Изучение связи генетического полиморфизма rs2228570 гена VDR c обеспеченностью витамином D у жителей российской Арктики

Резюме

Генетический фактор играет существенную роль в развитии состояния дефици­та пищевых веществ, в том числе и витаминов. В настоящее время установлена связь ряда генетических полиморфизмов с уровнем обеспеченности витамина­ми населения в разных регионах мира. Целью настоящей работы стало изучение обеспеченности витамином D населения Ямало-Ненецкого автономного округа РФ в зависимости от полиморфизма rs2228570 (Fokl) гена VDR. Группа обсле­дования включала 172 человека, среди них 133 женщины и 39 мужчин в возрасте от 20 до 75 лет. Генотипирование проводили с применением аллель-специфичной амплификации с детекцией результатов в режиме реального времени и исполь­зованием TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам дезоксирибонуклеиновой кислоты. Концентрацию 25-гидроксивитамина D [25(OH)D] в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом. Сниженный уро­вень 25(OH)D в крови (<20 нг/мл), свидетельствующий о выраженном дефиците витамина D, выявлен у 38,2% всех обследованных, причем в крови пришлого насе­ления региона он был статистически значимо ниже, чем у коренного населения. Результаты генотипирования показали наличие генетических особенностей у жителей Арктической зоны по сравнению с жителями европейской части РФ. У коренного населения этого региона частота встречаемости аллеля С rs2228570 гена VDR была выше, чем у пришлого: 71,1 против 50,0%, в то время как в европейской части России она составляет 57,8%. Содержание витамина D в крови всех обследованных - носителей аллеля С в гомозиготном состоянии было статистически значимо ниже, чем у носителей генотипа ТТ, а дефицит выявлялся в 2,3 раза чаще (48,4 против 21,1%, р<0,05). В группе коренного населения региона у носителей генотипа СС и СТ уровень витамина D был ста­тистически значимо ниже, чем у носителей ТТ-генотипа. Частота выявления дефицита этого витамина у гомозиготных носителей аллеля С (45,5%) была в 5,5 раза выше, чем среди носителей ТТ-генотипа (p<0,01), и в 1,6 раза выше, чем у носителей генотипа СТ (р>0,05). Таким образом, выявлена статистически значимая связь между наличием аллеля С полиморфизма rs2228570 гена VDR и дефицитом витамина D.

Ключевые слова:витамин D, сыворотка крови, ген рецептора витамина D (VDR), генетический полиморфизм rs2228570 (Fokl), Арктическая зона, Ямало-Ненецкий автономный округ

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 4. С. 77-84. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00062.

Внедрение геномных и постгеномных исследова­ний в практику здравоохранения показало, что значительную роль в развитии состояния дефицита пищевых веществ, в том числе витаминов, может играть генетический фактор, в частности носительство генетических полиморфизмов. Так, биологичес­кие эффекты витамина D осуществляются через вза­имодействие со специфическим рецептором, который кодируется геном рецептора витамина D, официальный символ VDR, местоположение 12q13.11. Активирован­ная витамином молекула этого рецептора взаимо­действует с активаторами и репрессорами, оказывая комплексное воздействие на процессы транскрипции генома. Белки, транскрипция которых модулирует­ся рецептором, вовлечены в процессы всасывания кальция и фосфора в кишечнике, транспорт каль­ция в костную ткань, иммуномодуляцию и другие процессы [1, 2].

В настоящее время выявлен целый ряд генетичес­ких полиморфизмов гена VDR, которые ассоциированы с уровнем в крови 25-гидроксихолекальциферола [25(OH)D], а также с различными метаболическими нарушениями. Характер и степень ассоциаций, частота встречаемости аллелей риска генетических полимор­физмов в значительной степени ассоциированы с расово-этническим происхождением обследуемых.

