма животными группы Г3, получавшими коагулят БКЯ, была статистически значимо ниже (13,7±0,6 г/сут; р<0,05) по сравнению как с животными контрольной группы Г1 (18,4±0,6 г/сут), так и с животными опытной группы Г2 (19,2±0,5 г/сут). Причем прирост массы тела животных группы Г3, получавших коагулиро­ванный БКЯ, достоверно от контрольных животных группы Г1 не отличался. Уже на 8-е сутки эксперимента прирост массы тела животных группы Г2, получавших нативный БКЯ, был статистически значимо выше по сравнению с другими группами. Коэффициент эффективности белка для животных груп­пы Г3, получавших коагулят БКЯ, был значимо выше (1,96±0,04) по сравне­нию со значениями коэффициента как для животных контрольной группы Г1, получавших казеин (1,49±0,05, р<0,01), так и для животных опытной группы Г2, получавших БКЯ (1,60±0,02, р<0,05). Результаты иммуноферментного тестирования сохранности исходной антигенности овальбумина в нативном БКЯ свидетельствовали, что его содержание составило 33,0% относительно стандарта интактного овальбумина, антигенность которого принята за 100%. Разработанный процесс коагуляции способствовал снижению антигенности до 2,17%. Совокупность полученных данных свидетельствует о высокой биологи­ческой ценности и пониженной антигенности коагулированного БКЯ, что дела­ет перспективным его использование в составе пищевых продуктов массового спроса и специализированных пищевых продуктов.

Ключевые слова:коагулированный белок куриного яйца, биологическая ценность, коэффициент эффективности белка, истинная усвояемость, антигенность

Вопр. питания. 2018. Т. 87. № 1. С. 44-50. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10005.

Сбалансированный аминокислотный состав белка куриного яйца (БКЯ) определяет перспективы его эффективного использования в качестве функцио­нального пищевого ингредиента (ФПИ) в составе широ­кого спектра специализированных пищевых продуктов высокой биологической и пищевой ценности. Раз­работанная технология получения коагулированного БКЯ направлена на расширение ассортимента функ­циональных пищевых яйцепродуктов, характеризуе­мых высокими органолептическими показателями [1]. Проведенное ранее исследование свидетельствует, что в коагулированном яичном белке, получаемом тепловой обработкой и подкислением органическими кислотами яичной массы, содержание незаменимых аминокислот существенно не отличалось от исходного охлажденного белка, за исключением некоторого снижения содержания триптофана вследствие пере­хода этой аминокислоты в сыворотку [2]. Показатели биологической ценности белка, как известно, зависят и от его аминокислотного скора, и от его усвояемости и наиболее обоснованно определяются в биологи­ческом эксперименте на растущих животных или в исследовании с привлечением добровольцев [3]. Важ­ным показателем перспективности применения белка в составе продуктов для питания детей (особенно ран­него возраста) является снижение его потенциальных аллергизирующих свойств, зависящих в определен­ной степени от сохранения исходной антигенности [4]. Соответственно целями нашей работы в плане харак­теристики коагулированного БКЯ стали исследованиеего биологической ценности in vivo на растущих кры­сах-самцах линии Вистар и сравнительная иммунохимическая оценка его антигенности in vitro.

Материал и методы

Коагулированный БКЯ получен отделением от желт­ка куриного яйца, перемешиванием жидкой белковой массы, подкислением лимонной кислотой с добавле­нием хлористого натрия (0,13 и 0,8% соответственно), выдерживанием при комнатной температуре (24 °С) в течение 15 мин и последующей тепловой обработкой смеси в одну стадию до достижении структуры зерненого творога при постоянном перемешивании [5]. После отделения жидкой фазы полученный коагулят был ох­лажден и лиофильно высушен. Нативный БКЯ получен отделением от желтка куриного яйца и лиофильно высушен. В рационе контрольной группы использовали казеин пищевой кислотный ("Тагрис Молоко", РФ, 90% белка).

