Разработка методики определения инулина в цикории растворимом натуральном после ферментативного гидролиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Резюме

Разработана высокоспецифичная методика оценки содержания инулина в растворимом натуральном цикории, которая базируется на определении фруктозы после ферментативного гидролиза амилоглюкозидазой и инулиназой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефракто­метрическим детектированием. Определение содержания инулина проводили с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматогра­фии Agilent 1260 Series с рефрактометрическим детектором на колонке Waters Sugar-Pak 10 мкм х 6,5 мм х 300 мм: элюирование в изократическом режиме (подвижная фаза - вода) со скоростью 0,5 см3/мин, температура колонки -80 °С, объем вводимой пробы - 10 мкл. Содержание инулина в образцах раство­римого натурального цикория колеблется в пределах от 4 до 25%. Показано, что разработанная методика может использоваться для контроля качества продуктов, используемых для приготовления напитков из растворимого нату­рального цикория.

Ключевые слова:инулин, фруктоза, инулиназа, высокоэффективная жидкостная хроматография, цикорий растворимый натуральный

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 5. С. 50-55. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00076.

Цикорий растворимый натуральный (ЦРН) - это высушенный водный экстракт измельченных обжа­ренных корней цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.) семейства Астровые (Asteraceae Bercht. & J. Presl), который предназначен для быстрого приго­товления холодных и горячих напитков, пригодных для непосредственного употребления в пищу как взрослы­ми, так и детьми (старше 3 лет) [1-3].

В настоящее время для контроля качества ЦРН при­меняется ГОСТ Р 55512-2013 "Цикорий натуральный растворимый. Технические условия" [1], в котором ука­заны требования по органолептическим, физико-хими­ческим, микробиологическим показателям, по содер­жанию токсичных элементов и содержанию углеводов. Согласно стандарту, необходимо определять массовую долю свободных углеводов [фруктозы (5,0-20,0%), глю­козы (2,0-5,0%) и сахарозы (2,0-5,0%)], связанных уг­леводов [глюкозы (5,0-10,0%) и фруктозы (40,0-60,0%)], содержание которых устанавливают после кислотного гидролиза, а также инулина (не менее 30%) [1].

Наибольший интерес представляет показатель, рег­ламентирующий содержание инулина в конечном про­дукте. Инулин - это полифруктозан, состоящий из 30-35 остатков фруктозы в фуранозной форме; при гидролизе под действием фермента инулиназы об­разует D-фруктозу и незначительное количество глюкозы [3]. Инулин является одним из основных компо­нентов ЦРН, относится к группе растворимых пищевых волокон и применяется в качестве пребиотика, входит в состав функциональных пищевых продуктов [3-5], используется в комплексной терапии синдрома раздра­женного кишечника [6], сахарного диабета 2 типа [7] и др. Инулин применяется также в качестве агента, препятс­твующего окислению липидного компонента при произ­водстве мучных кондитерских изделий [8]. Адекватный уровень потребления инулина (полифруктозаны и др.) [9] составляет 5-10 г/сут, в случае превышения (более 20 г/сут) возможно развитие нежелательных побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта [10].

Следует отметить, что метод определения инулина, изложенный в ГОСТ Р 55512-2013, отличается низ­кой специфичностью (кислотному гидролизу подвер­гаются все полисахариды), а также, как показала практика, невысокой межлабораторной воспроизводимостью. Существуют методы оценки содержания инулина в растительном сырье (лопуха большого, подсолнечника однолетнего, девясила высокого) [11-13], основанные на прямом спектрофотометрическом определении полифруктозанов после их кислотной трансформации в окрашенные продукты [5-гидроксиметилфурфурол (HMF)]. Окрашивание обусловлено способностью угле­водов (сахарозы, фруктозы) при нагревании с концен­трированными кислотами к образованию продуктов, имеющих поглощение в области 200-380 нм [14]. Эти не­специфичные косвенные методы также дают завышен­ные результаты и не могут служить для точной количест­венной оценки. Наиболее перспективными являются ме­тоды, основанные на ферментативном гидролизе ину­лина, с последующим определением высвободившихся моносахаров [15].

Цель работы - разработка высокоспецифичной мето­дики определения содержания инулина в растворимом натуральном цикории с использованием метода высоко­эффективной жидкостной хроматографии с рефракто­метрическим детектированием (ВЭЖХ-РД) для опреде­ления моносахаров после ферментативного гидролиза полифруктозана.