Полиморфизм rs2228570 расположен в экзоне 2 стар­тового кодона гена VDR, содержит 2 аллеля - C и T [3]. Изучение связи этого полиморфизма с обеспеченно­стью витамином D привело к неоднозначным резуль­татам. Так, выявлена его связь с уровнем 25(OH)D в крови в европейских популяциях (Великобритания) [4]. В клинике медицинского университета Тегерана по­казано, что этот полиморфизм связан с дефицитом витамина D у обследуемых лиц, страдающих сердечно­сосудистыми заболеваниями [5]. В то же время в группе канадских жителей не выявлено связи полиморфизма rs2228570 гена VDR c уровнем 25(OH)D в крови [6]. В ряде работ показана связь полиморфизма со сниже­нием минеральной плотности костной ткани [7]. Обследование населения азиатского происхождения выявило ассоциацию этого полиморфизма с риском развития сахарного диабета 1 типа [8].

Цель настоящей работы - изучение обеспеченности витамином D населения Ямало-Ненецкого автономного округа РФ в зависимости от полиморфизма rs2228570 (Fokl) гена VDR.

Материал и методы

Генотипирование было проведено у 172 человек, проживающих на территории Арктической зоны РФ (Ямало-Ненецкий автономный округ), среди них 133 жен­щины и 39 мужчин в возрасте от 20 до 75 лет. Корен­ное население Арктической зоны среди обследованных составило 81%.

Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из буккального эпителия стандартным методом, с исполь­зованием многокомпонентного лизирующего раствора, разрушающего комплекс ДНК с белком, затем ее сорби­ровали на покрытые силикагелем магнитные частицы, осуществляли отмывку спиртом и на конечном этапе элюцию в буферный раствор. ДНК выделяли с использо­ванием набора реагентов "РеалБест ДНК-экстракция 3" (ЗАО "Вектор-Бест", РФ) на автоматической станции epMotion 5075 ("Eppendorf", Германия). Генотипирование проводили с применением аллель-специфичной ампли­фикации с детекцией результатов в режиме реального времени и использованием TaqMan-зондов, комплемен­тарных полиморфным участкам ДНК, c использованием реагентов ("Синтол", Россия). Для проведения ампли­фикации использовали амплификатор "CFX96 Real Time System" ("Bio-Rad", США).

Обеспеченность витаминами оценивали по их уровню в сыворотке крови, взятой натощак из локтевой вены. Концентрацию витамина А (ретинола) определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хромато­графии [9], витамина В2 (рибофлавина) - флуориметрически с использованием рибофлавинсвязывающего апобелка [10], 25-гидроксивитамина D 25(ОН)D - иммуноферментным методом с использованием наборов "25-Hydroxy Vitamin D EIA" ("lmmunodiagnotic Systems Ltd", Великобритания).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием системы PASW Statistics 20. Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом Пирсона χ2 проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия), https://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования полиморфизма rs2228570 гена VDR у обследуемых, проживающих в Арктической зоне РФ (Ямало-Ненецкий автономный округ), показали, что частота встречаемости аллеля С в 2 раза превы­шает частоту выявления аллеля Т, при этом генотип СС был выявлен почти у половины обследованных, СТ -чуть более чем у 1/3, а генотип ТТ - у каждого 7-го об­следованного (табл. 1). При оценке распределения ге­нотипов и частоты аллелей этого полиморфизма по гендерному признаку была выявлена более высокая частота встречаемости (на 11,3%) минорного аллеля (Т) у женщин, однако эта разница не достигала уровня статистической значимости: OR=1,72; CI (0,97-3,06) при р=0,06.

Анализ результатов генотипирования отдельно корен­ного и пришлого населения Ямало-Ненецкого автоном­ного округа выявил статистически значимые различия. Частота встречаемости минорного аллеля (Т) была на 21,1% выше у пришлого населения этого региона по сравнению с частотой у коренных жителей: OR=2,46; CI (1,44-4,18) при р=0,0007. Эти данные подтверждают вывод о зависимости частоты встречаемости поли­морфных вариантов гена VDR от этнической прина­длежности обследуемых и региона проживания.

Частота встречаемости аллеля С в группе пришлого населения (50,0%) согласуется с данными, полученными ранее у русского населения Европейской части РФ, где она составила 57,8%, в Республике Коми - 52,3%, в европейских популяциях - 52,5% [11, 12]. При обсле­довании африканского и азиатского населения выяв­лена более высокая частота встречаемости аллеля С: 83,3 и 64,6% соответственно. В отдельных странах час­тота встречаемости аллеля С полиморфизма rs2228570 гена VDR составила 68,5 (Великобритания), 66,5 (Фран­ция), 68,5 (Япония), 77,0% (Индия), что несколько пре­вышает этот показатель в Российской Федерации и европейской популяции в целом [13]. У коренного населения Ямало-Ненецкого автономного округа час­тота встречаемости аллеля С близка с аналогичному показателю в Японии и Индии и составляет 71,1% (см. табл. 1).

