Разработка технологии и исследование иммунобиологических свойств кисломолочного напитка на основе верблюжьего молока

Резюме

В статье представлены данные о технологии производства кисломолочного продукта на основе верблюжьего молока и оценки его иммунотропных свойств в эксперименте на 60 мышах-самцах гибридах F1 (CBAxC57Bl/6) с исходной массой тела 17,8±0,1 г. Для моделирования иммуносупрессии мышам однократ­но внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 125 мг на 1 кг массы тела. Животным основной группы (n=30) кисломолочный продукт вводили ежедневно перорально в объеме 0,5 см3/мышь в течение 30 дней. Животным контроль­ной группы (n=30) вводили аналогичное количество дистиллированной воды. Исследование иммунотропной активности кисломолочного напитка на модели иммунодефицитного состояния показало, что его введение в течение 30 дней в рацион мышей вызвало у последних увеличение числа IgM-антителообразующих клеток в селезенке в 1,3 раза (32,4х103 против 24,7х103 на орган в контрольной группе). 30-дневное введение кисломолочного напитка усиливало и эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана. Так, у мышей контрольной группы индекс реакции составил 7,80%, а у мышей основной группы увеличился на 70% и составил 13,26%. Использование ферментированно­го молочного продукта у иммунодефицитных мышей привело к значительному (на 63%) повышению антиоксидантной активности плазмы крови, при этом дисбаланс в функционировании антирадикальных ферментов (каталаза и супероксиддисмутаза) резко снизился, что указывает на повышение адапта­ционных возможностей организма, нарушенных введением иммуносупрессивного соединения. Полученные данные указывают на выраженное иммуномодулирующее и антиоксидантное действие ферментированного молочного продукта на основе верблюжьего молока, которое можно использовать для профилактики и в комплексной терапии вторичных иммунодефицитов и воспалительных заболеваний.

Ключевые слова:кисломолочный продукт, иммунотропная активность, антиоксидантная активность, верблюжье молоко

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 6. С. 67-73.

Результаты исследований верблюжьего молока пока­зали, что по качественным характеристикам оно выгодно отличается низким уровнем холестерина, высо­ким содержанием минеральных веществ (калий, железо, медь, цинк и магний), сбалансированным жирнокислотным составом [1]. Помимо этого показаны антигипертензивные, антидиабетические и противоопухолевые свойства верблюжьего молока [1, 2]. Имеются сведения о более легкой степени перевариваемости у лиц с лактазной недостаточностью [3].

Жирнокислотный состав верблюжьего молока пред­ставлен главным образом длинноцепочечными полине­насыщенными жирными кислотами и крайне низкими концентрациями короткоцепочечных жирных кислот [3]. Концентрация белка варьирует от 2,30 до 3,95%, при этом молоко содержит низкие концентрации лактоглобулина, обладающего выраженной аллергенностью [4]. Антиоксидантные свойства верблюжьего молока обус­ловлены высокой концентрацией витамина С, превы­шающей содержание витамина С в коровьем молоке в 2-3 раза [3]. Высокая концентрация витамина С в сочетании с низким рН молока способствует более длительной его сохранности по сравнению с коровьим молоком [5, 6].

Наличие в верблюжьем молоке высоких концентраций цинка (до 2 мг/100 мл) - один из важнейших факторов его потенциальной иммунопротективной активности [7]. Наряду с этим в молоке содержатся многие ферменты, обладающие антибактериальной и иммунотропной ак­тивностью. Так, концентрация лизоцима составляет 0,03­0,65 мг/100 мл, кроме того, в верблюжьем молоке содер­жатся иммуноглобулины, обеспечивающие противоинфекционную и противовирусную защиту [8], лактоферрин (95-250 мг/100 мл) [9], а также высокие концентрации пептидоглюкан-распознающего белка, что объясняет противоопухолевую активность данного вида молока [9].

Учитывая свойства верблюжьего молока, создание на его основе кисломолочных продуктов - приоритетная задача для производства лечебно-профилактических продуктов для различных возрастных групп населения, в первую очередь лиц с алиментарно-зависимыми иммунодефицитными патологиями.