Материал и методы

Анализ проводили с использованием хроматографической системы, состоящей из прибора Agilent 1260 Series ("Agilent Technologies", США), насоса (обес­печивает подачу 4 растворителей одновременно), ус­тройства для автоматического ввода проб (автосемплера) с термостатом, термостата хроматографических колонок, рефрактометрического детектора Agilent 1260 Infinity Refractive Index Detector (RID) под управлением программного обеспечения для обработки хроматогра-фических данных ChemStation (ver. B.01); неподвижная фаза - колонка хроматографическая для ВЭЖХ Waters Sugar-Pak ("Waters", США), длиной 300 мм и внутрен­ним диаметром 6,5 мм, наполненная микрокристалли­ческим катионообменным гелем в кальциевой форме с размером пор 10 мкм. Условия проведения хроматографических измерений: элюент - вода по ГОСТ ISO 3696, 2-й степени чистоты; режим элюирования - изократический; температура колонки - 80±5 °С; детектирование рефрактометрическое; скорость потока подачи элюента - 0,5 см3/мин; объем пробы - 10 мкл.

Для ферментативного гидролиза применяли амилоглюкозидазу ("Sigma-Aldrich", США), инулиназу ("Sigma-Aldrich", США). В качестве стандартных образцов ис­пользовали фруктозу (>99,0%, "Sigma-Aldrich", США) и инулин (>95,0%, "Sigma-Aldrich", США).

В качестве анализируемых проб выступали промыш­ленные образцы цикория натурального растворимого, реализуемые в магазинах и торговых сетях Москвы и Московской области, российских и зарубежных фирм-производителей: ОАО "Русский Продукт", ООО "НоваПродукт АГ", ООО "Штраус", ЗАО "Еремеевс­кое", ООО "Кофейная компания "Вокруг света"", ЗАО "Кофе-цикорный комбинат "АРОНАП", Leroux Fabrique (Франция).

Метод определения инулина базируется на существу­ющем методе определения простых сахаров (фруктозы и др.), изложенном в ГОСТ 31669-2012 [16].

Подготовка проб заключалась в растворении навески образца ЦРН, разведении и ферментативном гидро­лизе.

Навеску образца 0,5 г (взвешивают с точностью до 0,1 мг) помещают в стакан объемом 100 см3. При пос­тоянном перемешивании добавляют 10 см3 кипящей воды и сразу же проверяют значение рН, оно должно находиться в пределах от 6,5 до 8,0. В случае не­соответствия устанавливают значение pH на уровне 4,5±0,2 путем добавления 0,1 М раствора соляной кис­лоты либо 0,1 М раствора калия гидроокиси. Про­должают измерение и регулирование значения рН до того момента, пока навеска полностью не растворится. Затем промывают электрод кипящей водой. Количест­венно переносят раствор в мерную колбу объемом 50 см3, промывают стакан кипящей водой. Помещают колбу на водяную баню и выдерживают в течение 10 мин при 85±2 °С, непрерывно перемешивая.

Раствор охлаждают до комнатной температуры, гомо­генизируют, доводят водой до 50 см3. Затем переносят раствор в стакан и продолжают интенсивно перемеши­вать с помощью магнитной мешалки. Отбирают аликвоту 15 см3 для гидролиза.

На первом этапе гидролиза аликвоту объемом 15 см3 помещают в колбу (50 см3) и добавляют такое же коли­чество ацетатного буфера (pH 4,5). Проверяют значение рН раствора, которое должно находиться в пределах 4,5±0,05. В случае несоответствия корректируют значение рН путем добавления 0,1 М раствора соляной кислоты либо 0,1 М раствора калия гидроокиси. Затем добавляют 50 мкл амилоглюкозидазы (>260 Ед/мл). Закрывают алюминиевой фольгой, выдерживают смесь в течение 60 мин на водяной бане при температуре 40±2 °С при постоянном слабом перемешивании. Затем остужают до комнатной температуры (20±2 °С).

На втором этапе гидролиза из первого гидролизата отбирают аликвоту 10 см3, добавляют 100 мкл рас­твора инулиназы (≥280 Ед/мл). Закрывают алюминие­вой фольгой, снова выдерживают в течение 30 мин на водяной бане при температуре 40±2 °С при постоян­ном слабом перемешивании. Отсчет времени начинают с того момента, когда температура реакционной смеси достигнет 40 °C. Затем остужают до комнатной темпе­ратуры (20±2 °С).

Результаты и обсуждение

Модификации, которые были произведены в процессе разработки метода определения инулина, заключались в изменении подготовки пробы к анализу и не затраги­вали метрологических характеристик метода определе­ния простых сахаров.

При этом в эксперименте была произведена оптими­зация условий проведения гидролиза инулина. Опти­мизации были подвергнуты следующие параметры: pH и температура реакционной смеси, содержащей суб­страт и ферменты. С учетом полученных эксперимен­тальных данных (см. таблицу), а также принимая во внимание данные литературы [16], установлены оп­тимальные значения проведения гидролиза инулина: pH 4,5 и температура 40 °C.

Для количественного определения используют метод абсолютной калибровки (площадь пика или его вы­соту). Линейность устанавливают на рабочих стандар­тных растворах фруктозы [17]. Анализ проводят, пос­ледовательно измеряя концентрацию сахара в образце и в рабочем стандартном растворе сахара. Типичные примеры ВЭЖХ-РД-хроматографического анализа об­разца ЦНР представлены на рисунке.

