Характеристика эффективности использования наночастиц оксида цинка в питании. Эксперименты на лабораторных животных

РезюмеВ эксперименте на крысах изучена биодоступность наночастиц оксида цинка ZnO. Определяли содержание цинка в сыворотке крови и бедренных костях, всасывание в тонкой кишке макромолекул куриного овальбумина, ряд гематологических, биохимических и иммунологических показателей, состояние апоптоза клеток печени. Показано, что прием наночастиц ZnO позволяет восстанавливать статус этого микроэлемента, нарушенный вследствие потребления цинкдефицитного рациона.

Ключевые слова:оксид цинка, наночастицы, крысы, биодоступность

Цинк (Zn) играет важную роль в организме человека и животных,входя в состав более чем 200 функционально активных белков, включая многие ферменты [6, 7]. Отмечающийся среди населения ряда развивающихся стран дефицит Zn, тесно сопряженный с недостаточным потреблением белка животного происхождения, частным возникновением гельминтозов и развитием диареи, проявляется, в первую очередь, резкой задержкой роста и полового развития, дерматитом, снижением противоинфекционного иммунитета [8]. В России клинические признаки недостаточности Zn встречаются крайне редко, однако, согласно данным неоторых авторов [3, 12 и др.], обеспеченность российского населения (особенно детей) Zn может быть не оптимальной. Ввиду этого актуальным представляется обогащение данным микроэлементом ряда пищевых продуктов массового потребления или использование цинксодержащих биологически активных добавок к пище (БАД). При этом возникает вопрос о способах введения дополнительного Zn [4-6].

Развитие нанотехнологий позволяет по-новому подойти к вопросу о формах эссенциальных элементов, применяемых в питании человека. Наночастицы (НЧ) неорганических веществ, в том числе оксида цинка (ZnO), отличаются, согласно ряду данных [2, 9], повышенной способностью к проникновению через биологические барьеры, а также повышенной химической активностью и растворимостью. Вследствие этого есть основания полагать, что НЧ ZnO могут быть эффективным источником Zn в питании человека. Целью настоящей работы было изучение возможности коррекции недостаточности Zn у крыс с использованием НЧ ZnO.

Материал и методы

В работе использованы препарат НЧ ZnO фирмы "Sigma-Aldrich" (США-Германия), а также сульфат цинка семиводный (ZnSO4Ч7Н2О) химически чистый (х.ч.). Размер НЧ, по данным фотонно-корреляционной спектроскопии на приборе "Рhotocor Complex" (производства фирмы "Photocor Instruments", США) составил в среднем около 30 нм1.

Проведены 3 серии эксперимента. В 1-й серии на 2 группах крыс (по 28 животных в каждой) по стандартной методике [7] изучали острую токсичность препаратов НЧ ZnO и сульфата цинка семиводного (ZnSO4), которые вводили однократно внутрижелудочно в виде дисперсии этих НЧ и раствора указанной соли. На протяжении данной серии эксперимента (14 дней) животные получали стандартный полусинтетический рацион [7]. По окончании данного эксперимента животных умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом.

Целью исследования во 2-й и 3-й сериях опыта было изучение биодоступности Zn. Эксперименты проводили на полученных из питомника РАМН "Столбовая" белых крысах-самцах Вистар с исходной массой тела в среднем 81±2 г.

Алиментарную недостаточность Zn воспроизводили согласно [1]. Для этого крысы были разделены на 6 групп (по 8-10 животных в каждой). На протяжении 14 дней они получали полусинтетический цинкдефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США) (по данным атомно-абсорбционной спектрофотометрии, содержание Zn <0,03 мг/кг) и деионизованую воду без ограничений. Затем опытные животные 2-й и 3-й групп (из 2-й серии опытов) на фоне указанного цинкдефицитного рациона получали в течение 35 дней ежедневно внутрижелудочно 1 раз в день указанные выше препараты НЧ ZnO в виде диспесии и соль ZnSO4 в дозе 0,4 мг на 1 кг массы тела в расчете на Zn. Опытные животные 5-й и 6-й групп (3-я серия эксперимента) получали внутрижелудочно по той же схеме, что крысы 2-й и 3-й групп, но в течение не 35, а 14 дней; дисперсию НЧ ZnO и соль ZnSO4 - в дозе 13 мг Zn на 1 кг массы тела. Животные 1-й и 4-й групп, находившиеся на цинкдефицитном рационе, получали внутрижелудочно деионизованную воду по той же схеме, что и опытные крысы (2, 3, 5 и 6-й групп) - препараты Zn. Всех животных содержали в пластмассовых клетках по 3-4 особи в каждой клетке, регулярно (2 раза в сут) сменяя подстилку во избежание копрофагии. Металлические (хромированные) детали клеток контролировали на отсутствие Zn в смывах с их поверхности. Крысы 7-й, контрольной, группы, получали сбалансированный общевиварный рацион (ОВР).

