Комплексная оценка содержания полициклических ароматических углеводородов и особенности их накопления в мясной продукции

Резюме

Изучены зависимости содержания полициклических ароматических углево­дородов (ПАУ) от условий формирования компонентов дымных композиций, вида древесины, рецептуры, технологии производства и типа упаковочного материала. Увеличение температуры с 450 до 700 °С приводит к 2-3-кратному увеличению количества ПАУ в мясной продукции. Установлено, что исполь­зование полиамидной оболочки снижает суммарную канцерогенность колбас в 2,0-3,7 раза по сравнению с белковыми и натуральными оболочками, которые в плане накопления ПАУ являются наиболее опасными. Фиброузная оболоч­ка способна обеспечить снижение ПАУ в продукте до 40% по сравнению с натуральной. Проницаемость жировой фракции продукта для ПАУ до 10 раз выше по сравнению с белковой и углеводной. Полученные данные позволи­ли определить критерии безопасности копченых мясных продуктов с уче­том потенциальной канцерогенной опасности каждого ПАУ. Оптимальным индикатором присутствия ПАУ являются 8 ПАУ (бенз[а]пирен, хризен, бенз[а]антрацен, бензо[b]флуорантен, бензо[k]флуорантен, бензо[g,h,i]перилен, дибенз[а,h]антрацен, индено[1,2,3-с,d]пирен). Определена экспозиция воздейс­твия ПАУ на организм человека при постоянном употреблении в пищу мясной продукции. Доказана перспективность использования барьерных технологий защиты, веществ, обладающих антирадикальной активностью, и защитных пленок для снижения остаточного содержания ПАУ. Результаты исследований показывают снижение в 5 раз суммарного количества ПАУ при использовании пленок, пропитанных жиросодержащей микронаноэмульсией растительного или животного жира. Эффект увеличивается при выдерживании мясного сырья в 9% растворе уксусной кислоты или 3% растворе аскорбиновой кислоты.

Ключевые слова:полициклические ароматические углеводороды, копченые мясные продукты, высокоэффективная жидкостная хроматография, пищевые продукты

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 6. С. 125-133.

Коптильный дым возникает в процессе пиролиза дре­весины. В основе пиролиза лежат свободнорадикальные реакции термодеструкции гемицеллюлоз, цел­люлозы и лигнина, протекающие при температуре выше 200 °C. Составные части древесины - около 50% целлю­лозы, почти 25% лигнина и около 25% гемицеллюлозы (не считая воды) - превращаются при этом в фенолы, спирты, карбонильные соединения. Положительными эффектами попадания в продукт коптильных веществ и физико-химических превращений в нем являются образование вкуса и аромата копчености, консервиру­ющее действие (бактерицидный, антиокислительный и антипротеолитический эффекты). Однако копчение пищевых продуктов сопровождается образованием ток­сикологически вредных компонентов дыма, а имен­но полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) [1].

ПАУ оказывают ярко выраженные канцерогенные, мутагенные и тератогенные действия на организм че­ловека [2]. Проблема ПАУ особенно остра, поскольку они обладают свойством аккумуляции, и для них не­льзя установить предельные величины, ниже которых эти вещества не будут обладать канцерогенным потен­циалом [3].

В странах ЕС ужесточаются нормы содержания ПАУ, расширяется список контролируемых веществ. Так, с сентября 2012 г. в обязательном порядке наряду с уже установленным максимально допустимым со­держанием бенз[а]пирена (5 мкг/кг), контролируются 4 ПАУ: бенз[а]пирен, бенз[а]антрацен, бенз[b]флуорантен и хризен, суммарное содержание которых не должно превышать 30 мкг/кг. А с сентября 2014 г. предельно допустимая норма для бенз[а]пирена - не более 2 мкг/кг, для 4 ПАУ - не более 12 мкг/кг [4]. В Российской Федерации, согласно ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 034/2013, остаточное содержание бенз[а]пирена не должно превы­шать 1 мкг/кг, содержание других ПАУ при этом не нор­мируется. Высокая канцерогенная активность минорных ПАУ, их химическая устойчивость и синергетический эф­фект воздействия нескольких ПАУ подтверждают необхо­димость жесткого контроля их содержания в мясной про­дукции.

