Оптимизация методов контроля пищевых продуктов на основе создания дифференциально-диагностических сред для выделения и культивирования бактерий рода Campylobacter

Резюме

Проведены скрининговые исследования по выделению кампилобактерий из про­дуктов, полуфабрикатов и объектов внешней среды предприятий птицеперера­батывающей промышленности. Наиболее высокий уровень обнаружения возбу­дителей кампилобактериоза установлен для сырых птицепродуктов, включая тушки цыплят-бройлеров, индеек, перепелов и производимых из них полуфабри­катов. Выявлена общая закономерность попадания кампилобактеров в сырье и пищевые продукты при недостаточной эффективности санитарной обра­ботки отдельных участков производства: в большинстве случаев Campylobacter spp. выделяли из образцов, обсемененных колиформными бактериями и саль­монеллами. Показано, что частота контаминации сырых птицепродуктов патогенами в значительной мере зависит от технологии охлаждения тушек. При использовании погружного способа создаются условия для перекрестной контаминации патогенами через воду в ваннах охлаждения (45% проб, зара­женных Campylobacter spp.). При комбинированном использовании переохлаж­денной воды и гидроаэрозолей кампилобактерии также выявляли достаточно часто - в 27% проб. Контаминация патогенами была наименьшей при испари­тельном способе охлаждения с использованием антимикробных гидроаэрозолей (<5% положительных проб), что позволяет признать его наиболее перспектив­ным для производства безопасной в микробиологическом отношении продукции. Проведена работа по оптимизации состава питательных сред и адаптации рекомендуемых методических схем анализа для выявления и видовой идентифи­кации бактерий рода Campylobacter. Модифицированы рецептуры традиционно используемых питательных сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов в соот­ветствии с требованиями действующих стандартов. Учитывая актуальность повышения эффективности методов контроля бактерий рода Campylobacter и отсутствие в Российской Федерации необходимого набора отечественных аналогов питательных сред, разработан оптимизированный способ производства сухих питательных сред для выяв­ления, идентификации и хранения кампилобактерий, выделенных из пищевой продукции и клинического материала. Проведенные исследования позволили разработать Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 "Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacters и "Инструкцию по применению питательных сред". В зави­симости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp.; полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. В перечень критериев оценки качества серийно выпускаемых партий сухих сред включены растворимость, рН, прочность агарового геля, содержание аминного азота, специфичность, селективность, ростовые и ингибирующие свойства. Практическое применение этих сред в условиях отечественных лабораторий позволит существенно упростить использование действующих ГОСТов, раз­работанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерчес­ких сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий.

Ключевые слова:бактерии рода Campylobacter, питательные среды, пищевая продукция, методы контроля, хранение штаммов

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 5. С. 34-41. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00074.

Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов должно базироваться на пос­тоянном совершенствовании требований к проведению контроля и на повышении надежности используемых методов лабораторного анализа, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффек­тивных питательных сред для выявления и иденти­фикации наиболее значимых групп микроорганизмов. Внедрение в практику новых методов, основанных на современных научных технологиях, даст возможность осуществлять мониторинг загрязненности пищевых продуктов возбудителями пищевых инфекций и интен­сифицировать применение методологии оценки микро­биологического риска.

Бактерии рода Campylobacter, занимающие в насто­ящее время одно из ведущих мест в этиологии инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи [1], относятся к числу наиболее трудно культивируемых микроорганизмов, а потому их детекция требует исполь­зования комплексного анализа фено- и генотипических признаков, определяющих ключевые таксономические и патогенетические свойства этих патогенов.

Независимо от применяемых схем выделения и иден­тификации Campylobacter spp, используемые методы должны включать эффективные и достоверные способы отбора и подготовки проб для анализа, что представля­ется весьма важным в плане интерпретации полученных результатов. Эти способы включают выбор контрольных критических точек, поскольку убиквитарность, термо­толерантность и вариабельность штаммов кампилобактеров исключительно благоприятны для сохранения микробных популяций в процессе изготовления и хранения продуктов пищевой индустрии. Принципиально важен для выделения этих патогенов выбор адекватных схем обогащения исследуемых образцов, обеспечива­ющих накопление возбудителя до уровня достоверной детекции.

В лабораторной диагностике кампилобактериоза на­иболее трудной задачей является выделение возбуди­теля из пищевых продуктов в связи с массивной конта­минацией их сопутствующей микрофлорой. На общем микробном фоне исследуемого субстрата количество па­тогенов, как правило, незначительно, поэтому их прямое культивирование невозможно, в связи с чем возникает необходимость применения специальных селективных методов обогащения для выделения и идентификации возбудителя. С этой целью используется целая гамма разнообразных избирательных питательных сред, се­лективных агентов и аналитических средств, учитыва­ющих основные культурально-морфологические и био­логические свойства выделяемого микроорганизма [2]. Способность кампилобактерий переходить под влиянием стрессовых воздействий в некультивируемые формы создает особенно трудные методические проблемы для получения объективной оценки степени контаминации продукции и адекватного прогнозирования пригодности используемых схем контроля.

