Характеристика иммунного статуса крыс при витаминно-минеральной недостаточности

Резюме

В статье представлены результаты исследования иммунного статуса крыс в условиях различных уровней обеспеченности витаминами группы В (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (Fe3+ и Mg2+). Самцы крыс линии Вистар (с исходной массой тела 90-110 г) в течение 65 дней получали модельные рацио­ны с 75, 30 и 19% содержанием этих эссенциальных веществ, самки (с исходной массой тела 56 -76 г) - рационы с 75, 28 и 18% содержанием. Были изучены некоторые показатели гуморального и клеточного звеньев иммунитета, вклю­чавшие подсчет лейкоцитарной формулы, измерение лизоцимной активности сыворотки крови, определение содержания иммуноглобулинов IgG, IgE, анализ цитокинового профиля сыворотки крови, а также определение массы органов иммунной системы. Показано, что снижение содержания витаминов группы В, железа и магния в рационе не вызывает комплексных изменений иммунного ста­туса крыс, поэтому предложенная модель изменения адаптационного потенци­ала не является оптимальной для изучения состояния системы иммунитета. Проведенные масштабные исследования иммунного статуса крыс (изучено 18 показателей, выборка из 90 самцов и 90 самок) позволяют установить диа­пазон физиологических колебаний этих показателей у крыс линии Вистар соот­ветствующего пола и возраста.

Ключевые слова:крысы, иммунный статус, адаптационный потенциал, витаминно-минеральный состав рационов, гуморальный и клеточный иммунитет

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 6. С. 36-41.

Авторы статьи разработали модификацию витаминно-минерального состава рациона крыс, которая может быть использована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой про­дукции [1]. Принимая во внимание, что иммунный ста­тус является одной из составляющих адаптационного потенциала организма, были проведены исследования некоторых показателей гуморального и клеточного иммунитета у крыс линии Вистар, получавших модель­ные рационы с разными уровнями обеспеченности витаминами группы В (тиамином, рибофлавином, ниацином и пиридоксином), солями железа и магния. Следует отметить, что различные модификации моде­лей витаминной недостаточности были использованы в экспериментах по оценке безопасности наноматериалов [2], по выявлению наиболее чувствительных пока­зателей репродуктивной функции крыс [3] и др. [4-6]. Однако разработанная нами модель в значительной степени отличалась от ранее использованных, поэтому потребовалось проведение дополнительных исследо­ваний, направленных на изучение возможности данной модели при исследовании иммунного статуса крыс.

Цель настоящей работы - оценка иммунного ста­туса самцов и самок крыс в условиях оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности ви­таминами (В1, В2, В3, В6) и минеральными веществами (Fe3+ и Mg2+).

Материал и методы

Эксперимент длительностью 65 дней проводили на крысах линии Вистар с исходной массой тела самцов 90-110 г и самок - 56-76 г возраст крыс в начале эк­сперимента составлял 30 дней. Самцы и самки были разделены на 3 группы (по 30 самцов и 30 самок в каж­дой группе). Всего в эксперименте было использовано 180 животных. Крысы получали полусинтетический ка­зеиновый рацион с оптимальной (75%) дозировкой эссенциальных веществ (витаминов В1, В2, В3, В6 и мине­ральных веществ - Fe3+ и Mg2+), с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциальных веществ (табл. 1). Экспериментальные рационы животные получали на протяжении всего срока иссле­дований.

Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой, в отапливаемом (тем­пературный режим 21-23°С) и вентилируемом помеще­нии с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение экспериментов вели наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмортальную некропсию, взвешивание внутренних органов и отбор материала для гематологических и иммунологических исследований проводили на 65-й день эксперимента. Эвтаназию проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Мин­здрава России от 01.04.2016 № 193н. За 12 ч до эвтана­зии животных лишали пищи.

Оценка иммунного статуса включала подсчет лейко­цитарной формулы, измерение лизоцимной активности сыворотки крови, определение содержания иммуно­глобулинов IgG, IgE, анализ цитокинового профиля сыворотки крови, а также определение массы органов иммунной системы (селезенки и тимуса).