Результаты определения витамина D показали, что сниженный уровень 25(ОН)D в крови (<20 нг/мл) имел место у 35,2% всех обследованных жителей Ямало-Не­нецкого автономного округа. Причем уровень в крови у пришлого населения региона был статистически зна­чимо ниже, чем у коренного населения (табл. 2). Концен­трация ретинола в сыворотке крови женщин была ниже соответствующего показателя у мужчин, у коренного населения ниже, чем у пришлого.

В ходе дальнейших исследований была проведена оценка связи полиморфизма rs2228570 гена VDR с обес­печенностью витамином D у обследуемых изучаемого региона Арктической зоны РФ по типу "случай-конт­роль". Все обследованные были разделены на 2 группы: 1-я - с уровнем в сыворотке крови 25(ОН)D <20 нг/мл (дефицит витамина D - случай) и группа с содержанием 25(ОН)D≥20 нг/л (контроль). Во второй серии исследо­ваний такое же деление обследуемых было проведено в группах, состоящих только из коренных жителей и только из пришлого населения. Анализ результатовгенотипирования выявил статистически значимую связь между дефицитом витамина D и наличием аллеля С по­лиморфизма rs2228570 гена VDR у всех обследованных, а также отдельно у коренного населения (табл. 3). В то же время для пришлого населения этого региона выяв­ленная положительная ассоциация дефицита витамина D с аллелем С не достигла статистически достоверной значимости OR=1,97; CI (0,62-6,23) при р=0,24.

Определение уровня витамина D в зависимости от ге­нотипа полиморфизма rs2228570 гена VDR подтвердило ассоциацию аллеля С с дефицитом витамина D. Содержа­ние витамина D в крови всех обследованных носителей аллеля С в гомозиготном состоянии было статистически значимо ниже, чем у носителей генотипа ТТ (табл. 4), а дефицит выявлялся в 2,3 раза чаще (48,4 против 21,1%, р<0,05). На рисунке представлено распределение концентрации 25(ОН)D в сыворотке крови в зависи­мости от генотипа. Если у половины обследованных -носителей генотипа СС уровень в крови не превышал 20 нг/мл, то у носителей генотипа ТТ медиана составила 30,6 нг/мл. Носители гетерозиготного генотипа по концентрации этого витамина заняли промежуточное положение (Ме=24,2 нг/мл).

В силу недостаточного количества мужчин - носите­лей генотипа ТТ выявить зависимость уровня витамина D от генотипа не удалось, а у женщин снижение показа­теля обеспеченности холекальциферолом не достигало уровня статистической значимости (см. табл. 4). Дефи­цит витамина D у женщин - носителей генотипа СС вы­являлся в 2,0 раза чаще (42,9 против 21,1%, р<0,05).

В группе коренного населения региона у носителей ге­нотипов СС и СТ уровень витамина D был статистически значимо ниже, чем у носителей ТТ-генотипа. Частота выявления дефицита этого витамина у гомозиготных носителей аллеля С (45,5%) была в 5,5 раза выше, чем среди носителей ТТ-генотипа (р<0,01), и в 1,6 раза выше, чем у носителей генотипа СТ >0,05), что также подтверждает связь аллеля С со сниженным уровнем 25(ОН)D в крови у коренного населения. В то же время в силу небольшого количества обследованных лиц, у пришлого населения уровень витамина D у носите­лей аллеля С как в гомозиготном, так и в гетерозигот­ном состоянии статистически достоверно не отличался от показателя у носителей генотипа ТТ (см. табл. 4).

Необходимым условием осуществления витамином D своих функций является адекватная обеспеченность организма человека всеми витаминами, учас­твующими в образовании гормонально активной формы витамина D. Аскорбиновая кислота участ­вует в процессе гидроксилирования витамина D с образованием 25(ОН)D, коферментные формы ви­тамина В2 входят в состав активного центра флавопротеиновых монооксигеназ, осуществляющих гидроксилирование витамина D при его превращении в гормонально активную форму 1,25(ОН)D [14]. Этот активный метаболит витамина D взаимодействует с ядерным рецептором витамина D, который связы­вает Х-рецептор ретиноевой кислоты с образованием гетеродимерного комплекса, который присоединяется к специфическим последовательностям нуклеотидов в ДНК. После связывания к этому комплексу присо­единяются различные транскрипционные факторы, что приводит к повышению или к понижению генной активности [15].

В связи с этим у обследованных был определен уровень ретинола и рибофлавина в сыворотке крови. Ассоциации концентрации этих витаминов с носительством генотипа полиморфизма rs2228570 гена VDR не выявлено (см. табл. 4). В отличие от других регионов сниженный уровень витамина А у населения Аркти­ческой зоны обнаруживался гораздо чаще - у 19,9% против обычно выявляемого у 0-8% [15-19]. Дефицит витамина В2 выявлялся у 33,3% лиц. Примерно такая же обеспеченность витамином В2 характерна для дру­гих регионов страны [15-19].

Заключение

Результаты определения уровня 25(OH)D в сыворотке крови показали недостаточную обеспеченность этимвитамином населения Ямало-Ненецкого автономного округа. Выраженный дефицит витамина D [уровень 25(ОН)D в крови <20 нг/мл] выявлен у 38,2% обследо­ванных жителей.

Результаты генотипирования показали наличие ге­нетических особенностей у жителей этого региона РФ по сравнению с жителями Европейской части. У коренного населения этого региона частота встре­чаемости аллеля С rs2228570 гена VDR была выше, чем у пришлого населения, и составила 71,1%, в то время как в европейской части России она составляет 57,8%.

Анализ результатов генотипирования выявил статисти­чески значимую связь между аллелем С полиморфизма rs2228570 гена VDR и дефицитом витамина D. Аналогич­ная ассоциация между наличием доминантного аллеля Т и уровнем витамина D была обнаружена при обследова­нии других групп здоровых и больных лиц [20-24].

Литература

1. Arai H. A vitamin D receptor gene polymorphism in the translation initiation codon: effect on protein activity and relation to bone min­eral density in Japanese women // J. Bone Miner. Res. 1997. Vol. 12. P. 915-921.

2. Haussler M.R., Jurutka P.W. Vitamin D receptor (VDR)-mediated actions of 1alpha, 25(OH)(2)vitamin D(3): Genomic and non-genomic mechanisms // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Vol. 25, N 4. P. 543-559.

3. Kilic S., Silan F., Hiz M.M., Isik S. et al. Vitamin D receptor gene BSMI, FOKI, APAI, and TAQI polymorphisms and the risk of atopic dermatitis // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2016. Vol. 26, N 2. P. 106-110. doi: 10.18176/jiaci.0020.

4. Gilbert R., Bonilla C., Metcalfe C., Lewis S. et al. Associations of vitamin D pathway genes with circulating 25-hydroxyvitamin-D, 1,25-dihydroxyvitamin-D, and prostate cancer: a nested case-con­trol study // Cancer Causes Control. 2015. Vol. 26. P. 205-218.

5. Hossein-Nezhad A., Eshaghi S.M., Maghbooli Z., Mirzaei K. et al. The role of vitamin D deficiency and vitamin D receptor geno­types on the degree of collateralization in patients with sus­pected coronary artery disease // Biomed. Res. Int. 2014. Article ID 304250.

6. Larcombe L., Mookherjee N., Slater J., Slivinski C. et al. Vitamin D, serum 25(OH)D, LL-37 and polymorphisms in a Canadian First Nation population with endemic tuberculosis // Int. J. Circumpolar Health. 2015. Vol.74. Article ID 28952.

7. Jakubowska-Pietkiewicz E., Mlynarski W., Klich I., Fendler W. et al. Vitamin D receptor gene variability as a factor influencing bone mineral density in pediatric patients // Mol. Biol. Rep. 2012. Vol. 39, N 5. P. 6243-6250.