В настоящее время известно несколько способов про­изводства кисломолочных напитков, представленных в патентах (RU № 2409963, KZ № 30167, KZ № 21385 и др.). Однако технология их производства длительна (в некоторых случаях достигает 24 ч), к тому же функци­ональные свойства входящих в состав кисломолочных напитков биологически активных компонентов и выбор заквасочных культур, к сожалению, недостаточно обос­нованы. В связи с этим создание современного эффек­тивного технологического производственного процесса с целью снижения временных параметров сквашива­ния/заквашивания, использование традиционной про­изводственной закваски и получение наиболее популяр­ного из кисломолочных продуктов - питьевого йогурта на основе верблюжьего молока - актуальная задача. Следует отметить, что не менее актуально создание линейки кисломолочных низколактозных продуктов на основе верблюжьего молока для лиц с низкой лактазной недостаточностью.

Материал и методы

Для приготовления кисломолочного напитка исполь­зовали цельное верблюжье молоко. Процесс произ­водства предполагает очистку молока от механических примесей, нормализацию по жиру, гомогенизацию при 12±2 МПа, пастеризацию при температуре 85±2 °С в течение 5-10 мин, охлаждение до 4±2 °С при условии дальнейшего резервирования, подогрев до темпера­туры заквашивания 40±2 °С и внесение производст­венной симбиотической закваски ФГБНУ "Всероссий­ский научно-исследовательский институт молочной промышленности" СТБп (Streptococcus salivarius subsp. termophilius и Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) в количестве 1, 3, 5 и 10% к массе молока. Рациональное количество закваски из исследуемого ряда определяли по такому критерию, как время сквашивания, которое не должно превышать 5-6 ч. Окончание процесса скваши­вания определяли по образованию сгустка свойствен­ной консистенции, а также по кислотности, значение которой должно составлять рН 4,7±0,05. Затем готовый продукт разливают и охлаждают в холодильной камере до 4±2 °С, где в течение 4-6 ч происходит его дальней­шее созревание.

Технология низколактозного продукта отличалась тем, что в пастеризованное и охлажденное молоко вносили 0,02-0,03% β-галактозидазы (активность 5200 ед/г) к его массе, после чего смесь выдерживали в течение 2-3 ч для инициации процесса гидролиза лактозы. Остальные процессы - по аналогии с базовой технологией.

Процесс сквашивания для обеих технологий осущест­вляли на компьютеризированном приборе параллель­ных биореакторов (DASGIP, Германия) на 400 cм3 с поча­совым замером динамики рН в течение суток.

С целью определения иммунотропных свойств кисло­молочного продукта были проведены эксперименталь­ные исследования на модели искусственно вызванной иммуносупрессии. Для моделирования иммуносупрессии мышам однократно внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 125 мг на 1 кг массы тела. Эксперименты про­ведены на 60 мышах-самцах гибридах F1 (CBAxC57Bl/6) со средней начальной массой тела 17,8±0,1 г (M±m), полученных из питомника лабораторных животных Фи­лиал "Столбовая" ФГБНУ "Научный центр биомедицин­ских технологий" ФМБА России. Животных содержали при 20-22 °С и режиме освещения 12/12 ч. Животные находились на общевиварном рационе. Животным ос­новной группы (n=30) кисломолочный продукт вводили ежедневно перорально в объеме 0,5 см3/мышь в течение 30 дней. Животным контрольной группы (n=30) вводили аналогичное количество дистиллированной воды.

Работу с животными выполняли в соответствии с руководством [10], правилами лабораторной практики (приказы Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708Н "Об утверждении правил лабораторной прак­тики" и от 23.01.1985 № 48 "О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных", этических норм, изложенных в Правилах лабораторной практики (GLP), Хельсинкской декларации и Директивах Европейского сообщества 86/609EEC (2000).

Влияние кисломолочного напитка на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа IgM-антителообразующих клеток (IgM-АОК) в селезенке иммунизированных эритроцитами барана мышей [11]. Клеточный иммунный ответ изучали в реакции гипер­чувствительности замедленного типа по ранее описан­ному методу [12]. После завершения курса введения напитка осуществляли сенсибилизацию мышей эритро­цитами барана (1х107/мышь, подкожно в объеме 0,1 см3). Разрешающую дозу эритроцитов барана (1х108 в объеме 20 мкл) вводили в подушечку задней лапы на 5-й день после сенсибилизации. Параллельно в противополож­ную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. Интенсивность реакции (ИР) оценивали через 24 ч по индексу реакции, который вычисляли индивиду­ально для каждого животного по формуле:

ИР (%) = (Ро - Рк)/Рк х 100,

где Ро - масса опытной лапы; Рк - масса контрольной лапы.