Цель работы - выявление зависимостей остаточ­ного содержания ПАУ в мясной продукции от условий формирования компонентов дымных композиций, вида древесины, рецептуры, технологии производства и типа упаковочного материала, а также поиск потенциальных путей снижения накопления ПАУ.

Материал и методы

Определение ПАУ проводили методом высокоэффек­тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использова­нием хроматографической системы Ultimate 3000 ("Dionex", США) с флуоресцентным детектором RF2000 ("Dionex", США) и колонкой Supelco LC-PAH, 150x4,6 мм, 5 мкм. Для разделения смеси ПАУ использовали градиентные условия элюирования: элюент А (дистиллированная вода) от 40 до 0% за 30 мин; элюент В (ацетонитрил) с 60 до 100% за 30 мин. Объем вводимой пробы 20 мкл, скорость потока 1,2 мл/мин. Используемая хроматографическая колонка способна разделить структурные изомеры ПАУ благодаря силикагельным частицам, хи­мически модифицированным фенильными группами. Высокая чувствительность флуоресцентного детектора по отношению к ПАУ позволяет обнаружить даже сле­довые количества на уровне 0,01 мкг/кг. В качестве аналитического стандарта использовали смесь 15 ПАУ PAH-Mix 170 (Dr. Ehrenstrofer DRE-LA20950170AL, Герма­ния). Параметры идентификации для флуоресцентного детектора представлены в табл. 1.

Выделение ПАУ из мясного продукта проводили путем щелочного гидролиза 5 г пробы в 50 см3 2М КОН в эта­ноле. Экстракцию ПАУ проводили 50 см3 циклогексана с переэкстракцией целевой фракции ПАУ 50 см3 раствора диметилформамида с дистиллированной водой (9:1). Для очистки от жировой фракции в экстракт добавляли 50 см3 1% раствора NaCl в дистиллированной воде. Затем про­водили повторную переэкстракцию, добавляя дважды по 30 см3 циклогексана. Экстракт упаривали на роторном испарителе, вакуумируя при 40°С. Для очистки пробы от посторонних органических примесей использовали твер­дофазную экстракцию на силикагеле (Silica - SPE, Bulk Sorbent, Agilent, США) [5]. На рис. 1 представлена хроматограмма разделения стандартной смеси 15 ПАУ.

Анализ спиртов, карбоновых кислот, эфиров и фено­лов в копченой мясной продукции проводили на газовом хроматографе 7890A ("Agilent Thechnologies", США) с масс-спектрометрическим детектором 5975C VL MSD ("Agilent Thechnologies", США).

Результаты и обсуждение

Проводившиеся ранее исследования показали, что основную роль в специфике аромата играют фенольные и карбонильные вещества, а также β-лактоны. Ключевыми в аромате коптильного дыма являются следующие вещества: циклотен, вератрол, р-этилфенол, гваякол, 4-метилгваякол, 4-пропилгваякол, ме-тилсирингол [6]. Проведенные исследования мето­дом газовой хромато-масс-спектрометрии, помимо вышеперечисленных веществ, позволили обнаружить в копченой мясной продукции в значительных количест­вах терпеновые спирты - 0,01-0,1% (фитол, изофитол и др.), карбоновые кислоты - 0,01-0,05% (фталевая кис­лота и др.), фенольные вещества - 0,05-0,2% (фенол, дифенилметан, 3,3'-диметилбифенил, 2,2',3,3'-тетраме-тилбифенил и др.) и эфиры - 0,1-0,3% (дибутилфталат), образующие вкусоароматические свойства продукта, а также токсичные вещества, такие как ароматические амины, в количестве 0,01-0,05% (анилин), ациклические углеводороды 0,02-0,1% (генэйкозан), ароматические углеводороды 0,02-0,05% (нафталин) и канцерогеные ПАУ 5-50 мкг/кг.

