Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс

РезюмеПредставлены результаты сравнительной оценки влияния полусинтетического казеинового рациона (ПКР), традиционно применяемого для кормления экспериментальных животных в НИИ питания РАМН, и рациона AIN-93, предложенного Американским институтом питания, на рост и развитие крыс. В эксперименте длительностью 90 дней были использованы 60 крыс-самцов Вистар; животные были разделены на 2 группы: крысы 1-й группы получали ПКР, крысы 2-й группы - рацион AIN-93. Анализ полученных данных выявил некоторые различия между группами. Отмеченные различия интегральных, гематологических и биохимических показателей не выходили за рамки физиологических колебаний, характерных для крыс. На основании результатов проведенных исследований предложена новая формула рациона для лабораторных животных.

Ключевые слова:кормление лабораторных животных, полусинтетический казеиновый рацион, рацион AIN-93, физиологические потребности крыс

В экcпериментальных исследованиях in vivo, особенно связанных с изучением влияния алиментарных факторов, исключительно важным компонентом является формирование базового рациона, обеспечивающего адекватное поступление макро- и микронутриентов. Оптимизация и стандартизация базовых (контрольных) рационов для лабораторных животных представляет собой важную задачу и требует постоянного внимания [5, 31].

История развития принципов полноценного кормления экспериментальных животных насчитывает более 130 лет. Так, около 50 лет понадобилось, чтобы установить физиологические потребности лабораторных грызунов (крыс) в пищевых веществах и энергии [14, 17] и разработать рационы с соответствующей пищевой ценностью [22, 23]. Для повышения воспроизводимости научных результатов, получаемых в разных лабораториях, в середине 70-х годов ХХ в. американскими учеными были предложены несколько вариантов диет для биомедицинских исследований in vivo, в том числе - диета AIN-76, разработанная Американским институтом питания (American Institute of Nutrition, AIN) [12, 16]. В Институте питания АМН СССР также были созданы несколько вариантов базовых рационов, включающих казеин, маисовый крахмал, лярд, сухие пивные дрожжи, витамины А и D, смесь минеральных солей, - первые прототипы полусинтетического казеинового рациона (ПКР) [1-3, 6, 10, 11]. В дальнейшем состав рационов неоднократно пересматривался; последние модификации ПКР и AIN представлены версиями ПКР-07 (табл. 1, 2) и AIN-93 (табл. 3) [7, 30].

Анализ макро- и микронутриентного состава рационов ПКР и AIN-93, проведенный с учетом современных знаний о физиологических потребностях крыс (табл. 1-6), показал, что каждый из изучаемых рационов в целом удовлетворяет потребности животных [13]. Однако некоторые различия по содержанию белков, жиров и углеводов, а также по жирнокислотному и углеводному профилям, составу солевых смесей, обусловили необходимость сравнения этих рационов в длительном эксперименте и потреблении корма ad libitum.

Целью настоящей работы была сравнительная оценка влияния рационов ПКР и AIN-93 на рост и развитие крыс.

Таблица 1. Состав полусинтетического казеинового рациона

Таблица 2. Состав солевой смеси полусинтетического казеинового рациона

Материал и методы

Эксперимент, длившийся 90 дней, проводили на крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 90-110 г. Возраст животных в начале эксперимента составлял 35-40 дней. Крысы были произвольно разделены на 2 группы (по 30 особей в каждой); животные 1-й группы получали рацион ПКР; животные 2-й группы - рацион AIN-93. Химические составы рационов представлены в табл. 1, 3.

Таблица 3. Состав рациона AIN-93G

Таблица 4. Состав солевой смеси рациона AIN-93G

Крысы имели свободный доступ к корму и воде (ad libitum), содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в вентилируемом помещении, по 2 особи в клетке. В течение эксперимента велись наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Индивидуальную поедаемость корма оценивали в начале, середине и конце эксперимента - соответственно 10-15-й, 40-45-й и 85-90-й дни. Массу тела измеряли еженедельно, материал для исследований брали на 90-й день эксперимента.

Для оценки роста и развития крыс изучены интегральные, гематологические и биохимические показатели. Исследования интегральных показателей включали измерения массы тела, внутренних органов, а также белого жира в жировых депо (брыжеечном, забрюшинном, подкожно-паховом, эпидидимальном) - по [19].

Гематологические исследования включали определение концентрации гемоглобина (Hb), общего количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, величины гематокрита, тромбокритной величины, среднего содержания Hb в одном эритроците, средней концентрации Hb в одном эритроците, среднего объема одного эритроцита, среднего объема одного тромбоцита, дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы. Исследования выполнены с использованием гематологического анализатора "Coulter Aс-TТМ 5 diff OV" и реактивов фирмы "Beckman Coulter", США.