В сравнении с другими пищевыми патогенами, такими как энтерогеморрагические E. coli или сальмонеллы, C. jejuni более чувствительны к неблагоприятным усло­виям внешней среды. Для роста им необходим опреде­ленный набор нутриентов, обеспечивающий заданный окислительно-восстановительный потенциал среды, и специальные микроаэрофильные условия с опти­мальной температурой культивирования возбудителя не ниже 30 оС. Такие избирательные свойства теоре­тически не должны позволять C. jejuni выживать вне организма хозяина в природных аэробных условиях или в пищевой цепи. Однако в реальных условиях эти мик­роорганизмы активно персистируют во внешней среде и обнаруживаются в продуктах, воде или других объек­тах [3-5]. Механизм такого выживания и последующей перекрестной контаминации C. jejuni изучен недоста­точно и требует проведения детальных исследований с целью снижения риска возникновения пищевых забо­леваний, связанных с употреблением зараженных про­дуктов, особенно куриного мяса, поскольку его удель­ный вес в структуре питания населения очень велик. В связи с изложенным целями исследования были:

- изучение контаминации возбудителями кампилобактериоза пищевых продуктов, полученных на пти­цеперерабатывающих предприятиях при различных технологиях обработки сырья;

- оптимизация рекомендуемых методических схем выявления и видовой идентификации бактерий рода Campylobacter;

- повышение чувствительности и специфичности ана­лизов с целью стандартизации их по отношению к официально утвержденным нормативным и мето­дическим документам.

Материал и методы

Всего исследовано свыше 300 проб мяса птицы и по­луфабрикатов (от цыплят-бройлеров, индеек и перепе­лов). На наличие Campylobacter spp. также исследовали смывы с оборудования предприятий.

Исследования птицепродуктов и смывов с поверх­ностей оборудования проводили в условиях трех оте­чественных птицеперерабатывающих предприятий, применяющих охлаждение тушек погружением в пере­охлажденную воду, а также комбинированным водно-испарительным и гидроаэрозольным способами. Для антимикробной обработки при всех вариантах исполь­зовали технологические вспомогательные средства на основе надуксусной кислоты.

В работе использовали как общепринятые куль-туральные методы посевов пищевых продуктов, так и вновь разрабатываемые или модифицированные спо­собы выделения и количественного учета возбудителей кампилобактериоза.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия призна­вали достоверными при уровне значимости р<0,05. Расчеты проводили с помощью пакетов программ Excel и SPSS 18.0.

Результаты и обсуждение

С целью накопления статистических материалов по загрязнению Campylobacter spp. различных видов сырья, готовых продуктов и полуфабрикатов, проведены ком­плексные исследования, позволяющие судить о харак­тере контаминации и распространении кампилобактеров на отдельных этапах производства птицепродуктов

Бактерии рода Campylobacter обнаруживали пре­имущественно в сырых птицепродуктах и смывах с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий (свыше 30% положительных проб). В боль­шинстве случаев кампилобактеры выделяли из образ­цов, обсемененных колиформными бактериями (свыше 60% проб) и сальмонеллами (17% проб).

Полученные данные показали, что частота контамина­ции сырых птицепродуктов сальмонеллами и кампилобактериями значимо зависит от технологии охлаждения тушек (табл. 1). При использовании погружного способа создаются условия для перекрестной контаминации па­тогенами через воду в ваннах охлаждения (45% проб, за­раженных Campylobacter spp.). При комбинированном ис­пользовании переохлажденной воды и гидроаэрозолей кампилобактерии также выявляли достаточно часто -в 27% проб. Наименьшее загрязнение патогенами было выявлено при испарительном способе охлаждения с использованием антимикробных гидроаэрозолей (менее 5% положительных проб), что позволяет признать его наиболее перспективным для производства безопас­ной в микробиологическом отношении продукции.

Получение таких данных необходимо для обоснования отраслевых критериев оценки эффективности техноло­гий производства птицепродуктов и разработки сани­тарно-гигиенических мероприятий по предупреждению контаминации мяса птицы патогенами в процессе убоя и первичной переработки [6]. Эти критерии вместе с ме­рами, направленными на ликвидацию патогенов в пти­цеводческом секторе, нужны для повышения гарантии безопасности сырых мясо- и птицепродуктов, направля­емых предприятиями в реализацию.