Подсчет лейкоцитарной формулы выполнен с ис­пользованием гематологического анализатора "Coulter Aс-Tτм 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США). Содержание иммуноглобулинов IgG, IgE определяли методом иммуноферментного анализа с использова­нием микропланшетного ридера "Anthos 2020" и стан­дартных иммуноферментных наборов (Rat IgG, кат. № E-EL-RO518; Rat IgE, кат. № E-EL-RO517, "Elabscience Biotechnology Co.Ltd", Китай). Лизоцимную активность сы­воротки крови определяли нефелометрическим методом по О.В. Бухарину, 1971 [7], основанным на изменении оптической плотности среды в результате способности лизоцима сыворотки крови лизировать тест-культуру Micrococcus lysodeikticus. Цитокиновый профиль крыс оп­ределяли с помощью наборов (Bio-Plex ProTM Rat Cytokine Th1/Th2 Assay, кат. 171-K1002M, "Bio-Rad", США). Иссле­дования проведены на мультиплексном проточном ана­лизаторе Luminex 200 ("Luminex Corporation", США).

Статистическую обработку проводили с использо­ванием пакета прикладных программ MS Excel 2007. Характер распределения количественных признаков оп­ределяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помощью F-критерия. Оценку статистической значи­мости различий средних величин проводили методом однофакторного дисперсионного анализа. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [8].

Результаты и обсуждение

На протяжении эксперимента не отмечено гибели крыс, общее состояние животных было удовлетворительным. По внешнему виду, качеству шерстного покрова и по­ведению крысы 3 групп не различались между собой. Еженедельный прирост массы тела самцов и самок, получавших рационы с оптимальным содержанием эссенциальных веществ (группа "75"), был несколько выше, чем у крыс маргинальной группы (группа "30" для самцов и "28" для самок), в конце эксперимента на 4% у самцов и на 1% у самок (p>0,05), у субмаргиналь­ной группы (группа "19" для самцов и "18" для самок) -на 18% у самцов и 10% у самок (p<0,05) (см. рисунок).

На этапе постмортальной некропсии были выделены и взвешены внутренние органы, в данной статье при­ведены массы органов иммунной системы - тимуса и селезенки (табл. 2). Относительная масса тимуса у крыс субмаргинальной и маргинальной групп была несколько ниже, чем у крыс оптимальной группы: на 14 (p<0,05) и 8% (p>0,05) у самцов; на 8 и 2% (p>0,05) у самок соответственно. Относительная масса се­лезенки у самцов субмаргинальной и маргинальной групп была на 11 (p>0,05) и 15% (p<0,05) ниже, чем у самцов оптимальной группы, тогда как у самок ко­лебания массы селезенки не превышали 2% (p>0,05) между группами, и самая высокая масса была отмечена у животных маргинальной группы. Анализ полученных данных позволил выявить определенную тенденцию к снижению относительной массы тимуса в зависи­мости от снижения обеспеченности эссенциальными веществами, в большей степени это проявлялось на примере массы тимуса у самцов, в меньшей - у самок. Масса селезенки самцов в группах, получавших марги­нальные и субмаргинальные дозы витаминов и минеральных веществ, также демонстрировала снижение, однако взаимосвязи с дозами не прослеживалось и значение этого показателя в группе с субмаргиналь­ной обеспеченностью было выше, чем в группе с мар­гинальной обеспеченностью.

Лейкоцитарный профиль самцов и самок всех групп не демонстрировал значимых различий, которые можно было бы связать с составом рационов (табл. 3). Тем не менее отмечено снижение содержания моноцитов: у самок субмаргинальной и маргинальной групп -на 23 и 22% (р<0,05) по сравнению с уровнем у крыс оп­тимальной группы; у самцов соответственно на 13 и 6% (р>0,05). Вместе с тем все показатели лейкоцитарной формулы не выходили за пределы физиологических колебаний, характерных для крыс [9-12].

Лизоцимная активность сыворотки крови (табл. 4) у самцов 3 групп не имела существенных различий, значения колебались в сравнительно узком диапазоне от 32 до 50%. У самок аналогичный показатель характеризо­вался более высокой вариабельностью значений в диа­пазоне от 1 до 60%, отмечено повышение показателя у самок субмаргинальной и маргинальной групп по сравнению с оптимальной группой на 75 (p<0,05) и 7% (p>0,05) соответственно.