Динамика массы тела крыс (M±m), получавших экспериментальные рационы в течение 90 дней

Таблица 5. Элементный состав солевых смесей полусинтетического казеинового рациона и AIN-93

Таблица 6. Состав витаминных смесей полусинтетического казеинового рациона и AIN-93

Таблица 7. Поедаемость корма крысами на разных сроках эксперимента

Таблица 8. Масса жира в жировых депо крыс, получавших в течение 90 дней экспериментальные рационы

Таблица 9. Масса внутренних органов крыс, получавших в течение 90 дней экспериментальные рационы

Таблица 10. Гематологические показатели экспериментальных животных в конце эксперимента

Биохимические исследования сыворотки крови включали определение содержания общего белка, альбумина, глобулина, триглицеридов, общего билирубина, прямого билирубина, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, холестерина, микроэлементов (кальция, магния, железа, натрия, калия, фосфора, хлора), а также определение активности γ-глутамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы, α-амилазы, креатинфосфокиназы, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, липазы. Исследования выполнены с использованием автоматического биохимического анализатора "Konelab 20i" и реактивов фирмы "Thermo Fisher Scientific", США.

Результаты приведены в виде М±m и min-max, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка, min и max - соответственно минимальное и максимальное значение измеряемой величины, а также в долях (%) или абсолютных числах.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ SPSS 17.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помощью критерия Левена. Оценку достоверности различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметрический аналог для независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [9, 27].

Результаты и обсуждение

На протяжении эксперимента не отмечено гибели крыс. Общее состояние животных было удовлетворительным. По внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению и скорости роста животные обеих групп не различались. Еженедельный прирост массы тела соответствовал уровню прироста, характерному для данного вида и возраста животных (см. рисунок) [18, 21, 29]. Анализ распределений массы тела крыс в группах, выполненный с использованием χ2-критерия, указывает на однородность показателей; небольшая тенденция к повышению массы тела у крыс 2-й группы статистически недостоверна (р>0,05). Поедаемость корма крысами 2-й группы во все сроки эксперимента была выше, чем в 1-й (табл. 7): в начале эксперимента - на 10% (р<0,05), в середине - на 3% (р>0,05), в конце - на 5% (р<0,05), однако по количеству потребляемой с кормом энергии не выявлено значимых различий между группами, так как калорийность ПКР несколько выше, чем калорийность AIN-93 (табл. 1, 3).

Вместе с тем у животных 2-й группы отмечена устойчивая тенденция к отложению бо￿льшего количества жира, чем у крыс 1-й группы: абсолютная масса белого жира в подкожно-паховом, эпидидимальном, брыжеечном и забрюшинном жировых депо крыс AIN-группы была выше на 26, 17, 24 и 26% (р>0,05), чем у животных 1-й группы, относительная - на 27% (р>0,05), 17, 25 и 26% (р<0,05) соответственно (табл. 8). Суммарная масса жира в жировых депо крыс, получавших AIN-93, была на 23% (р<0,05) выше, чем у крыс 1-й группы, получавших ПКР.

Масса внутренних органов у животных обеих групп не имела значимых различий (табл. 9). Принимая во внимание, что в норме у крыс данного возраста масса паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка) колеблется в диапазоне 50-100%, сердца - 30-70%, легких - 40-85%, тимуса - 100-200%, масса секреторных органов (надпочечники, семенники, предстательная железа) - в диапазоне 100-200% [26], статистически однородная совокупность этих показателей в обследуемой выборке свидетельствует о высокой степени стандартизации исходной колонии крыс, а также условий роста и развития экспериментальных животных на протяжении всего срока исследования.

Таблица 11. Биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных в конце эксперимента

Таблица 12. Состав оптимизированного полусинтетического казеинового рациона (о-ПКР)

Анализ результатов гематологических исследований и биохимических исследований сыворотки крови (табл. 10, 11), выполненный с учетом референсных значений показателей у крыс Вистар [15, 25, 26, 31], не выявил отклонений от нормы: все изученные показатели находились в пределах физиологических колебаний, характерных для данного вида животных. Тем не менее при статистической обработке данных отмечены различия между группами: как видно из табл. 10, содержание тромбоцитов и тромбокритная величина у крыс 2-й группы были на 11 и 10% (р<0,05) ниже, чем у крыс 1-й группы. Как видно из табл. 11, содержание общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, глюкозы, холестерина в сыворотке крови крыс 2-й группы было соответственно на 4, 4, 9, 11, 8 и 16% ниже (р<0,05), чем у крыс 1-й группы, содержание кальция и железа - на 3 и 23% ниже, натрия - на 1% выше (р<0,05), активность щелочной фосфатазы - на 22% ниже, липазы - на 25% выше (р<0,05). Характер различий между группами в целом можно объяснить разным составом рационов. Так, например, прослеживается определенная корреляция между показателями азотистого обмена и уровнем белка в сыворотке крови животных с содержанием белка в рационе соответствующей группы, количества тромбоцитов в крови - с содержанием линоленовой кислоты в рационах (см. табл. 1, 3, 10, 11) [4, 8, 20, 24, 28]. Однако опыт предыдущих исследований показывает, что колебания гематологических и биохимических показателей могут быть весьма значительными и у животных, получавших идентичные по составу рационы [26].