Содержание антигенных структур овальбумина (интактного овальбумина): в лиофилизированных образцах нативного БКЯ и диспергированного коагулированного БКЯ определяли непрямым иммуноферментным ме­тодом согласно [7], используя в качестве стандарта (интактного овальбумина) 5-кратно перекристаллизо­ванный овальбумин куриного яйца, поликлональные моноспецифические кроличьи антитела против этого белка и автоматический иммуноферментный анализа­тор "ЭФОС 9305" (ОАО "МЗ Сапфир", РФ). Для про­ведения иммуноферментного анализа 1 г образца коа­гулированного БКЯ был диспергирован в 10 см3 0,01 М K-фосфатного буфера рН 7,3±0,1 с 0,15 М NaCI (PBS) в течение 5 мин на установке "Т 25 basic" (Германия) до получения однородной мелкодисперсной взвеси. Затем к 1,0 см3 взвеси добавляли 9,0 см3 PBS, содержащего 0,5% нормальной лошадиной сыворотки.

Сравнительную оценку in vivo биологической и пище­вой ценности коагулированного БКЯ проводили в экспе­рименте на 50 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г, полученных из филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинс­ких технологий Федерального медико-биологического агентства". Исследования на животных выполнены в со­ответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей ла­бораторной практики" и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики". Жи­вотные были адаптированы в лаборатории в течение 7 сут до начала эксперимента. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В эксперимент были взяты животные без при­знаков отклонений здоровья.

Животных распределяли по группам с применением принципа рандомизации таким образом, чтобы сред­няя масса тела животных статистически не различа­лась между группами. После распределения по груп­пам животных содержали по 1 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 25±1 °С. Животные были разделены на 3 группы: контрольную 1-ю группу (n=16) соста­вили крысы с массой тела 119±1,5 г и две опытные, 2-ю и 3-ю группы (n=16), - крысы с массой тела соответс­твенно 118±2,3 и 118±1,9 г. Животные всех групп получали базовый изокалорийный (380 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20% белка казеина по калорийности) полусинтетический рацион. Животные 1-й контрольной группы (Г1) получали рацион, в котором в качестве источ­ника белка использовали казеин, животные опытных 2-й (Г2) и 3-й (Г3) групп получали рацион, в котором казеин был полностью заменен на БКЯ и коагулированный БКЯ соответственно. Состав полусинтетических рационов всех групп представлен в табл. 1.

Воду и корм животные получали ad libitum. На протя­жении всего исследования, длительность которого со­ставила 29 сут, определяли индивидуальные показатели поедаемости корма и прироста массы тела каждого жи­вотного: через сутки на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали.

С 24-х по 26-е сутки, в так называемый обменный пе­риод, помимо перечисленных показателей определяли количество азота в корме и выведенного с калом.

На 29-е сутки депривированных голодом в течение ночи животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. Собранную после декапитации животного кровь центрифугировали в те­чение 15 мин при 500g, сыворотку хранили при -20 °С.

В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" ("Thermo Scientific", Финляндия) опреде­ляли концентрации триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП).

Сравнительное определение биологической ценности коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина "ростовыми" методами. Оце­нивали скорость роста лабораторных животных и оп­ределяли коэффициент эффективности белка (КЭБ) индивидуально для каждой крысы. Определяли при­рост массы тела у лабораторных животных в граммах на 1 г потребленного ими белка [3, 9, 10] и рассчитывали КЭБ по формуле (1):

где ΔW - прирост массы тела крысы (в граммах) за экспериментальный период, Wt - масса тела крысы (в граммах) в последние сутки экспериментального периода, W0 - масса тела крысы (в граммах) в первые сутки экспериментального периода; Ip - количество белка, потребленного крысой (в граммах) за экспери­ментальный период.