Традиционные микробиологические методы обнару­жения Campylobacter в пищевых продуктах основаны на применении селективных питательных сред и специ­альных условий культивирования бактерий. Основные принципы этих методов регламентированы междуна­родными стандартами ISO 10272-1:2006, ISO/TS 10272­2:2006 и Руководством по бактериологическим методам анализа FDA (США). В Российской Федерации для контроля пищевых продуктов и расследования вспышек инфекций кампилобактериозной этиологии применяют ГОСТ ISO 10272-1-2013, ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013, а также Методические указания 4.2.2321-08 "Методы определения бактерий рода Сampylobacter в пищевых продуктах".

Процедура выделения Campylobacter из образцов пи­щевых продуктов включает:

- предобогащение в селективном бульоне при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кис­лорода, 10% углекислого газа, 85% азота);

- обогащение в селективном бульоне в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;

- пересев на агаровые среды для выделения изолиро­ванных колоний, инкубирование в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.

Для повышения селективных свойств жидких и плот­ных питательных сред применяют антибиотики цефоперазон, тейкопланин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и др. в различных комбина­циях. Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализа­ции токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефибринированную баранью или лошадиную кровь. Поскольку ис­пользование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в насто­ящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия. Для создания микроаэрофильных условий используют различ­ные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы.

Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохи­мическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и каталазный тесты, нитрат/ нитрит-редукция, гидролиз гиппурата, ферментация уг­леводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др.

Применение регламентированных схем и методов де­текции при проведении экспериментальных исследова­ний по обнаружению возбудителей кампилобактериоза в пищевой продукции в 2015-2017 гг. позволило нако­пить и систематизировать данные о частоте выделения, характере контаминации и свойствах Campylobacter spp. [7]. Однако при выполнении запланированных работ были выявлены следующие методические проблемы:

- отсутствие отечественных аналогов зарубежных сред, селективных агентов и специальных компонентов, рекомендуемых для культивирования Campylobacter spp., что обусловливает необходимость конструиро­вания питательных сред, подбора и оценки качества серийно выпускаемых сырьевых ингредиентов, хими­ческих реагентов, буферных систем и др.;

- недостаточная эффективность используемых рос­товых веществ, ферментных систем и ингибиторных добавок, подавляющих рост сопутствующей микро­флоры, в первую очередь грамотрицательных бакте­рий рода Proteus;

- технические трудности обеспечения микроаэрофильных условий культивирования кампилобактеров при рутинном контроле сырья и пищевой продукции;

- отсутствие практических рекомендаций по под­держанию жизнеспособности выделенных культур Campylobacter spp. в процессе их изучения и при со­здании лабораторных коллекций (криобанков) этих микроорганизмов;

- дефицит отечественных аналитических средств и тест-систем для фенотипической и генетической идентификации выделяемых штаммов.

Вышеназванные недостатки лабораторной детекции Campylobacter spp. определили направления экспери­ментальных исследований и необходимость разработки новых подходов к отдельным этапам их практической реализации.

Существующие прототипы методов выявления кампилобактеров основаны на применении преимущественнозарубежных сред: на первых двух этапах предобогащения и обогащения посевов в качестве селективных бульонов регламентированы бульон Болтона, бульон Престона или селективные среды Дойла, Мартена или Парка. В их состав в качестве питательной основы входят мясной экстракт, ферментативные гидролизаты животных белков (мяса, казеина, лактальбумина). Для обеспечения толерантности к кислороду используют дефибринированную кровь или антиоксиданты. Для пересева на агаризованные среды используются селек­тивные агары Престона, Кармали или угольный агар, в основу которых также входят пептон, мясной экстракт и гидролизаты казеина, дефибринированная кровь, активированный древесный уголь и аэротолерантные добавки. Специальных способов хранения и транспор­тирования культур кампилобактеров не предлагается, тогда как общепринятые методики криохранения и лиофилизации не всегда пригодны для Campylobacter spp., требующих особых условий для сохранения жизнеспо­собности этих микроорганизмов.

Подбор питательных основ и отечественных компо­нентов в составе селективных сред и сравнительные испытания их при культивировании различных штаммов Campylobacter spp. позволили разработать рецептуры и сконструировать состав базовых сред для накопле­ния и выделения кампилобактерий. С целью обеспече­ния сохранности основных фенотипических признаков и поддержания жизнеспособности выделенных штам­мов разработана модифицированная среда - полу­жидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. (табл. 2).

Из широкого ассортимента селективных добавок, рекомендуемых действующими стандартами, отобраны для практического применения в комплекте с базовыми средами следующие дифференциально-диагностичес­кие компоненты (табл. 3).

Использование в составе питательной основы комп­лекса легко усвояемых азотистых веществ, полученных в результате гидролитического расщепления белков животного, растительного и микробного происхождениядо оптимальных концентраций аминного азота, обеспе­чивало заданный уровень нутритивных компонентов. Включение в рецептуры дрожжевого экстракта как источника биологически активных компонентов и стиму­ляторов роста в сочетании с метабисульфитом натрия, сульфатом железа и пируватом натрия способствовало улучшению ростовых свойств субстратов и снижению окислительного стресса. Внесение L-цистеина и аскор­биновой кислоты обеспечивало оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала среды.