Таким образом, результаты сравнительной оценки влияния рационов ПКР и AIN-93 на рост и развитие крыс не выявили биологически значимых систематических изменений изученных показателей, следовательно, в условиях длительных экспериментов и потребления корма ad libitum допустимо использование каждого из этих рационов. С учетом необходимости совершенствования методологии экспериментальных исследований, а также новых систематизированных сведений о биодоступности, физико-химических и технологических свойствах витаминных и солевых смесей, пересмотрена формула ПКР, используемого в НИИ питания РАМН. Оптимизированный синтетический рацион, включающий элементы ПКР и AIN-93 (табл. 12), может быть рекомендован для использования в исследованиях in vivo как наиболее современный, гармонизированный с международными подходами и соответствующий физиологическим потребностям крыс.

Литература

1. Волгарев М.Н. // Вопр. питания. - 1964. - Т. 23, № 2. - С. 35-41.

2. Волгарев М.Н. // Бюл. экспер. биол. - 1957. - Т. 44, № 12. - С. 108-112.

3. Динерман А.А. // Вопр. питания. - 1957. - Т. 16, № 1. - С. 36-43.

4. Жминченко В.М., Соколов А.И., Тарасова И.Б. и др. Питание и взаимосвязь между интенсивностями клеточного обновления и метаболизма внутренних органов крыс // Материалы Х Всерос конгр. диетологов и нутрициологов "Питание и здоровье". Москва, 1-3 дек. - М., 2008. - С. 34.

5. Каркищенко Н .Н. Основы биомоделирования. - М.: Изд-во ВПК, 2004. - 608 с.

6. Куликова Л .И. // Вопр. питания. - 1961. - Т. 20, № 6. - С. 58-62.

7. Медико-биологическая оценка безопасности генноинженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: Метод. указания МУ 2.3.2.2306-07. Утверждены постановлением Главного государственного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко № 80 от 30.11.2007 (зарегистрирован в Минюсте РФ, регистрационный № 11117).

8. Погожева А .В. Сердечно-сосудистые заболевания, диета и ПНЖК ω-3. - М., 2000. - 320 с.

9. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. - М.: Медиа-Сфера, 2006. - 21 с.

10. Фильчагин Н.М. // Вопр. питания. - 1959. - Т. 18, № 3. - С. 25-35.

11. Шарпенак А.Э., Шишова О.А., Горожанкина Л.А. и др. // Вопр. питания. - 1958. - Т. 17, № 4. - С. 30-34.

12. American Institute of Nutrition Report of the American Institute of Nutrition ad hoc committee on standards for nutritional studies // J. Nutr. - 1977. - Vol. 107, N 7. - P. 13 4 0 -13 4 8 .

13. Benevenca N., Calvert C., Eckhert C. et al. Nutrient Requirements of Laboratory Animals, Fourth Revised Edition. - Washington: National Academy Press, 1995. - 192 p.

14. Bernhart F.W., Tomarelli R.M. // J. Nutr. 1966. - Vol. 89, N 3. - P. 4 9 5 - 5 0 0 .

15. Boehm O., Zur B., Koch A. et al. // Biol. Chem. - 2007. - Vol. 388. - P. 547-554.

16. Clarke H.E., Coates M.E., Eva J.K. et al. Dietary Standards for Laboratory Animals: Report of the LAC Diets Advisory Committee // Lab. Anim. - 1977. - Vol. 11, N 1. - P. 1-28.

17. Cuthbertson W.F.J. // Proc. Nutr. Soc. - 1957. - Vol. 16, N 1. - P. 70-76.

18. Derelanko M.J., Hollinger M.A. Handbook of Toxicology. 2nd ed. - USA: CRC Press, 2001. - 1414 p.

19. DiGirolamo M, Fine J.B., Tagra K, Rossmanith R. et al. // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. 1460-1467.

20. Goodnight S.H., Harris W.S., Connor W.E. The effects of dietary omega-3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study // Blood. - 1981. - Vol. 58, N 5. - P. 880-855.

21. Hood R.D. Developmental and Reproductive Toxicology: A Practical Approach. 2nd ed. - USA: CRC Press, 2006. - 1168 p.

22. Hubbel R.B , Mendel L.B, Wakeman R.G. A new salt mixture for use in experimental diets // J. Nutr. - 1937. - Vol. 14, N 2. - P. 273-285.

23. Jones J.H., Foster C. // J. Nutr. - 1942. - Vol. 24, N 3. - P. 24 5 - 2 5 6 .

24. Kohn R.A., Dinneen M.M., Russek-Cohen E. // J. Anim. Sci. - 2005. - Vol. 83, N 4. - P. 879-889.

25. Krinke G.J., Bullock G.R., Bunton T. The Laboratory Rat (Handbook of Experimental Animals). - San Diego: Academic Press, 2000. - 756 p.

26. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wister rat. - Amsterdam: Elsevier/Norrth-Holland biochemical, 1981. - 358 p.

27. Norusis M.J. SPSS statistics 17.0 guide to data analysis. - Upper Saddle River: Prentice Hall, 2009. - 672 p.

28. Piche L.A., Mahadevappa V.G. // J. Nutr. - 1990. - Vol. 120, N 5. - P. 444-449.

29. Pullen A.H. // J. Anat. - 1976. - Vol. 121. - P. 371-383.

30. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. Jr. // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.

31. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington: Elsevier Academic Press, 2006. - 912 p.