Количество белка, потребленного крысой (Ip), рассчи­тывали по его экспериментально определенному содер­жанию в съеденном крысой корме. Съеденный крысой корм (поедаемость) определяли по разности между количеством корма, полученным крысой за весь экспе­риментальный период, и суммарным не съеденным ею остатком этого корма.

Сравнительное определение истинной усвояемости коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина. Метод расчета истинной усво­яемости азота (Dист) основан на определении доли ис­тинно абсорбированного в желудочно-кишечном тракте крысы азота (Аист), выраженной в процентах от азота, потребленного животным с пищей (I). Значение истин­ной усвояемости азота соответствует значению истин­ной усвояемости белка. Количество азота, выделяемого с калом в течение суток крысой, находящейся на без­белковом рационе, принимали равным 0,023 г [10].

Истинную усвояемость белка рассчитывали по фор­муле:

где Dист - истинная усвояемость (в %), I - общее коли­чество азота, потребленного крысой с пищей в течение балансового периода (в граммах), F - количество азота, экскретированного с калом крысой в течение балансо­вого периода (в граммах), Fk - количество азота, экскретированного с калом крысой, находившейся на безбелковой диете в течение такого же балансового периода (в граммах), Аист. - истинное количество азота, абсорбированного в желудочно-кишечном тракте у крысы в течение балансового периода (в граммах).

Истинную усвояемость белка рассчитывали индивиду­ально для каждой крысы.

Содержание общего азота в рационе и фекалиях оп­ределяли методом Кьельдаля (с предварительной мине­рализацией) [6] с применением автоматического анали­затора "Kjeltec 8100" ("FOSS Analytical AB", Швеция).

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непара­метрический ранговый критерий Мана-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента с использованием растущих крыс линии Вистар по сравнительному опре­делению биологической и пищевой ценности коагули­рованного БКЯ, исходного нативного БКЯ и эталонного белка - казеина коровьего молока - общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению при ежедневном осмотре было удовлетворительным.

Средняя поедаемость корма для животных контроль­ной 1-й группы за весь период составила 18,4±0,6 г, для животных опытной 2-й группы - 19,2±0,5 г и для живот­ных 3-й опытной группы - 13,7±0,6 г. Средняя поедаемость корма животными опытной 3-й группы, получав­шими коагулят БКЯ, была статистически значимо ниже по сравнению как с животными 1-й контрольной группы, так и с животными 2-й опытной группы Г2 (р<0,05).

На рис. 1 приведен график изменения массы тела жи­вотных всех групп за весь период эксперимента.

Как видно из представленных данных, уже на 8-е сут­ки эксперимента прирост массы тела животных 2-й опыт­ной группы, получавшей БКЯ, был статистически значимо выше по сравнению с параметром обеих других групп, причем средняя потребляемость корма животными этой группы от контрольной группы достоверно не отличалась. Прирост массы тела животных 3-й опытной группы, полу­чавших коагулированный БКЯ, достоверно от 1-й конт­рольной группы не отличался при статистически значимо более низкой потребляемости корма.

В табл. 2 представлены результаты определения пока­зателей липидного обмена и глюкозы сыворотки крови.

Из представленных данных видно, что статистических различий таких показателей липидного обмена, как концентрации холестерина, триглицеридов и ЛПНП, для всех групп не обнаружено. Концентрация ЛПВПу крыс из 3-й группы было выше (р<0,01) по срав­нению с показателем животных 2-й опытной группы и при этом находилась в пределах нормы для данного вида животных. ЛПВП в первую очередь обеспечивают функцию обратного транспорта холестерина, помимо этого выполняют ряд других протективных функций: осуществляют транспорт полиненасыщенных жир­ных кислот, обладают антиоксидантной активнос­тью, регулируют активность глюкокортикоидов. Выявленное повышение содержания ЛПВП в сыворотке крови животных, потреблявших коагулят БКЯ, отра­жает благоприятное влияние этого белка на липидный обмен.