С целью унификации лабораторных процедур подоб­ран комплекс антибактериальных препаратов (полимиксина В сульфат, рифампицин, амфотерицин В), эффек­тивно ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры как в накопительном бульоне, так и при пересевах на агаровую среду. Заданные концентрации антибиотиков в рецептурах предлагаемых сред обеспечивали подав­ление роста бактерий семейства Enterobacteriaceae, энтерококков, стафилококков, псевдомонад и протея при исходном уровне контаминации посторонней микро­флоры 102-104 КОЕ/см3.

Рекомендуемый для хранения штаммов Campylobacter spp. полужидкий питательный агар, содержащий 0,12% агара, 1,8% аминного азота и 15% глицерина, позволял сохранять жизнеспособность тест-штаммов при криохранении в условиях низких температур (-70±2) °С не менее 9 мес. Включение в состав полужидкого агара защитной аэротолерантной смеси (метабисульфит на­трия + сульфат железа + пируват натрия) способство­вало созданию улучшенных условий для поддержания физиологического статуса и ростовых свойств культур кампилобактеров (табл. 4). При этом основные фенотипические характеристики штаммов существенно не менялись и полностью восстанавливались после 2-3 пассажей в неселективной среде. Один из харак­терных признаков - подвижность - удавалось сохранить на протяжении длительного срока хранения - 9-12 мес.

Определение подвижности проводили, используя спо­собность штаммов формировать моноколонии на по­верхности 0,2% полужидкого агара при нанесении 5 мкл суспензии изолята. Посевы проводили в троекратной повторности. Различия признавали достоверными при p<0,05. Этот признак позволял судить о морфологичес­ких изменениях стареющих субпопуляций тестируемых штаммов, подтверждающих фенотипическую изменчи­вость выделенных культур под воздействием неблаго­приятных факторов (табл. 5).

В то же время криохранение штаммов при обычных условиях в глицериновом бульоне (15% глицерина + 85% бульона Престона) сопровождалось потерей под­вижности и инактивацией тестируемых культур C. jejuni после 2-3 мес наблюдений.

Учитывая сложный многокомпонентный состав суб­стратов для детекции кампилобактеров, с целью уп­рощения способа приготовления питательных сред и снижения трудоемкости баканализов разработан оп­тимизированный способ производства сухих питатель­ных сред для выявления, идентификации и хранения кампилобактерий. Утверждены Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 "Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter* и Инструк­ция по применению вышеуказанных сред при контроле пищевой продукции и клинического материала. В пере­чень критериев оценки качества серийно выпускаемых партий сухих сред включены основные физико-химичес­кие и биологические показатели, в том числе раствори­мость, рН, прочность агарового геля, содержание аминного азота, специфичность, селективность, ростовые и ингибирующие свойства (табл. 6).

Сравнительные квалификационные испытания опыт­ных серий сухих питательных сред в сопоставлении с зарубежными аналогами, зарегистрированными в Российской Федерации, показали их высокую чувст­вительность, воспроизводимость и практическую пригодность для проведения контроля различных объектов для выявления и количественного определения бакте­рий рода Campylobacter. В зависимости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделе­ния и количественного учета Campylobacter spp.; полу­жидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.

Заключение

С целью повышения эффективности выделения бактерий рода Campylobacter из различных объектов и оптимизации режимов хранения выделенных штам­мов были модифицированы рецептуры традиционно используемых питательных сред и подобран сбалан­сированный состав ростовых и селективных компо­нентов. Разработаны и утверждены Технические усло­вия 21.20.23-006-01897222-2016 "Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter". Практическое применение этих сред в условиях оте­чественных лабораторий позволит существенно уп­ростить использование действующих ГОСТов, раз­работанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерческих сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий.

Литература

1. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. URL: www.who.int

2. Ефимочкина Н.Р. Оценка роли бактерий рода Campylobacter в воз­никновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя // Вопр. питания. 2015. № 6. С. 5-18.

3. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бак­терий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. С. 24-29.

4. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 3. P. 237-257.

5. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M. et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: a sys­tematic review // Poult. Sci. 2010. Vol. 89. P. 1070-1084.

6. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Козак С.С., Минаева Л.П., Быко­ва И.Б., Пичугина Т.В. и др. Влияние традиционных технологий охлаждения на профиль патогенных микробных контаминантов мяса птицы отечественного производства // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 38.

7. Ефимочкина Н.Р., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Минаева Л.П., Пичугина Т.В., Маркова Ю.М. и др. Изучение характера конта­минации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 5. С. 52-59.