Для расчета содержания инулина определяют содер­жание фруктозы, выделившейся в результате гидро­лиза, за вычетом свободной фруктозы, с применением программного комплекса ChemStation.

Методика для определения инулина в ЦРН прошла предварительные валидационные испытания по па­раметрам специфичность, линейность, правильность (методом добавок стандартных образцов инулина). Сле­дующим этапом разработки настоящего метода яв­ляется валидация в соответствии с протоколами ICH, проведение широкомасштабного межлабораторного испытания.

В ходе анализа серий образцов ЦРН с примене­нием разработанного метода было установлено, что содержание инулина в образцах колеблется в преде­лах от 4 до 25%. Перспективным является изучениезависимости содержания инулина в сырье (корнях ци­кория) от степени его обжаривания. Этот этап явля­ется одним из важнейших в технологии производства напитков из цикория, в процессе которого протекает целый ряд физико-химических и пиролитических про­цессов, влияющих на содержание инулина в конечном продукте.

На сегодняшний день строгое соблюдение стандартов качества и безопасности пищевых продуктов и напитков можно гарантировать только в случае использования надежных современных приборов и валидированных методов. Эти приборы и методы должны соответс­твовать всем требованиям современной нормативной документации. ЦРН представляет собой сложную, мно­гокомпонентную систему, качество которой зависит от свойств сырья и совокупности изменений при техно­логической обработке и последующем хранении. Раз­работка современного инструментального физико-хи­мического метода является важным этапом на пути создания современной нормативной документации.

Литература

1. ГОСТ Р 55512-2013 "Цикорий натуральный растворимый. Техни­ческие условия (с поправкой)". Дата введения 2015-01-01.

2. Конь И.Я., Тоболева М.А., Сафронова А.И., Елезова Л.И., Але­шина И.В., Гурченкова М.А. Изучение переносимости и эффек­тивности применения растворимого сублимированного цикория в питании детей дошкольного и школьного возраста // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 194-195.

3. Лузина Е.В. Пищевая ценность цикория // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 2. С. 62-65.

4. Бычков И.Н., Рябкина Е.А. Иоактивные метаболиты растений: возможности применения в составе функциональных продук­тов питания для коррекции метаболических нарушений // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 134-135.

5. Королев А.А., Корнева Л.Я., Коптяева И.С., Фазулина О.Ф., Лындина М.И. Разработка пищевых концентратов для рационов здорового питания // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 195.

6. Пилипенко В.И., Теплюк Д.А., Шаховская А.К., Исаков В.А., Воробьева В.М., Воробьева И.С. и др. Использование многоком­понентного функционального пищевого продукта у больных с синдромом раздраженного кишечника с запорами: результаты сравнительного контролируемого исследования // Вопр. пита­ния. 2016. Т. 85, № 2. С. 84-91.

7. Малкина В.Д., Балуян Х.А., Жиркова Е.В., Мартиросян В.В. Хлебобулочные изделия антидиабетического действия // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № S5. С. 52.

8. Сидорова Л.Н., Байков В.Г., Бессонов В.В., Скобельская З.Г. Влияние пищевых волокон на сохранность липидного компонента мучных кондитерских изделий // Вопр. питания. 2007. Т. 76, № 3. С. 78-81.

9. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04 "Рекомендуе­мые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ".

10. Оробинская В.Н., Писаренко О.Н. Инулин, левулин и олигофруктоза - пребиотики XXI века // Перспективы науки. 2015. № 2 (65). С. 18-23.

11. Копытько Я.Ф. Количественное определение суммы углево­дов в пересчете на фруктозу в соке лопуха после конверсии в фураны // Хим.-фарм. журн. 2017. Т. 51, № 4. С. 39-41.

12. Пшукова И.В., Коновалов Д.А., Карпенко В.А., Лигай Л.В., Куле­шова С.А. Фитохимическое и фармакологическое изучение кор­ней подсолнечника однолетнего // Химия растительного сырья. 2014. № 2. С. 189-194.

13. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Исследование колориметри­ческой реакции инулина с резорцином в зависимости от усло­вий ее проведения // Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 81-87.

14. Руководство Р. 4.1. 1672-03 "Руководство по методам контро­ля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" / Минздрав России. М. : Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 240 с.

15. Prosky L., Hoebregs H. Methods to determine food inulin and oligofructose // J. Nutr. 1999. Vol. 129, N 7. P. 1418-1423.

16. Rocha J.R. et al. Design and characterisation of an enzyme system for inulin hydrolysis // Food Chem. 2006. Vol. 95, N 1. P. 77-82.

17. ГОСТ 31669-2012 "Продукция соковая. Определение сахарозы, глюкозы, фруктозы и сорбита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии".