Определение N-нитрозодифениламина в детских мясных консервах методом хромато-масс-спектрометрии

Резюме

В статье приведены результаты экспериментальных исследований определе­ния низких концентраций N-нитрозодифениламина в мясных консервах для детского питания в диапазоне концентраций 0,027-3,89 мг/кг на основе газо­вой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Оптимально отработанные условия подготовки проб (экстракция органическим раство­рителем и твердофазная экстракция) и применение хромато-масс-спектрометрии позволили выполнять определение N-нитрозодифениламина в образ­цах мясных консервов c высокой селективностью в диапазоне концентраций от 0,016 до 5 мг/кг при погрешности не более 23%. Использование реакции переэтерификации жирных кислот метилатом калия, удаление образовав­шихся эфиров из образцов мясных консервов органическим растворителем (гексан), концентрирование N-нитрозодифениламина в водном слое на карт­риджах автоматической системы твердофазной экстракции обеспечивает извлечение N-нитрозодифениламина из исследуемых образцов мясных кон­сервов на 99,94%. В процессе исследований доказано присутствие N-нитрозо­дифениламина в образцах мясных консервов "говядина + цыпленок" методом масс-спектральной идентификации в режиме полного сканирования ионов с использованием автоматической системы масс-спектральной идентифи­кации AMDIS.

Ключевые слова:детское питание, мясные консервы, N-нитрозодифениламин, хромато-масс-спектрометрия, твердофазная экстракция

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 5. С. 56-62. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00077.

Продовольственная безопасность страны - неотъ­емлемая часть ее национальной безопасности. Улучшение обеспечения населения, особенно детского, пищевыми продуктами надлежащего качества пред­ставляет собой важную социально-экономическую задачу, решение которой имеет огромное значение для России [1].

Обеспечение безопасности пищевых продуктов, в том числе детского питания, по содержанию химических соединений и других загрязнителей регламентируется СанПиН 2.3.2.1078-01, Техническими регламентами Та­моженного союза (ТР ТС 021/2011, ТР ТС 034/2013, ТР ТС 033/2013) [2-4]. Вместе с тем далеко не все потен­циально опасные и токсичные соединения регламентиру­ются в этих документах. Особую опасность представляет группа высокотоксичных, канцерогенных N-нитрозоа-минов (NAS) (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозометил-этиламин, N-нитрозодиэтиламин, N-нитрозопирролидин, N-нитрозоди-н-пропиламин, N-нитрозопиперидин, N-нит-розоди-н-бутиламин, N-нитрозодифениламин), которые определяются практически во всех мясных и рыбных продуктах и контролируются в странах ЕС. По результа­там зарубежных исследований (Италия, Дания, Китай) в мясных продуктах были обнаружены N-нитрозоамины, в том числе N-нитрозодифениламин в диапазоне концен­траций 0,051-9,4 мг/кг продукта [5-7].

В Техническом регламенте Таможенного союза (ТР ТС 034/2013 Приложение 3) [4] не допускается в консервах из мяса для питания детей раннего возраста содержа­ние суммы N-нитрозоаминов (N-диметилнитрозоамина и N-диэтилнитрозоамина).

Поступление N-нитрозоаминов в пищевую продукцию возможно в результате добавления нитритов и нитра­тов в качестве пищевых добавок в мясные продукты с целью совершенствования технологии, сохранения или улучшения качества продукта и пищевых свойств [8, 9]. Нитраты в организме человека восстанавлива­ются до нитритов, которые способствуют образованию канцерогенных N-нитрозоаминов [10].

Среди группы N-нитрозоаминов по физико-хими­ческим характеристикам особое место занимает N-нитрозодифениламин. Это твердое вещество с вы­сокой температурой кипения - 346,5 °С, не расщеп­ляется растворами щелочей и разбавленных кислот, не подвергается разрушающему действию рассеян­ного света, обладает слабыми основными свойствами, окисляется до N-нитроаминов, восстанавливается до диалкилгидразинов, в кислой среде отщепляет азо­тистую кислоту [11]. Эти свойства N-нитрозодифени-ламина предопределяют его длительное присутствие в пищевых продуктах.

Цель данного исследования - определение содер­жания N-нитрозодифениламина в детских мясных кон­сервах с использованием хромато-масс-спектрометрической системы (ГХ/МС) и твердофазной экстракции на этапе подготовки пробы.

Материал и методы

Анализ образцов мясных консервов на содержание N-нитрозодифениламина выполняли с использованием газовой хроматографической системы Agilent 7890А ("Agilent Technologies", США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (MCD) 5975С. Для раз­деления использовали кварцевую капиллярную колонку HP-FFAP длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования колонки: начальная температура 50 °С, повышение температуры до 120 °С со скоро­стью 8 °С/мин; от 120 до 185 °С со скоростью 12 °С/мин и от 185 до 240 °С со скоростью 25 °С/мин, с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-но­сителя использовали гелий; скорость газа-носителя -1,0 см3/мин в режиме постоянного потока. Температура аналитического интерфейса 220 °С, время удержива­ния N-нитрозодифениламина - 21,7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера Agilent ALS ("Agilent Technologies", США) в режиме pulsed/splitless; объем пробы 2 мкл.