Животных всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах с точностью до ±0,5 г и определяли динамику прироста массы тела.

По окончании введения препаратов Zn все животные 2-й и 3-й серии опыта получали внутрижелудочно через зонд по 2 г/кг лиофилизованный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Через 3 ч после введения животным данного белка крыс умерщвляли под эфирной анестезией путем обескровливания, проводили патолого-анатомическое вскрытие, взятие внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников, мозга), а также бедренной кости (освобожденной от массы скелетной мускулатуры) и образцов крови. Путем взвешивания их на электронных весах определяли с точностью ±0,01 г абсолютную и относительную массу данных внутренних органов и бедра. Взятые образцы крови подвергали биохимическим, гематологическии и иммунологическим исследованиям. В сыворотке крови выявляли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью набора "BIO TEST Щелочная фосфатаза 120 (ALP 2*60)" (Чехия). Содержание Zn в бедренных костях определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе "Solaar 969 AA Sbeam" [11]2. Степень всасывания в кишечнике макромолекул овальбумина куриного яйца (ОВА) оценивали по его концентрации в сыворотке крови с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста [11]. Гематологические показатели, включая параметры эритропоэза (число эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрация Hb в эритроците), общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США).

Иммунологические показатели и апоптоз гепатоцитов изучали на проточном цитофлюориметре фирмы "Beckman Coulter International S.A." (США). Экспрессию CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep (Beckman Coulter, США). Для исследования апоптоза суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани BD Medimachine, производства фирмы "Becton Dickenson and Company", США. Окрашивание гепатоцитов (концентрация клеток - 1Ч106 см-3) производили конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе работы хранили на льду. Результаты выражали как процентное соотношение живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях распада (апоптоза) на 10 000 просчитанных объектов в каждом образце.

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета компьютерных программ SPSS 17.0, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни (ANOVA) и определение средней арифметической и ее ошибки (М±m).

Результаты и обсуждение

При определении острой токсичности (1-я серия эксперимента) раствор ZnSO4 и суспезию НЧ ZnO вводили крысам однократно внутрижелудочно в количестве 115; 1150 и 5750 мг/кг в расчете на Zn. Соответственно, летальность животных при этих 3 дозах составила для соли 0/9 (0%), 3/9 (33%) и 10/10 (100%), а для НЧ - 0/9 (0%), 0/9 (0%) и 2/10 (20%)1. Из этих данных следует, что ZnSO4, вводимый внутрижелудочно крысам, характеризуется величиной LD50 около 2500 мг/кг массы тела, то есть относится к III классу опасности (умеренно опасные вещества). Летальность в результате введения высоких доз НЧ ZnO была достоверно ниже, чем в случае введения соли ZnSO4 в эквивалентных по Zn количествах (р<0,05, критерий χ2), и оцененная путем экстраполяции величина LD50 для НЧ составила не менее 10 000 мг/кг. Таким образом, НЧ ZnO могут быть отнесены к IV классу опасности (малоопасные вещества).

Полученный результат показывает, что острая токсичность НЧ значительно ниже, чем у традиционной формы Zn.

Потребление цинкдефицитного корма в течение 14 сут привело к существенной задержке прироста массы тела животных всех опытных групп по сравнению с животными 7-й группы, получавшими ОВР (р<0,05 для 1-6-й групп). Введение НЧ ZnO и раствора ZnSO4 в дозе 0,4 мг/кг крысам 2-й и 3-й группы на протяжении последующих 35 дней не приводило у них к нормализации темпов роста. Прирост массы тела животных за все 49 дней эксперимента во 2-й группе, получавшей НЧ, и в 3-й группе, получавшей соль Zn, недостоверно отличался от прироста массы тела животных 1-й группы с недостаточностью Zn, составившей 68,5±11,5%. За то же время прирост массы тела крыс, потреблявших ОВР (7-я группа), составил 232±8% (р<0,001 в сравнении с 1-3-й группами). В конце эксперимента у крыс 1-3-й групп отмечались достоверное (р<0,05) снижение относительной массы всех изученных внутренних органов в сравнении с 7-й группой. Активность ЩФ составила в этих группах соответственно 1,40±0,15; 1,19±0,32 и 1,01±0,29 против 3,44±0,56 мкмоль/мин/см3 в 7-й группе; содержание Zn в бедренной кости - 51,2±2,3, 57,3±1,8 и 64,4±3,6 против 99,2±6,5 мг в 7-й группе (р<0,001 при сравнении 7-й группы с 1-3-й группами; р>0,05 при попарных сравнениях 1-3-й групп по обоим показателям). Всего за 49 дней эксперимента в 1-й группе погибло 5 (50%) крыс, во 2-й группе - 4 (40%) и в 3-й - 3 (30%) крысы.

В совокупности полученные данные позволяют заключить, что доза Zn 0,4 мг/кг массы тела в форме как НЧ, так и соли была неадекватно мала для крыс на фоне потребления данного вида корма и не позволила восстановить статус Zn. Ввиду этого во 2-й серии экспериментов доза обеих форм Zn была увеличена до 13 мг на 1 кг массы тела.

Как следует из данных табл. 1, в результате 14-суточного введения НЧ ZnO и ZnSO4 крысам 5-й и 6-й групп их масса тела возрастала практически одинаково и достоверно (р<0,001) быстрее, чем у животных 4-й группы, продолжавших испытывать недостаточность Zn. На рисунке представлена репрезентативная фотография крыс из 4-й (недостаточность Zn) и 5-й (получавших НЧ ZnO) групп. Наблюдаемые клинические проявления (отставание в росте, нарушение пропорций тела, дерматит) полностью устранялись у всех животных 5-й и 6-й групп в результате 2-недельного введения НЧ.

Как следует из данных табл. 2, относительная масса некоторых органов (почки, семенники, легкие) у животных 4-й группы достоверно отличалась от соответствующих значений для животных 5-й и 6-й групп. Вместе с тем различий между животными 2 последних групп, получавшими разные источники Zn, ни по одному из параметров не выявлено.

Крысы одного возраста: вверху - из 1-й группы (дефицит цинка), внизу - из 2-й группы (восстановление с помощью наночастиц ZnO)

В обеих группах животных, получавших добавки Zn (5-я и 6-я группы), величина всасывания ОВА в кишечнике составила соответственно 0,25±0,05 и 0,45±0,09%Ч103 от введенной дозы и была в среднем ниже, чем у животных с недостаточностью Zn (4-я группа) - 0,88±0,38% (различие на уровне тенденции, р>0,1). При сравнении животных 5-й и 6-й групп данный показатель достоверно не различался. Таким образом, введение крысам НЧ ZnO не вызывает усиленного проникновения во внутреннюю среду организма из желудочнокишечного тракта макромолекул белка, в отличие от того, что было установлено ранее для НЧ диоксида титана [9].

Данные, представленные в табл. 3, показывают, что у животных 4-й группы содержание Zn в бедренной кости было значительно и достоверно ниже, чем в 5-й и 6-й группах, что является объективным критерием его недостаточности [1, 10, 13]. При этом у животных 5-й и 6-й групп содержание Zn в кости практически не различалось. Определение активности ЩФ (см. табл. 3) также показало, что статус Zn, нарушенный у животных 4-й группы, эффективно и приблизительно в равной степени нормализуется у крыс 5-й и 6-й групп, получающих добавку Zn.

Как следует из данных табл. 4, общее количество эритроцитов, концентрация Hb, показатель гематокрита и средняя концентрация Hb в эритроците у животных 4-й группы была достоверно выше, чем в 5-й и 6-й группах. Напротив, средний объем эритроцита у крыс 4-й группы был достоверно ниже, чем в 5-й и 6-й группах. Наименее вариабельным из представленных в таблице показателей оказалось среднее содержание Hb в эритроците, однако в этом случае отмечена тенденция к снижению его в 4-й группы по сравнению с таковым в 5-й и 6-й группах. Различия между животными 5-ф-й и 6-й групп по всем перечисленным показателям минимальны и недостоверны.

