Для контроля качества и безопасности пищевых продуктов необходимы эффективные методы определения токсичных элементов, а также эссенциальных микроэлементов на всех стадиях обращения пищевых продуктов, начиная от сельскохозяйственного производства, переработки, хранения, транспортировки и заканчивая приготовлением пищи.
В настоящее время используются различные методы детектирования эссенциальных микроэлементов и загрязнителей физической, химической и биологической природы в пищевых продуктах и сельскохозяйственном сырье [1]:
- микроскопия и связанные с ней методы;
- атомно-эмиссионная и абсорбционная спектрометрия;
- масс-спектрометрия;
- ядерно-активационные аналитические методы (ЯААМ);
- рентгенофлуоресцентный анализ (РФА); и др.
Методы детектирования ЯААМ, развитие и применение которых имеет длительную и успешную историю [2-5], и РФА обладают рядом преимуществ в части чувствительности и точности измерений и могут рассматриваться как полезное дополнение к неядерным методам анализа, упомянутым выше.
Цель настоящей работы - путем теоретических расчетов и тестовых испытаний продемонстрировать возможность использования этих методов для контроля качества и безопасности пищевых продуктов и исследования биокинетики микроэлементов в части достижения необходимой точности (не более 15%) и чувствительности (ниже допустимых концентраций токсичных микроэлементов) и подготовить их к практическому применению.
Материал и методы
Ядерно-активационные аналитические методы детектирования
В настоящее время можно отметить несколько вариантов ЯААМ, каждый из которых имеет свою наиболее эффективную область применения. Основой этих методов является процедура детектирования гамма-излучения радиоактивных ядер, образующихся при облучении соответствующих ядер-мишеней исследуемого образца в потоке нейтронов или заряженных частиц. Следует отметить инструментальный нейтронный активационный анализ (ИНАА) и инструментальный активационный анализ с использованием потока быстрых заряженных частиц (протонов и др.).
С помощью ЯААМ можно детектировать большое число различных элементов. Актуальными с позиции контроля качества и безопасности пищевых продуктов являются эссенциальные микроэлементы (Fe, I, Cu, Zn, Co, Cr, Mo, Se, Mn), условно эссенциальные (Br, B, F, Li, Ni, V, Si) и токсичные элементы (Al, As, Cd, Pb, Sb, Hg, Be, Bi, Tl). Следует отметить: как правило, Ag относят к классу токсичных, а биологическая роль Ti до сих пор недостаточно ясна.
Активационный анализ включает 2 стадии: 1) активацию искомых химических элементов, содержащихся в образце, в потоке тепловых нейтронов или быстрых заряженных частиц (протонов и др.) с образованием радиоактивных гамма-излучающих изотопов с достаточно большим периодом полураспада (сутки и более); 2) гамма-спектрометрический анализ этих радиоизотопов и обработка его результатов. Вариант с активацией быстрыми заряженными частицами расширяет список детектируемых элементов или позволяет улучшить качество метода относительно элементов, для которых нейтронно-активированные изотопы имеют относительно малый период полураспада. При этом можно достичь хороших результатов детектирования таких элементов, как As, Au, V, Pb, Cu, Ti, Ca.
Инструментальный нейтронный активационный анализ
Метод ИНAA как вариант ЯААМ разработан несколько десятилетий назад в целях проведения биохимического и физико-химического анализа. Этот метод до настоящего времени является уникальным с позиции своей чувствительности и селективности. Его важными особенностями и преимуществами являются также простота подготовки проб, недеструктивный характер анализа (возможность повторного исследования образца), расширенная область применения в части определения значительного числа элементов в образцах различной природы, включая биологические среды, высокие надежность и точность, возможность измерения содержания непосредственно в объеме твердотельных проб. Содержание искомого элемента можно определить как в микро-, так и в макрообразцах размером до нескольких сантиметров по всем трем измерениям, что особенно важно при неоднородном содержании элемента. Можно исследовать биокинетику контролируемых веществ в организме лабораторных животных, включая биофильные элементы (например, цинк, селен), при моделировании их поступления из окружающей среды, в том числе с пищевыми продуктами. Имеется возможность использования заряженных частиц для активации искомых элементов, а также в одном сеансе ЯААМ определить несколько элементов.
Для достижения высокой точности измерений (5-15%), как правило, применяется относительная методика: наряду с объектом облучается стандартный образец (эталон) с известным содержанием искомого стабильного изотопа.
Современный высокий уровень ИНАА определяется возможностью использования мощных потоков нейтронов (1012-1015 н/см2с) исследовательских реакторов, сочетания различных версий методики, современных полупроводниковых детекторов высокого разрешения (≤2 кэВ), стандартных образцов, современной измерительной и вычислительной техники, а также современной компьютерной технологии для обработки и интерпретации данных.
Активационный анализ имеет свои недостатки. С его помощью невозможно определить валентное состояние элемента, в частности решить проблему определения органических и неорганических форм микроэлементов; он требует использования сложной аппаратуры (например, ядерного реактора), работы с радиоактивными веществами, что определяет необходимость соблюдения особых требований техники безопасности и получения разрешения на работу.
Отбор, хранение и подготовку образцов для анализа проводили в соответствии с рекомендациями документа "Кодекс Алиментариус" по методам анализа и отбора проб и методическими указаниями МУ 1.2.2741-10 "Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных".
Процедура подготовки образцов. Образцы пищевых продуктов в естественном или высушенном виде в количестве от десятых долей грамма до нескольких граммов упаковывали в пробирки типа Эппендорф. Образцы наночастиц (НЧ) приготавливали в виде водных суспензий и в этой форме также помещали в такие пробирки.
Несколько пробирок с образцами помещали в контейнер, изготовленный из чистого алюминия, который вставляется в канал исследовательского ядерного реактора для облучения нейтронами.
Для планирования всех этапов исследования, в частности для выбора интервалов времени на этапах нейтронного облучения и гамма-спектрометрического анализа, используется так называемый абсолютный метод. Это прямой теоретический расчет активации изучаемых элементов на основе данных относительно интенсивности потока нейтронов и ядерных характеристик первичных и активированных изотопов.
Инструментальный протонный активационный анализ
В силу особой значимости таких исследований была начата разработка методов детектирования наноматериалов с содержанием титана. Они основаны на использовании активации титана быстрыми протонами с образованием радиоактивного ванадия 48V в реакциях (р; n, 2n, ... ) на изотопах природного титана. Данная реакция имеет относительно высокие значения сечения активации в диапазоне энергии протонов 7-17 МэВ, достаточные, для того чтобы рассчитывать на получение удовлетворительных результатов по чувствительности детектирования титана методом ЯААМ. Радиоактивный изотоп 48V имеет достаточно длительный период полураспада (T1/2 =15,98 сут) и гамма-линии 1,312 и 0,9835 МэВ с выходом одного фотона на каждый распад.
Наиболее серьезные проблемы применения ЯААМ с активацией заряженными частицами связано именно со стадией активации исследуемого элемента. Для того чтобы изучить возможность использования ЯААМ на быстрых заряженных частицах, проводился тестовый эксперимент на пучке протонов циклотрона в НИЦ "Курчатовский институт".
В этом эксперименте был использован порошок НЧ TiO2 в форме рутила ("Sigma-Aldrich", США-Германия) -частично агрегированных палочковидных нанокристаллов с диаметром 5-10 нм и длиной 40-50 нм.
После предварительного теоретического анализа был принят и реализован следующий сеанс экспозиции: облучению подвергался образец НЧ TiO2 массой 0,6 г в запаянной трубке из кварцевого стекла; время экспозиции - 28 мин при средней плотности потока частиц 1012 р/cм2с.
После открытия трубки облученный порошок (0,58 г), содержащий радиоизотопы 48V, растворяли в пробирке с 25 см3 дистиллированной воды. Полученную водную суспензию интенсивно перемешивали, и активность каждого ее 1 см3 составляла 29 кБк/см3. Эта водная суспензия была готова к изучению биокинетики НЧ TiO2.
Рентгенофлуоресцентный анализ РФА - физический метод анализа, который позволяет напрямую определять в порошкообразных, твердых и жидких пробах почти все химические элементы периодической системы. С помощью РФА можно определять как очень низкие концентрации элементов на уровне мкг/кг, так и очень большие, вплоть до 100% без разбавления пробы. РФА прежде всего получил широкое распространение, в промышленности, а также в области научных исследований. Широкие возможности метода особенно полезны при крайне сложном анализе объектов окружающей среды, при контроле качества производства и при анализе сырья и готовой продукции [6].
Возможности РФА значительно расширяются при использовании синхротронного рентгеновского излучения - тормозного электромагнитного излучения электронов, движущихся по искривленной траектории. Его основным преимуществом является широкий энергетический спектр.
Особенности синхротронного излучения открывают следующие возможности для РФА: анализ образцов очень малого объема и малой массы (от 100 до 0,5 мг), значительное повышение пределов обнаружения (на 1-2 порядка, чем для РФА на рентгеновских трубках), проведение анализа с вариацией энергии возбуждающих квантов (от 0 до 40 кэВ).
К недостаткам способа следует отнести необходимость приготовления тонких образцов и более жесткие требования к измельчению материала и его однородности, а также то, что неразрушающие методы анализа, как правило, жестко привязаны к стандартным образцам (эталонам).
Список элементов, которые зможно детектировать с помощью РФА, достаточно широк: S, Cl, Ar, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Kr, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, I, Cs, Ba, La, Ce, Ta, W, Au, Hg, Tl, Pb, Bi.
Проведен тестовый эксперимент по обнаружению НЧ в биологических пробах методом РФА с использованием синхротронного рентгеновского излучения от Курчатовского специализированного источника синхротронного излучения в ФГБУ "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"".
Результаты и обсуждение
Исследования с использованием ЯААМ и РФА выполняются по двум разным направлениям: 1) контроль качества и безопасности пищевых продуктов путем разработки и использования эффективных методов детектирования микроэлементов; 2) исследования биокинетики микроэлементов, в том числе в наноразмерном физико-химическом виде, при их пероральном поступлении в организм лабораторных животных с особым вниманием к преодолению биологических барьеров.
Применение ядерно-активационных аналитических методов к контролю пищевых продуктов
Результаты ИНАА представляются в терминах активности изучаемого радиоактивного изотопа со стандартной инструментальной среднеквадратичной ошибкой. Метод расчета этой ошибки в методе ИНАА с использованием сравнения со стандартными образцами описан в [5]. Для получения достоверного результата измеренияизучаемого содержания элементов в исследованных средах процедуру измерения проводят для не менее чем 4 одинаковых образцов.
Результаты определения содержания элементов As, Ag, Se, Cd и др. в образцах пищевых продуктов (картофель, молочные продукты, крупы, хлеб и др.), отобранных в центральных областях европейской части России, с использованием ЯААМ приведены в табл. 1 и 2. Наряду с полученными нами результатами представлены результаты исследований, проведенных ранее группой авторов с использованием атомной спектрометрии и ИНАА [4].
Поскольку элементы Pb и Ti не имеют соответствующих радиоактивных изотопов для применения ИНАА, для этих и ряда других элементов предполагается использовать инструментальный протонный активационный анализ.
Одно из основных требований к качеству метода измерения состоит в том, чтобы иметь чувствительность ниже допустимого уровня (ДУ) загрязнителей. Значения пределов чувствительности, представленных в табл. 1 и 2, отражают умеренные условия проведения экспериментов и технические характеристики оборудования в ФГБУ "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"". При необходимости эти условия до некоторой степени можно изменить в сторону увеличения чувствительности (увеличивая время облучения и/или гамма-спектрометрического анализа).