Доля фенолов в формировании типичного аромата копчения в среднем составляет 66%, карбонильных веществ на 14%, а остальных составляющих на 20%. Ис­следования по обработке фенолами, изолированными из жидких коптильных препаратов (так называемое бездымное копчение), образцов хребтового шпика пока­зали, что в среднем около 75% фенольных веществ пре­парата по мере диффузии в жировую фракцию шпика, состоящую в основном из насыщенных триглицеридов, в дальнейшем не идентифицируются. Гипотеза химической нейтральности жиров по отношению к коптильным компонентам на сегодня не опровергнута. Пока бес­спорно доказано лишь участие белковых и углеводных составляющих в реакциях химического взаимодействия с коптильными веществами [7, 8]. Однако по результатам исследований количественного содержания ПАУ было показано, что в сырокопченых колбасах, содержащих в рецептуре хребтовый шпик, остаточное количество ПАУ до 30% выше, чем в продуктах данного типа копчения, в рецептуру которых хребтовый шпик не вклю­чен. Тенденция накопления канцерогенных ПАУ именно в жировой фракции продукта очевидна.

Представляло интерес оценить влияние условий фор­мирования дымных компонентов распада древесины на содержание ПАУ в копченых мясных продуктах. По результатам исследования более высокая темпе­ратура образования дыма приводила к повышению концентрации ПАУ в пищевом продукте. Повышение температуры сопровождалось повышением содержания CO и CO2 и снижением концентрации кислорода. Со­держание ПАУ росло прямо пропорционально по мере увеличения температуры образования дыма и увеличе­ния концентрации CO и CO2 и обратно пропорционально концентрации кислорода.

На рис. 2 показан рост концентрации 15 ПАУ и отде­льно бензо]пирена в зависимости от увеличения тем­пературы образования дыма.

В табл. 2 приведено содержание индивидуальных ПАУ в зависимости от температуры пиролиза древесины. Как видно из представленных результатов, при увеличе­нии температуры происходит значительное накопление высокомолекулярных ПАУ, канцерогенность которых в разы выше, чем у бенз]пирена.

Анализ количественного содержания ПАУ в коп­ченой мясной продукции показал, что наиболее часто обнаруживаемыми были 8 ПАУ бенз[а]пирен, бенз[а]антрацен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуо-рантен, бенз[g,h,i]перилен, хризен, дибенз[а,h]антрацен и инден[1,2,3-сd]пирен. Суммарное содержа­ние вышеперечисленных 8 ПАУ в среднем превышало 75% от общего количества ПАУ. Еще одним фактором в пользу выбора вышеперечисленных 8 ПАУ в качестве индикатора присутствия ПАУ является высокая степень извлечения, которая варьирует в пределах от 79,2 до 91,4%. В то же время степень извлечения составила от 48,2 до 64,2% для дибензо[а,l]пирена, дибенз[а,е]пирена, дибенз[а,i]пирена, дибенз[а,h]пирена, которые по нор­мам ЕС (EU № 835/2011 от 19.08.2011) контролируются в копченых мясных продуктах. Суммарное содержание перечисленных 4 ПАУ находилось в пределах 60±5% от общего количества 15 ПАУ. Содержание бенза)пирена относительно определяемых 15 ПАУ составило 6±2%. Таким образом, бенз[а]пирен не является подходящим индикатором для контроля ПАУ в копченых мясных продуктах. Учитывая канцерогенный потенциал и воз­можные синергетические эффекты совместного при­сутствия ПАУ, лучшими индикаторами являются выше­перечисленные 8 ПАУ.

Вопрос определения суммарной канцерогенной опасности ПАУ является достаточно дискуссионным, и рядом исследователей были разработаны так называ­емые факторы токсичной эквивалентности (ФТЭ) ПАУ [9, 10]. Однако, несмотря на известную канцерогенную активность ПАУ, на сегодняшний день практически нет разработанных критериев для оценки индивидуального онкологического потенциала веществ данного класса. Анализируя данные ФТЭ, можно с обоснованной уве­ренностью предполагать, что минорные ПАУ играют не менее важную роль в риске возникновения опухолей, чем бенз]пирен, а с учетом их количественного содер­жания и синергетического эффекта смеси риски воз­растают. Проведенные исследования по определению профиля ПАУ позволяют рассчитать суммарную канцерогенную опасность пищевого продукта. В качестве факторов (коэффициентов) токсичной эквивалентности были использованы данные, полученные при исследова­нии ПАУ Калифорнийским управлением оценки эколо­гической опасности для здоровья (OEHHA). Для оценки общей канцерогенности (К, усл. ед.) копченого мясного продукта использовали формулу:

где ПАУi - среднее содержание индивидуального ПАУ, мкг/кг, Qi - фактор токсичной эквивалентности индиви­дуального ПАУ.