Режим работы масс-спектрометрического детектора (для качественного и количественного анализа в диапа­зоне низких концентраций 0,016-5,0 мг/кг): селективный ионный мониторинг (SIM,) по 3 характеристическим ионам анализируемого соединения 167, 168, 169 m/z, образующимся при отщеплении от молекулы N-нитро-зодифениламина группы NO.

Режим сканирования (SCAN) в диапазоне 50-250 m/z использовали для подтверждения структуры изучаемого соединения в более высоком диапазоне концентраций N-нитрозодифениламина (от 0,05 до 1,0 мг/кг) путем сравнения масс-спектров обнаруженного химического соединения в пробе мясных консервов с масс-спектром масс-спектральных данных NIST 08.L для ручной иден­тификации. Для автоматической идентификации приме­няли AMDIS библиотеки.

Использовали стандартный раствор (2 мг/дм3) смеси N-нитрозоаминов EPA 521 Nitrosamine Mix (Supelco Analytical, USA), состоящий из N-диметилнитрозоамина, N-мети-лэтилнитрозоамина, N-диэтилнитрозоамина, N-пир-ролидиннитрозоамина, N-морфолиннитрозоамина, N-ди-бутилнитрозоамина, N-дипропилнитрозоамина, N-пипери-диннитрозоамина и N-дифенилнитрозоамина.

Ввиду сложного состава матрицы пищевых продуктов и низкого содержания в них определяемого соединения на этапе подготовки пробы требуется концентрирова­ние, очистка экстракта и селективное выделение анали­зируемого вещества [12].

Известно, что мясные консервы для детского питания представляют собой измельченное в различной степени мясо (говядину, свинину, баранину, телятину, мясо яг­ненка, кур, индеек, и др.), к которому может быть добав­лен соответствующий мясной бульон, смесь сливочного и растительного масла, обеспечивающие обогащение консервов незаменимыми полиненасыщенными жир­ными кислотами (линолевой и линоленовой). Вместе с тем жировой компонент биологического происхожде­ния мешает селективному извлечению N-нитрозодифе-ниламина из пищевого продукта.

Для удаления из исследуемых образцов мясных кон­сервов (навеска 5 г) жиров биогенного происхождения и эффективного извлечения N-нитрозодифениламина выполняли реакцию переэтерификации жиров метилатом калия путем добавления к пробе 10 см3 раствора метилата калия в метаноле концентрацией 162 г/дм3. Затем смесь нагревали при температуре 60-70 °С и данную температуру поддерживали в течение 120 мин для образования метилового эфира жирных кислот. По­лученную смесь помещали в центрифужную пробирку объемом 50 см3, добавляли 10 см3 гексана, перемеши­вали и центрифугировали при 4500 об/мин (центрифуга Eppendorf 5804, "Eppendorf", Германия) в течение 20 мин. Верхний гексановый слой, содержащий эфиры жирных кислот, удаляли дозатором. В оставшийся нижний слой, содержащий N-нитрозодифениламин, глицерин, мета­нол, добавляли 45 см3 воды, интенсивно встряхивали в течение 10 мин и смесь оставляли на 12 ч при темпе­ратуре +5 °С для удаления остатков жирных кислот. По истечении 12 ч пробирку со смесью центрифугировали при 4500 об/мин в течение 20 мин с целью отделения остатков мясных консервов от водного слоя и водный слой, содержащий N-нитрозодифениламин, пропускали через угольный картридж "Supelco Superclean Coconut" объемом 6 см3, массой сорбента 2 г, с использова­нием системы твердофазной экстракции ("Separths", Италия).

На основании экспериментальных исследований ус­тановлено, что добавление к анализируемой пробе метилата калия объемом 10 см3 для удаления жи­рового компонента, экстракции метиловых эфиров жирных кислот гексаном, использование картриджей "Supelco Superclean Coconut" твердофазной экстра­кции на этапе подготовки пробы позволило достичь полноты извлечения N-нитрозодифениламина 99,94% (n=8).

Для количественного определения содержания N-дифенилнитрозамина выполняли хромато-масс-спектрометрический анализ стандартных растворов и на основе результатов измерений строили градуировочную зависимость в режиме селективного ионного детекти­рования (SIM) по характеристическим ионам соедине­ния 167, 168, 169 m/z (ион 168 m/z использовался для количественного определения, два другие в качестве подтверждающих) в диапазоне концентраций 0,0002­0,0016 мг/кг. Правильность методики оценена методом добавок аналита на трех уровнях концентраций 0,0002, 0,0008 и 0,0016 мг/кг. Погрешность методики составила 23% (табл. 1).