Оценку интенсивности свободнорадикального окис­ления осуществляли путем оценки люминол-зависимой Н2O2-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови [13, 14] с измерением максимальной ампли­туды вспышки хемилюминесценции и площади быстрой вспышки на хемилюминотестере ЛТ-01 (НПО "Люмин", Россия). Определение антиокислительной активности плазмы крови проводили амперометрическим спо­собом на анализаторе антиоксидантной активности "Яуза-01-ААА" (НПО "Химавтоматика", Россия) [15].

Определение активности каталазы проводили по ско­рости утилизации перекиси водорода в гемолизате эрит­роцитов колориметрическим методом [16] и выражали в условных единицах активности по отношению к контролю. Активность супероксиддисмутазы в сыворотке крови определяли по способности супероксиддисмутазы ингибировать реакцию аутоокисления кверцетина [17, 18] и выражали в условных единицах активности.

Статистическую обработку полученных данных осу­ществляли с использованием системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008) и f-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали разли­чия при р<0,05 [19].

Результаты и обсуждение

В ходе исследований подтвержден дозозависимый характер интенсивности процесса сквашивания. Ди­намика рН приготовленных кисломолочного напитка и низколактозного кисломолочного напитка для различ­ных концентраций заквасочного материала представ­лена соответственно на рис. 1 и 2.

Установлено, что для обеспечения технологически ра­циональной продолжительности сквашивания порядка 5-6 ч необходимо внести 10±0,5% закваски к массе молока. Это позволяет не только оптимизировать параметры производственного цикла, но и существенно повысить качество готового кисломолочного продукта. На основе проведенных исследований разработан рег­ламент приготовления производственной закваски.

Следует отметить, что консистенция полученных кисломолочных продуктов характеризовалась более низкой вязкостью. Более выражено это проявлялось в низколактозном продукте, что, вероятно, связано с образованием в системе моносахаридов в результате гидролиза лактозы.

На основании полученных экспериментальных дан­ных установлены закономерности процесса гидролиза лактозы при варьировании параметрами: продолжи­тельность и температура процесса, дозировка β-галак-тозидазы, массовая доля сухих обезжиренных веществ в молочной смеси.

По органолептическим показателям продукт характе­ризуется выраженным кисломолочным вкусом и запа­хом, однородной в меру текучей консистенцией.

При микроскопировании препаратов готового про­дукта (рис. 3) установлено, что микрофлора продукта выраженно представлена кокковыми и палочковидными микроорганизмами.

Исследование иммунотропной активности кисломо­лочного напитка показало, что 30-дневное введение мышам вызвало увеличение (р<0,05) числа IgM-АОК в селезенке в 1,3 раза по сравнению с животными, не получавшими исследуемый продукт (24,7х103 на селе­зенку) (рис. 4).

Последующие исследования показали, что введе­ние кисломолочного напитка усиливало и эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана. Так, у мышей, которым вводили дистилли­рованную воду (контрольная группа), индекс реакции составил 7,80%. У мышей основной группы после 30-дневного введения напитка индекс реакции увели­чился на 70%.

Применение кисломолочного продукта у иммунодефицитных мышей приводило к существенному (на 63%) увеличению антиоксидантного потенциала крови при восстановлении интенсивности свободнорадикального окисления (см. таблицу), что характеризовалось сниже­нием максимума вспышки и площади хемилюминесценции. При этом увеличивалась активность каталазы, что говорит о повышении в определенной мере адаптацион­ных возможностей организма, нарушенных введением иммуносупрессивного соединения.

Полученные результаты свидетельствуют о возмож­ности коррекции нарушений прооксидантно-антиоксидантной системы с помощью приема кисломолочного напитка на основе верблюжьего молока.