Концентрация иммуноглобулинов у крыс всех групп не имела статистически значимых различий и не де­монстрировала очевидной зависимости от состава ра­ционов (табл. 5). Содержание IgG у самцов варьировало в диапазоне 0,661-5,763 нг/мл, у самок - в диапазоне 0,489-8,688 нг/мл; содержание IgE у самцов - в диапа­зоне 35,3-296,6 нг/мл, у самок 106,8-293,8 нг/мл. Сле­дует отметить, что у самцов диапазон колебаний уровня IgE был несколько выше, чем у самок, а диапазон ко­лебаний IgG, напротив, ниже чем у самок. Сравнительная оценка содержания иммуноглобулинов у самцов и самок выявила половые различия, что подтверждается результатами исследований [13], на основании которых были сделаны выводы о том, что половые различия им­мунной системы определяются кариотипом и влиянием стероидных половых гормонов: эстрогенов, прогестинов и андрогенов.

Определение уровня интерлейкинов (ИЛ) не выявило статистически достоверных различий между группами, получавшими рационы с разными уровнями обеспе­ченности эссенциальными микронутриентами (табл. 6). Вместе с тем выявлены определенные половые раз­личия, более выраженные у самок и самцов, полу­чавших оптимальные рационы (в среднем у самцов в 10 раз выше содержание ИЛ-1а, ИЛ-2 и ИЛ-4), тогда как у крыс с маргинальными и субмаргинальными уров­нями обеспеченности половые различия были менее значительными (в 2-2,5 раза выше у самцов, чем у самок).

Таким образом, не выявлено комплексных изменений иммунного статуса крыс в зависимости от уровня обеспеченности эссенциальными веществами, все отмечен­ные различия не являлись бесспорным свидетельством взаимосвязи содержания витаминов группы В - тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пиридоксина (В6) и дефицита минеральных веществ - железа (Fe3+) и магния (Mg2+) в рационе. Предложенная модель из­менения адаптационного потенциала не является оп­тимальной для изучения иммунного статуса. Вместе с тем проведенные масштабные исследования иммун­ного статуса крыс (изучено 18 показателей, выборка из 90 самцов и 90 самок) позволяют с определенной долей условности установить диапазон физиологичес­ких колебаний этих показателей у крыс линии Вистар соответствующего пола и возраста. Поскольку уро­вень ИЛ у крыс на таком объеме выборки был изучен впервые, полученные данные, вне всяких сомнений, уникальныи будут в дальнейшем использованы в экспе­риментальных исследованиях.

Исследование проведено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).

Литература

1. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Требух М.Д., Пашорина В.А. Модификация витаминно-минераль-ного состава рационов как модель снижения адаптационного потенциала крыс для токсикологических исследований // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. C. 64-71.

2. Гмошинский И.В., Вржесинская О.А., Шумакова А.А., Шипелин В.А., Коденцова В.М., Хотимченко С.А. Воздействие наноразмер-ного диоксида кремния аморфного на усвояемость витаминов В1, В2 и В6 у крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 72-79.

3. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А., Жминченко В.М. Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1. С. 33-43.

4. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

5. Коденцова В.М. Витамины. М. : МИА, 2015. 408 с.

6. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Вли­яние поливитаминной недостаточности на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 2. С. 28-33.

7. Бухарин О. В. Применение таблицы для определения количества лизоцима в сыворотке крови // Материалы межкафедр. совещ. "Вопросы неспецифического иммунитета". Оренбург, 1971. С. 162-163.

8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. М. : Медиа Сфера, 2006. 312 с.

9. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. № 2. С. 10-16.

10. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam : Elsevier, North-Holland Biochemical, 1981. 358 p.

11. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington : Elsevier Academic Press, 2006. 912 p.

12. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. London : Taylor and Francis, 1997. 272 p.

13. Klein S. L., Roberts C. W. Sex Hormones and Immunity to Infection. Berlin, Heidelberg : Springer, 2010. 329 p.