8. Wang G., Zhang Q., Xu N., Xu K. et al. Associations between Two Polymorphisms (FokI and BsmI) of Vitamin D Receptor Gene and Type 1 Diabetes Mellitus in Asian Population: A Meta-Analysis //PLoS One. 2014. Vol. 9, N 3. Article ID e89325. doi: 10.1371/journal. pone.0089325.

9. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1993. № 1. С. 43-48.

10. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Сравнение флуоресцентных методов определения витамина В2 в крови // Вопр. питания. 1991. 4. С. 67-72.

11. Lins Т.С., Vieira R.G., Grattapaglia D., Pereira R.W. Population analysis of vitamin D receptor polymorphisms and the role of genetic ancestry in an admixed population // Genet. Mol. Biol. 2011 .Vol. 34, N 3. P. 377-385.

12. Козлов А.И., Вершубская Г.Г., Негашева М.А. Полиморфизм гена ре­цептора витамина D (VDR) в выборках населения Европейской Рос­сии и Приуралья // Перм. мед. журн. 2016. Т. XXXIII, 5. P. 60-66.

13. Osman E., Anouti A.A., El Ghazali G., Haq A. et al. Frequency of rs731236 (Taql), rs2228570 (Fok1) of Vitamin-D Receptor (VDR) gene in Emirati healthy population // Meta Gene. 2015. Vol. 6. P. 49-52.

14. Спиричев В.Б., Громова О.А. Витамин D и его синергисты // Земский врач. 2012. 2. С. 33-38.

15. Hossein-Nezhad A., Spira A., Holick M.F. Influence of vitamin D status and vitamin D3 supplementation on genome wide expression of white blood cells: a randomized double-blind clinical trial // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 3. Article ID e58725.

16. Горбачев Д.О., Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Кошелева О.В. и др. Оценка витаминного статуса работников Самарской ТЭЦ по данным о поступлении витаминов с пищей и их уровню в крови // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 3. C. 71-81.

17. Бекетова Н.А., Погожева А.В., Коденцова В.М., Вржесинская О.А. и др. Витаминный статус жителей Московского региона // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 4. С. 61-67.

18. Бекетова Н.А., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Кошелева О.В. и др. Оценка витаминного статуса студентов московского вуза по данным о поступлении витаминов с пищей и их уровню в крови // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 64-75.

19. Бекетова Н.А., Морозова П.Н., Кошелева О.В., Вржесинская О.А. и др. Обеспеченность витаминами и характер питания работников металлургического производства (г. Нижний Новгород) // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 2. Прил. С. 84-85.

20. Karpinski M., Galicka A., Milewski R., Popko J. et al. Association between vitamin D receptor polymorphism and serum vitamin D levels in children with low-energy fractures // J. Am. Coll. Nutr. 2017. Vol. 36, N 1. P. 64-71. doi: 10.1080/07315724.2016.1218803.

21. Elhoseiny S.M., Morgan D.S., Rabie A.M., Bishay S.T. Vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms (FokI, BsmI) and their relation to vitamin D status in pediatrics beta thalassemia major // Indian J. Hematol. Blood Transfus. 2016. Vol. 32, N 2. P. 228-238. doi: 10.1007/s12288-015-0552-z.

22. Coskun S., Simsek S., Camkurt M.A., Cim A. et al. Association of polymorphisms in the vitamin D receptor gene and serum 25-hydroxyvitamin D levels in children with autism spectrum dis­order // Gene. 2016. Vol. 588, N 2. P. 109-114. doi: 10.1016/j.gene. 2016.05.004.

23. Zheng S.Z., Zhang D.G., Wu H., Jiang L.J. et al. The asso­ciation between vitamin D receptor polymorphisms and serum 25-hydroxyvitamin D levels with ulcerative colitis in Chinese Han population // Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2017. Vol. 41, N 1. P. 110-117. doi: 10.1016/j.clinre.2016.09.001.

24. Rasheed H., Hegazy R.A., Gawdat H.I., Mehaney D.A. et al. Serum vitamin D and vitamin D receptor gene polymorphism in myco­sis fungoides patients: a case control study // PLoS One. 2016. Vol. 11, N 6. Article ID e0158014. doi: 10.1371/journal.pone. 0158014.