Из данных табл. 1 и 2 следует, что для Pb метод ЯААМ не обладает достаточной чувствительностью. Результаты, полученные в настоящей работе, находятся в хорошем согласии с результатами работы [4].
Применение ядерно-активационных аналитических методов к контролю наночастиц в пищевой цепочке
Развитие нанотехнологий и быстрый рост количества продуктов, содержащих НЧ, поднимает проблему обеспечения их безопасности для человека и окружающей среды. В последние 10-20 лет производство и потребление НЧ серебра и титана (в виде TiO2) резко возросло в различных отраслях промышленности, в том числе в пищевой и фармацевтической.
Это диктует необходимость развития методов изучения биокинетики НЧ в организме лабораторных животных с основным вниманием к их поступлению с пищей и водой. Одной из главных задач исследования является количественная оценка характеристик преодоления биологических барьеров, с особым вниманием к гематоэнцефалическому барьеру и проникновению НЧ через плаценту и грудное молоко [7-9].
Одной из целей проводимых исследований биокинетики НЧ, поступающих в организм экспериментальных животных с пищей или водой, является получение экспериментальных данных по поглощению, биораспределению и бионакоплению НЧ для последующегоразвития математических моделей биокинетики. Такие модели должны устанавливать связь между дозами НЧ, вводимых в организм, и эффектами, которые обусловлены накоплением НЧ в органах и тканях, как разового поступления, так и в случае множественной (подострой или хронической) экспозиции [8].
Из двух вариантов активационного анализа - активации до или после введения НЧ в организм животного -привилегированным или даже единственно возможным вариантом является предварительная активация НЧ. Этот выбор особенно важен для НЧ, содержащих биогенные элементы с высоким естественным содержанием в организме (железо, цинк, селен и др.).
Активационный анализ с использованием быстрых протонов
Для выполнения биологической части эксперимента был подготовлен радиоактивный препарат - коллоидный раствор НЧ TiO2 объемом 25 см3 плотностью 10 мг/см3 (по TiO2) и активностью 29 кБк/см3 (2,9 кБк/мг TiO2). Эта величина удельной активности используется для расчета содержания НЧ TiO2 в органах животного.
Биологическая часть эксперимента была проведена в ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России на 4 экспериментальных группах (по 3-5 особей в группе) и контрольной группе (4 особи) крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 200-240 г. Животных во время эксперимента содержали в стандартных условиях вивария в специальных клетках, работу на животных выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. На фоне стандартного рациона каждой крысе внутрижелудочно был введен 1 см3 из приготовленного коллоидного раствора НЧ TiO2. Перед введением крысам суспензию НЧ обрабатывали в течение 15 мин ультразвуком для разрушения в ней агломератов НЧ. Через требуемое время после введения суспензии НЧ животных каждой группы выводили из эксперимента путем эфирной наркотизации. Органы у крыс извлекали через 4 временных интервала, отсчитываемых от момента ввода суспензии: через 4, 24, 48 и 120 ч. Были приготовлены биологические образцы: кровь, мозг, желудок, тонкую и толстую кишку, почки, печень, кал, моча. Извлеченные органы взвешивали, измеряли активность радиоактивной метки в них на высокочувствительной спектрометрической аппаратуре [спектрометр ("Canberra", США) в составе: полупроводниковый детектор GC4018, цифровой многоканальный анализатор DSA-1000, компьютер и программное обеспечение Genie-2000 - Genie S501, Genie S502].
Расчет содержания НЧ TiO2 в органах экспериментального животного через измеренную активность показал чрезвычайно слабое проникновение НЧ TiO2 через желудочно-кишечный тракт. Их содержание в крови в максимуме (примерно через 24 ч) достигло 0,002% от введенного в желудок количества (ошибка измерения ~12%). Примерно такое же количество НЧ TiO2 было обнаружено и в печени. Возможное содержание НЧ TiO2 в других органах оказалось ниже порога чувствительности, равного примерно 30 нг TiO2 в данных условиях эксперимента.