Результаты и обсуждение

На отечественном рынке продуктов детского питания представлен широкий ассортимент мясных консервовдетского питания. Были выполнены скрининговые ис­следования образцов мясных консервов для детского питания. Для того чтобы проба была представительной, а полученные результаты достоверными, из разных партий отбирали 5 раз навеску образца мясных кон­сервов и проводили подготовку пробы для каждого об­разца с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Пример хроматографического определения извле­ченного N-нитрозодифениламина из образца детских мясных консервов "говядина + цыпленок", в котором обнаружена наибольшая концентрация N-нитрозоди-фениламина в режиме сканирования по селективно избранным ионам m/z 167, 168, 169, представлен на рис. 1.

Дополнительным идентификационным признаком, определяющим, что в образце мясных консервов "го­вядина + цыпленок" был обнаружен N-нитрозодифе-ниламин, является поиск целевых ионов, реализуемый системой ChemStation. Для этого приводятся результаты хроматографического разделения извлеченных инте­ресующих ионов (целевой m/z 167 и подтверждающие ионы m/z 168, m/z 169, характеризующиеся наибольшей интенсивностью) и показываются в совмещенном виде (рис. 2).

На рис. 2 показано, что профили характерис­тических ионов N-нитрозодифениламина m/z 168, m/z 169 и m/z 167 по наиболее интенсивным массам совмещаются при совпадении времени удерживания 21,7 мин со стандартным раствором концентрацией С=2,0 мг/кг, что служит весомым доказательством присутствия данного соединения в образце про­дукта для детского питания.

Для оценки возможности идентификации N-нитрозоди-фениламина, обнаруженного в образцах мясных консер­вов для детского питания, при работе масс-спектрометра в режиме полного сканирования ионов использовали автоматическую систему масс-спектральной идентифи­кации AMDIS. Масс-спектр N-нитрозодифениламина, по­лученный автоматической системой масс-спектральной идентификации (AMDIS), представлен на рис. 3.

Анализ рис. 3 показал, что масс-спектр N-нитрозоди-фениламина образца детских мясных консервов совпал с масс-спектром из библиотеки. Программное обеспе­чение AMDIS позволило не только провести идентифи­кацию соединений на хроматограмме, но и выделить из перекрывающихся пиков "чистый" спектр N-нитрозоди-фениламина.

Масс-спектр N-нитрозодифениламина с характерис­тическими ионами и структурная формула из библио­теки масс-спектров представлены на рис. 4.

Полное совпадение профилей характеристических ионов N-нитрозодифениламина по наиболее интен­сивным массам m/z 168, m/z 169 и m/z 167 (рис. 4), с учетом совпадения времени удерживания 21,7 мин по стандартному раствору концентрацией С=0,16 мкг/см3 позволяет говорить о том, что определяемое соеди­нение идентифицировано и его наличие в образцах пищевых продуктов для питания детей доказано с помо­щью точного метода проверки автоматической системы масс-спектральной идентификации AMDIS.

Таким образом, анализ различных образцов мясных консервов детского питания методом газовой хромато­графии с масс-селективным детектированием позволил определить N-нитрозодифениламин в диапазоне кон­центраций 0,027-3,89 мг/кг.

Для подтверждения присутствия N-нитрозодифенила-мина в образцах мясных консервов выполнена иден­тификация при работе масс-спектрометра в режиме полного сканирования ионов автоматической системой масс-спектральной идентификации AMDIS. Масс-спектр N-нитрозодифениламина по характеристическим ионам в исследованных образцах мясных консервов совпадает с масс-спектром библиотеки масс-спектральных данных.

Литература

1. Указ Президента РФ от 30.01.2010 № 120 "Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Феде­рации".

2. Гигиенические требования к качеству и безопасности продо­вольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные прави­ла и нормы 2.3.2.1078-01. М., 2002.

3. ТР ТС 021/2011 Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции".

4. ТР ТС 034/2013 "Гигиенические требования безопасности про­дуктов убоя, предназначенных для производства мясной про­дукции для детского питания".

5. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691515000873.

6. Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Simultaneous deter­mination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionization // J. Chromatogr. A. 2014. Vol. 1330. P. 20-29.

7. Al-Kaseem M., Al-Assaf Z., Karabeet F. Determination of seven vola­tile N-nitrosamines in fast food // Pharmacol. Pharm. 2014. Vol. 5. P. 195-203.

8. Шаулина Л.П., Корсун Л.Н. Контроль качества и безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья : учеб. посо­бие. Иркутск : Изд-во ИГУ, 2011. 111 с.

9. Жукова Г.Ф., Торская М.С., Родин В.И. N-нитрозамины и нитриты в мясе и мясопродуктах // Вопр. питания. 1999. № 4. С. 32-34.

10. Комарова В.И. Метаболизм нитратов в ротовой жидкости человека : автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 2001. 20 с.

11. Зульфигаров О.С., Юрченко В.В., Каширина Н.В., Стадничук Н.А. К вопросу об определении N-нитрозоаминов в пищевых продук­тах. Киев : Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Мед­ведя, 2004.

12. Ярошенко Д.В., Карцова Л.А. Матричный эффект и способы его устранения в биоаналитических методиках, использующих хромато-масс-спектрометрию // Журн. аналит. химии. 2014. Т. 69, № 4. С. 1-8.