Результаты исследования лейкоцитарной формулы (табл. 5.) показали, что в крови крыс 4-й группы повышается относительное число нейтрофилов, а также понижается число лимфоцитов по сравнению с показателями в 5-й и 6-й группах. Для общего числа лейкоцитов, относительного содержания моноцитов и эозинофилов различия не выявлены. Анализ состояния тромбоцитов (табл. 6) продемонстрировал достоверное отличие животных 4-й группы от крыс, получавших Zn, по среднему объему тромбоцитов, а у животных 6-й группы - и по общему количеству тромбоцитов. Различия по всем представленным в табл. 6 показателями между животные 5-й и 6-й групп оказались недостоверными.

Данные о состоянии апоптоза гепатоцитов, представленные в табл. 7, свидетельствуют о существенных отклонениях, наблюдаемых у животных 4-й группы (недостаточность Zn), в сравнении с крысами, получавшими добавки Zn. Так, у животных 4-й группы было достоверно уменьшено число живых клеток (AnV-FITC-/7-AAD-), повышена численность клеток, находящихся в раннем апоптозе (AnV-FITC+/7-AAD-), общее число клеток, находящихся в апоптозе (AnV-FITC+/7-AAD+), и мертвых клеток (AnV-FITC-/7-AAD+), в последнем случае - на уровне тенденции. Животные 5-й и 6-й групп, получавшие обе добавки Zn, по всем этим показателям не различались.

Изучение иммунологического статуса показало, что у крыс 4-й группы относительное содержание CD3+ Т-лимфоцитов достоверно понижено по сравнению с таковым у крыс 5-й и 6-й групп. Остальные изученные показатели изменялись недостоверно.

Таблица 1. Абсолютная и относительная масса тела крыс 4-6-й групп на 28-й день эксперимента, прирост массы тела (M±m)

Таблица 2. Относительная масса внутренних органов крыс опытных групп (M±m)

Таблица 3. Показатели, характеризующие обеспеченность цинком животных (M±m)

Таблица 4. Показатели, характеризующие состояние красной крови у крыс опытных групп (М±m)

Таблица 5. Показатели, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс опытных групп (M±m)

Полученные в настоящем исследовании данные показывают, что НЧ ZnO позволяет восстанавливать статус Zn, нарушенный при потреблении цинкдефицитного рациона, не менее эффективно, чем традиционная форма этого микроэлемента - неорганическая соль ZnSO4, используемая, в частности, при обогащении специализированных продуктов для энтерального питания и заменителей женского молока [6]. При этом прием крысами НЧ ZnO в дозе 13 мг/кг не вызывает каких-либо неблагоприятных изменений исследованных показателей по сравнению с таковыми у животных, получавших традиционную форму этого микроэлемента, причем острая токсичность НЧ ZnO значительно меньше, чем у неорганической соли Zn. Перспективы использования НЧ ZnO в качестве пищевого источника Zn могут быть рассмотрены после проведения их токсикологической характеристики в длительном эксперименте.

Таблица 6. Показатели, характеризующие состояние тромбоцитов у крыс опытных групп (M±m)

Таблица 7. Показатели, характеризующие состояние апоптоза гепатоцитов у крыс опытных групп (M±m, %)

Литература

1. Баяржаргал М., Мазо В.К., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2007. - Т. 5, № 2. - С. 11-14.

2. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

3. Конь И.Я., Копытько М.В., Алешко-Ожевский Ю.П. и др. // Гиг. и сан. - 2001. - № 1. - С. 54-57.

4. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В. и др. // Вопр. питания. - 2002. - № 3. - С. 46-51.

5. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В. и др. // Вопр. питания. - 2002. - № 3. - С. 38-43.

6. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые источники эссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. - М.: Миклош, 2009. - 208 с.

7. Методические указания МУ 1.2.2520-09. Токсикологогигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

8. Микроэлементозы человека / Ред. А.П., Авцын А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова - М.: Медицина, 1991. - 496 с.

9. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

10. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

11. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 340 с.

12. Скальный А.В. Распространенность микроэлементозов у детей в различных регионов в России. Вторая Российская школа "Геохимическая экология и биохимическое районирование биосферы". - М., 1999. - С. 209-211.

13. Sun H., Zhang X., Zhang Z. et al. // Environ. Pollut. - 2009. - Vol. 157, N 4. - P. 1165-1170.