Таким образом, разработанная технология получе­ния кисломолочного напитка на основе верблюжьего молока (питьевой йогурт) позволяет получить пищевой продукт, обладающий выраженной иммуномодулирующей и антиоксидантной активностями. Установлено, что данный пищевой продукт в условиях эксперимен­тально вызванного иммунодефицита восстанавливает не только иммунный ответ, но и антиоксидантную ак­тивность организма. Полученные данные позволяют предположить, что указанные свойства кисломолочного продукта могут быть использованы в клинической прак­тике с целью профилактики и в комплексной терапии воспалительных заболеваний, при которых нарушена антиоксидантная защита организма, а также заболева­ний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитными состояниями.

Литература

1. Yadav A. K., Kumar R., Priyadarshini L., Singh J. Composition and medicinal properties of camel milk: a review // Asian J. Dairy Food Res. 2015. Vol. 34, N 2. P. 83-91.

2. Guakhar K., Bernard F. A better knowledge of milk quality parameters: a preliminary step for improving the camel milk market opportunity in a transition economy - the case of Kazakhstan. Saving the Camel and Peoples' Livelihoods Building a Multi stockholder Platform for the Conservation of the Camelin Rajasthan, International conference. 23-25, Sadri, Rajasthan, India, 2004. P. 28-36.

3. Singh R., Ghorui S.K., Sahani M.S. Camel milk: properties and processing potential. The Indian camel. Bikaner : NRCC, 2006. P. 59-73.

4. Abu-Lehiya I.H. Composition of camel milk // Milchwissenschaf. 1987. Vol. 42. P. 368-371.

5. Farah Z. Camel Milk. Properties and Products. St Gallen, Switzerland : SKAT, 1996.

6. Yagil R. The camel: self-sufficiency in animal protein in drought- stricken areas // World Anim. Rev. (FAO). 1986. Vol. 57. P. 2-10.

7. Hansen M.A., Fernandes G., Good R.A. Nutrition and immunity: the influence of diet on autoimmunity and the role of zinc in the immune response // Ann. Rev. Nutr. 1982. Vol. 2. P. 151-157.

8. Mal G., Sena D.S., Jain V.K., Sahani M.S. Therapeutic value of camel milk as a nutritional supplement for multiple drug resistant (MDR) tuberculosis patients // Israel J. Vet. Med. 2006. Vol. 61, N 3-4. P. 88-94.

9. Morin D.E., Rowan L.L., Hurley W.L. Comparative study of proteins, peroxidase activity and N-acetyl-glucosaminidase activity in llama milk // Small Rumi. Res. 1995. Vol. 17. P. 255-261.

10. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.

11. Kiselev S.L. Molecular cloning and characterization of the mouse tag-7 gene encoding a novel cytokine // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 18 633-18 639.

12. Иммунологические методы исследований : пер. с англ. / под ред. И. Лефковитса, Б. Парнаса. М. : Мир, 1988. 530 с.

13. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И. и др. Изменение антиоксидантного статуса миокарда под влиянием коэнзима Q10 при окислительном стрессе // Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 1. С. 97-104.

14. Макеева А.В., Попова Т.Н., Матасова Л.В. Действие тиоктовой кислоты на функционирование антиоксидантной глутатионзависимой системы при токсическом гепатите крыс // Биомеди­цинская химия. 2007. Т. 53, вып. 2. С. 181-189.

15. Павлюченко И. И., Басов А. А., Федосов С. Р. Пат. на изобретение № 2236008, Российская Федерация, МПК G01N33/48. 10.09.2004. Бюл. № 25. 10 с.

16. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Пат. на полезную модель № 54787 Российская Федерация, A61K 33/00. 27.07.2006 Бюл. № 21. 2 с.

17. Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006611562. 16.03.2006. 1 с.

18. Быков И.М., Басов А.А., Быков М.И., Ханферьян Р.А. Сравни­тельная характеристика антиоксидантного потенциала и энер­гетической ценности некоторых пищевых продуктов // Вопр. питания. 2013. № 3. С. 77-80.

19. Фетисов Е.А., Семипятный В.К., Петров А.Н., Галстян А.Г. Плани­рование и анализ результатов технологических экспериментов. М. : Сталинград, 2015. 98с.