В плане практической реализации подобного метода уместно упомянуть исследование биокинетики НЧ TiO2 при их ингаляционном введении в организм экспериментальных животных (крыс). Оно было проведено в Германии с использованием ЯААМ с активацией Ti быстрыми протонами [10].
Наши результаты по исследованию биокинетики НЧ TiO2 при их пероральном поступлении и результаты работы [10] показывают, что возможным критическим путем проникновения исследуемых НЧ в организм животного является не пероральное, а ингаляционное поступление.
Эксперимент по исследованию биокинетики наночастиц серебра с использованием инструментального нейтронного активационного анализа
В исследовании использовались НЧ серебра "Argovit-C" (НПЦ "Вектор-Вита", РФ), стабилизированные поливинилпирролидоном. Размер и возможный процесс агрегации исследовали с использованием метода динамического рассеяния света [5]. Данные исследования показали, что НЧ были не агрегированы, а средний размер НЧ составлял примерно 34 нм, что находилось в хорошем согласии с данными производителя.
Экспериментальные исследования были проведены на белых лабораторных нелинейных мышах-самцах SHK исходной массой тела 25-30 г с соблюдением требований регламентирующих документов по лабораторной практике [11-13]. Животных во время эксперимента содержали в стандартных условиях вивария в специальных клетках со стандартным рационом питания в условиях 12-часового цикла "день-ночь".
Изучение процессов биокинетики НЧ серебра проводили в двух вариантах: 1) после разового перорального введения в количестве 100 мкг (6 мышей); 2) после длительного ежедневного перорального введения НЧ серебра в количестве 100 мкг/сут в течение 2 мес и после введения дистиллированной воды в течение одного последующего месяца после отмены введения НЧ (6 мышей). В каждом варианте также использовали контрольные группы по 2 особи. НЧ перорально вводились (в виде коллоидного раствора НЧ концентрацией 0,5 мг/см3).
В соответствии с планом эксперимента мышей подвергали анестезии и проводили забор органов (головной мозг, печень, кровь, почки) и гравиметрические измерения масс всех органов. После чего органы подсушивали в течение 24 ч в сушильном шкафу при температуре 70 °С до состояния вяленых пищевых продуктов.
Одновременно с контрольными и экспериментальными образцами проводили подготовку эталонных образцов, содержащих известное количество серебра.
Дальнейшую работу с образцами, включая облучение на реакторе, измерение активности радиоактивнойметки 110mAg в них на высокочувствительной спектрометрической аппаратуре и обработку результатов, проводили в соответствии с руководством [5].
Некоторые примеры результатов исследования биокинетики НЧ Ag в экспериментах на мышах SHK методом ИНАА представлены на рис. 1 и 2.
Метод ИНАА может быть использован и для оценки активности изотопа 59Fe - продукта наведенной активности в атомах железа, которое содержится в основном в составе гемоглобина периферической крови. Данные по активности этого изотопа могут быть использованы при оценке доли НЧ серебра, содержащихся в капиллярах головного мозга [12].
Из полученных результатов можно видеть, что НЧ серебра могут преодолевать гематоэнцефалический барьер, а также что скорость выведения из организма НЧ серебра из крови и печени после отмены инъекции НЧ довольно высока (около 80 и 75% в месяц, соответственно), а скорость выведения НЧ серебра из мозга крайне низка (~6% в месяц).
Заключение
Таким образом, методы детектирования химических элементов ЯААМ и РФА могут быть использованы для измерения содержания токсичных элементов, а также микроэлементов в пище, пищевых цепях или других образцах с целью гигиенической оценки качества и безопасности.
Для некоторых элементов (Ti, Pb и др.) необходимо использовать ЯААМ, основанный на активации быстрыми заряженными частицами, или РФА.
Развиваемые методы ЯААФ и РФА определения химических элементов в разных средах предлагается использовать в целях:
- контроля качества и безопасности пищевых продуктов в части обнаружения токсичных элементов, а также микроэлементов;
- исследования на лабораторных животных биокинетики НЧ, поступающих с пищей и водой.