Концентрация глюкозы натощак у животных опытной группы Г2 была достоверно ниже по сравнению с пока­зателем животных контрольной группы.

В табл. 3 представлены результаты определения из­менений массы тела животных, поедаемости ими корма и истинной усвояемости казеина, БКЯ и коагулята БКЯ в обменный период.

В так называемый обменный период крысы всех групп продолжали набирать массу тела, хотя средние значения этого показателя достоверно не различались. Важно отметить, что при этом более низкой прибавке массы тела животных 3-й опытной группы как по срав­нению с животными контрольной, так и с животными другой опытной группы соответствовала более низкая потребляемость корма.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что среднее количество коагулированного БКЯ, потреб­ляемого крысой с кормом за обменный период, было более чем в 1,5 раза меньше такового для живот­ных, потреблявших стандартный казеиновый рацион и содержащий БКЯ рацион, а истинная усвояемость всех трех белков при этом практически не разли­чалась.

На рис. 2 показаны средние значения коэффициента эффективности казеина, БКЯ и коагулята БКЯ, опреде­ленные за весь период эксперимента.

Как видно из представленных данных, КЭБ для жи­вотных 3-й группы, получавших коагулят БКЯ, был ста­тистически значимо выше по сравнению со значениями КЭБ как для животных контрольной группы, получавших казеин (р<0,01), так и для животных 2-й опытной группы, получавших БКЯ (р<0,05). В свою очередь КЭБ для животных, получавших БКЯ, был также достоверно, хотя и незначительно, выше по сравнению с его значением для животных контрольной группы, получавших казеин (Р<0,05) Результаты иммуноферментного тестирования со­хранности исходной антигенности овальбумина в нативном БКЯ свидетельствовали, что его содержание составило 33,0% относительно стандарта интактного овальбумина, антигенность которого принята за 100%. Разработанный процесс коагуляции способствовал сни­жению антигенности (также относительно антигенности стандарта интактного овальбумина) до 2,2%.

Заключение

Совокупность полученных данных свидетельствует о высокой биологической ценности коагулированного БКЯ, полученного с использованием кислотно-солевого гидролиза и теплового нагрева. Результаты иммуноферментного тестирования сохранности исходной антигенности овальбумина в коагулированном БКЯ (показателя потенциальной аллергенности) свидетельствуют о том, что тепловое воздействие в сочетании с подкислением раствора привело к снижению этого показателя в ко­агулированном белке по сравнению с нативным БКЯ более чем в 15 раз. Этот результат является важным дополнительным аргументом перспективности использования коагулята БКЯ в составе пищевых продук­тов массового спроса и специализированных пищевых продуктах.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04047).

Литература

1. Гущин В.В., Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Разработка новых видов продуктов из яичного белка // Птица и птицепродукты. 2015. № 2. С. 22-24.

2. Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Обоснование технологии производства коагулированного яичного белка и продуктов на его основе // Птица и птицепродукты. 2016. № 3. С. 37-40.

3. Высоцкий В.Г. Экспериментальное обоснование потребностей человека в белке : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1977.

4. Ногаллер А.М., Гущин И.С., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов. М. : Медици­на, 2008. 336 с.

5. Гущин В.В., Кулишев Б.В., Стефанова И.Л., Агафонычев В.П., Юхина И.А, Шахназарова Л.В. Способ получения яичного белко­вого продукта. Пат. РФ 2406371, 2008.

6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М. : Медицина, 1998. С. 37-42, 183-185.

7. Круглик В.И., Зорин С.Н., Гмошинский И.В. Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со сред­ней степенью гидролиза. Пат. РФ 2375910, 2009.

8. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Сар­кисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценкаобогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.

9. Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Рымаренко Т.В., Мамаева Е.М. О методах определения биологической ценности белков // Мед. реферат. журн. 1976. Разд. VII, № 6. С. 24-35.

10. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопр. питания. 1979. № 3. С. 48-53.