Полученные данные представлены в табл. 3.

Таким образом, общая канцерогенность (К, усл. ед.) копченого мясного продукта составляет в сред­нем 3,99±0,80 усл. ед., при этом канцерогенность бенз[а]пирена равна 0,60±0,12 усл. ед., т.е. канцероген­ная опасность копченого мясного продукта не может быть оценена по содержанию бенз]пирена, так как в значительной мере обусловлена присутствием других ПАУ. Следовательно, бенз]пирен не может рассмат­риваться как лимитирующий показатель загрязнения мясных продуктов ПАУ.

Следующим этапом исследований стал поиск воз­можных путей снижения канцерогенной нагрузки при потреблении мясных копченых продуктов.

Для этого были проанализированы данные по со­держанию ПАУ в продуктах, подвергшихся копчению в различных видах упаковочного материала (табл. 4, 5). В мясных изделиях дымного копчения без оболочки суммарное содержание 15 ПАУ в среднем на 25% выше, чем в продуктах, изготовленных в натуральной (черевы, синюги) и искусственных (белковая и фиброузная) обо­лочках, вне зависимости от типа копчения. Наименее проницаемой для канцерогенных веществ показала себя фиброузная оболочка. Длительность копчения также влияет на содержание ПАУ: так, в сырокопченых мясных продуктах в натуральной оболочке содержание ПАУ в среднем на 30% выше, чем в полукопченых, изго­товленных в натуральной оболочке.

Следует отметить, что в зависимости от оболочки меняется не только количественное содержание ПАУ, но и профиль ПАУ, т.е. содержание отдельных ПАУ относительно других ПАУ. При этом содержание бенз[а]пирена весьма стабильно и составляет 6,0±0,5%. Натуральные оболочки наиболее проницаемы для низкомолекулярных наименее канцерогенных ПАУ. Содер­жание высокомолекулярных наиболее канцерогенных дибенз[а]пиренов в продукции, выработанной в бел­ковой оболочке, сравнимо с остаточным количеством дибенз[а]пиренов в продукции в натуральной оболочке. Снижение дибенз[а]пиренов до 2 раз наблюдалось лишь в фиброузных оболочках. Поэтому, хотя остаточное количество ПАУ в продукции в белковой оболочке в среднем на 30% ниже, чем в натуральной, общая канцерогенность продукта в натуральной и белковой оболочках не столь различна. В продукте без оболочки содержание ПАУ в значительной степени зависит от толщины продукта, которая в свою очередь влияет на степень проникновения коптильных веществ. Наличие оболочки является серьезной преградой для проникно­вения ПАУ, особенно низкомолекулярных.

Развитие современных технологий очистки летучих выбросов и сточных вод позволили добиться многократ­ного снижения содержания ПАУ путем фотоокисления и микробной утилизации. Однако применить данные технологии для пищевых продуктов не представляется возможным. Одним из возможных путей снижения коли­чественного содержания ПАУ может быть использова­ние барьерных технологий. Под барьерной технологией понимается пленочная, мембранная защита или компо­зиционная оболочка, препятствующие или существенно снижающие диффузию ПАУ из газо-воздушной среды в продукт.

Термическое разложение древесины проводили, нагревая древесные опилки разных пород при 400­450 °С с последующей обработкой полученной дымной фракцией пищевого продукта в течение 6 ч с темпе­ратурой нагрева обрабатываемого продукта 30-35 °С. В качестве защитных пленок использовали натуральную оболочку по SN 32/34 ЕВР, белковую из коллагена спилка говяжьих шкур и фиброузную на бумажной ос­нове с натуральным целлюлозным покрытием оболочки по ГОСТ 16131-86, бумагу писчую плотностью 80 г/м2, на поверхность которой наносили 20% жиросодержащую микронаноэмульсию растительного или животного жира. Дополнительно для защиты обрабатываемого пищевого материала от дымных компонентов продукт предварительно выдерживали сутки при температуре 4±2 °С в 9% растворе уксусной кислоты или 3% растворе аскорбиновой кислоты. Данные результатов исследова­ний приведены в табл. 6.