Ядерно-активационные аналитические методы и РФА являются полезным дополнением к другим, неядерным, методам анализа. Благодаря своим свойствам (простота подготовки проб, неразрушающий метод, возможность определения массового содержания элементов как в микро-, так и в макрообразцах) эти методы могут иметь некоторые преимущества при проведении анализа качества и безопасности пищевых продуктов в части достижения необходимой чувствительности и точности. В частности, эти преимущества могут проявиться при анализе образцов с неоднородным содержанием искомых элементов и при исследовании биокинетики контролируемых веществ в организме лабораторных животных при их поступлении из окружающей среды, в том числе с пищевыми продуктами. В ряде исследований биокинетики эссенциальных элементов может быть целесообразное совместное использование ядерных и неядерных методов анализа. В этих случаях каждый из этих методов определяет свой набор физико-химических характеристик контролируемых веществ.
Исследования проведены при финансовой поддержке Минобрнауки России (проект RFMEFI60414X0114).
Литература
1. Gmoshinski I.V., Khotimchenko S.A., Popov V.O. et al. Nanomaterials and nanotechnologies: methods of analysis and control // Russ. Chem. Rev. 2013. Vol. 82, N 1. P. 48-76.
2. Кузнецов Р.А. Активационный анализ. М. : Атомиздат, 1974. 343 с.
3. Frontasyeva M.V. Neutron activation analysis for the life sciences. a review // Phys. Part. Nucl. Lett. 2011. Vol. 42, N 2. P. 332-378.
4. Gorbunov A.V., Lyapunov S.M., Okina O.I. et al. Assessment of human organism's intake of trace elements from staple Foodstuffs in central region of Russia. Preprint of the Joint Institute for Nuclear Research. Dubna, 2004. 16 p.
5. Demin V.A., Demin V.F., Buzulukov Yu.P. et al. Formation of certified reference materials and standard measurement guides for development of traceable measurements of mass fractions and sizes of nanoparticles in different media and biological matrixes on the basis of gamma ray and optical spectroscopy // Nanotechnol. Russia. 2013. Vol. 8, N 5-6. P. 347-356.
6. Сидорина А.В., Трунова В.А. Учет изменения интенсивности пучка синхротронного излучения при регистрации спектров биологических образцов методом РФА-СИ // Аналитика и контроль. 2013. Т. 17, № 1. С. 4-9.
7. Buzulukov Yu.P., Arianova E.A., Demin V.F. et al. Bioaccumulation of silver and gold nanoparticles in organs and tissues of rats studied by neutron activation analysis // Biol. Bull. 2014. Vol. 41, N 3. С. 255-263.
8. Demin V.A., Gmoshinski I.V., Demin V.F., et al. Modeling of inter-organ distribution and bioaccumulation of engineered nanoparticles (on an example of silver nanoparticles) // Nanotechnol. Russia. 2015. Vol. 10, N 3-4. P. 288-296.
9. Melnik E.A., Buzulukov Yu.P., Demin V.F., et al. Transfer of silver nanoparticles through the placenta and breast milk during in vivo experiments on rats // Acta Naturae. 2013. Vol. 5, N 3 (18). P. 45-53.
10. Wolfgang G. Kreyling, Alexander Wenk, Manuela Semmler-Behnke // Report-no (UBA-FB). 001357, Schriftenreihe Umwelt & Gesundheit, 04/2010. URL: http://www.uba.de/uba-info-medien-e/4022.html.
11. ТР ТС 021/2011. О безопасности пищевой продукции.
12. Buzulukov Yu., Antsiferova A., Demin V. et al. The method of radioactive tracer for measuring the amount of inorganic nanoparticles in biological samples // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2015. Vol. 98. Article ID 012039; doi: 10.1088/1757-899X/98/1/12039.
13. Soloviev V.Yu., Antsiferova A.A., Fatkina S.S. et al. Determination of silver nanoparticle concentration ratio in the blood and brain of rats for different administration routes // Nano Hybrids and Composites. 2017. Vol. 13. P. 206-210.