Данные по количественному содержанию ПАУ были получены при анализе 486 проб готовой продукции в рамках добровольной сертификации с 2011 по 2017 г. в условиях повторяемости. Результатом проведенных исследований стала разработка проекта ГОСТа "Мясо и мясные продукты. Метод определения полициклических ароматических углеводородов". ФГУП "ВНИИМС" про­вел метрологическую экспертизу и оценку показателей точности методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725­2002. По результатам предоставленных данных были рассчитаны границы относительной погрешности, предел повторяемости и предел воспроизводимости. Методика позволяет достоверно определять ПАУ в присутствии пос­торонних примесей и системных пиков подвижной фазы.

По результатам работы можно сделать вывод, что снижения содержания ПАУ можно добиться несколькими путями. Одним из них является снижение со­держания жира в рецептуре копченых продуктов. При этом снижение содержания ПАУ не связано со сниже­нием фенольных веществ, отвечающих за вкус и аро­мат копчености. Основным параметром, влияющим на образование ПАУ, является температура образования дыма.

Из полученных данных очевидны преимущества использования белковых и, особенно, фиброузных оболочек по сравнению с натуральными. Белковая и фиброузная оболочки являются более плотными по структуре, их протеиноцеллюлозная основа не яв­ляется сильно жиронабухающей, но проницаемость ПАУ через такие барьеры во многом затруднена. Про­веденные предварительные исследования показали, что целый ряд ингредиентов способствует получению копченых мясных изделий с пониженным содержа­нием ПАУ. К таким ингредиентам относятся многие виды специй, аскорбиновая кислота и ряд природных стабилизаторов. Полученные данные относительно ко­личественного содержания 15 ПАУ позволили выявить индикаторы присутствия ПАУ, которыми являются 8 вышеперечисленных ПАУ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-16-10000).

Литература

1. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Some Non-heterocyclic Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Some Related Exposures, Lyon, 2010. Vol. 92.

2. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain (Question N° EFSA-Q-2007-136) // EFSA J. 2008. Vol. 724. P. 1-114.

3. Чернуха И.М., Федулова Л.В., Котенкова Е.А., Василевская Е.Р., Лисицын А.Б. Изучение влияния воды с модифицированным изотопным (D/H) составом на репродуктивную функцию, формирование и развитие потомства крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 5. С. 50-57.

4. Сommission Regulation (EU) N 835/2011 of 19 August 2011 amending regulation (EC) N 1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in foodstuffs // Official Journal of the European Union. 20.08.2011. Vol. L 215. P. 4-8.

5. Kulikovskii A.V., Vostrikova N.L., Chernukha I.M., Savtchuk S.A. Methodology of the determination of polycyclic aromatic hydrocar­bons in foods // J. Anal. Chem. 2014. Vol. 69, N 2. Р. 205-209.

6. Иванкин А.Н., Панферов В.И., Фахретдинов Х.А., Вострикова Н.Л., Куликовский А.В. Химические вещества запаха растительных материалов на основе сосны и березы // Лесной вестн. 2015. Т. 19, № 1. С. 46-53.

7. Wretling S., Eriksson A., Eskhult G.A., Larsson B. Polycyclic aro­matic hydrocarbons (PAHs) in Swedish smoked meat and fish // J. Food Compos. Anal. 2010. Vol. 23, N 3. P. 264-272.

8. Roseiro L.C., Gomes A., Patarata L., Santos C. Comparative sur­vey of PAHs incidence in Portuguese traditional meat and blood sausages // Food Chem. Toxicol. 2012. Vol. 50, N 6. P. 1891­1896.

9. Nisbet I.C., LaGoy P.K. Toxic equivalency factors (TEFs) for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) // Regul. Toxicol. Pharmacol. 1992. Vol. 16. P. 290-300.

10. Thorslund T.W., Farrar D. Development of relative potency estimates for PAH and hydrocarbon combustion product fractions compared to benzo[a]pyrene and their use in carcinogenic risk assessment. EPA/600/R-92/134, Dept. Commerce, NTIS, 1990.