Моделирование реакции меланоидинообразования in vitro на примере взаимодействия гидролизата белка куриного яйца и глюкозы

Резюме

Технологии производства пищевых продуктов, включающие тепловую обра­ботку, часто сопровождаются изменением их органолептических характерис­тик (цвета, вкуса и аромата) вследствие образования окрашенных веществ в результате реакции меланоидинообразования. В работе проведено модели­рование реакции меланоидинообразования in vitro (на примере взаимодействия гидролизата белка куриного яйца и глюкозы) для определения изменения содер­жания аминокислот в зависимости от условий протекания данной реакции. Белок куриного яйца (0,2 г) подвергали кислотному гидролизу в течение 24 ч при 80 °С, затем гидролизат нейтрализовали (vконеч=100 см3) и определяли в нем исходное содержание аминокислот. В каждую пробу к гидролизату (30 см3) добавляли глюкозу (15% раствор глюкозы в гидролизате). Исследовали влияние температуры (50, 70 и 90 °С), времени (10, 30 и 50 мин), рН среды (рН 2, 7 и 12) на содержание аминокислот в гидролизате в результате протека­ния реакции меланоидинообразования. Определение количества аминокис­лот производили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией с использованием о-фталевого альдегида.

B результате проведенных исследований по моделированию реакции меланоидинообразования были выявлены следующие закономерности: при увеличении температуры протекания реакции Майяра снижались концентрации GLU, SER, HIS, THR, ARG, ALA, CYS, VAL, MET, LEU, LYS. В то же время с увеличением продолжительности реакции наблюдалось увеличение концентрации SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU. Колебания концентрации аминокислот в реакционной среде при повышении температуры были характерны для ASP, GLY, TYR, PHE, ILE, а при увеличении времени проведения реакции - для ASP, GLU, HIS, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE, LYS. При прочих равных условиях наиболее полно процесс меланоидинообразования протекал в щелочной среде при рН 12. Таким образом, исследование влияния условий проведения эксперимента показало, что в про­цессе меланоидинообразования происходит снижение содержания некоторых аминокислот (в том числе незаменимых) и, следовательно, снижение пищевой ценности продукта. В результате протекания этой реакции теряется от 20 до 50% свободных аминокислот, причем с повышением температуры и увели­чением продолжительности нагревания эти потери возрастают. Полученные данные важно учитывать при разработке новых технологий пищевых продук­тов с максимальным сохранением их химического состава, пищевой ценности и потребительских свойств.

Ключевые слова:белок, аминокислоты, редуцирующие сахара, реакция Майяра, меланоидинообразование

Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 3. С. 92-100. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00050.

В процессе технологической тепловой обработки пищевых продуктов часто наблюдается изменение их органолептических характеристик (окраски, вкуса и аромата) вследствие образования окрашенных веществ в результате реакции так называемого процесса меланоидинообразования, взаимодействия редуцирую­щих сахаров и свободных аминокислот, реакции нефер­ментативного потемнения, впервые описанной француз­ским ученым Майяром в 1912 г. Данная реакция может проходить в продуктах животного и растительного про­исхождения, поскольку все они содержат определенное количество редуцирующих сахаров и свободных амино­кислот или они образуются в ходе технологического процесса [1-6].

Процесс меланоидинообразования оказывает опреде­ленное влияние на потребительские свойства и качес­тво пищевых продуктов, так как наряду с улучшением органолептических показателей [7-10] и образованием веществ, обладающих антиоксидантными свойствами [11-13], при этом наблюдается накопление токсичных веществ [14-16], снижение пищевой ценности вследс­твие расходования аминокислот. В связи с этим исследование данного химического превращения является важным аспектом создания инновационных пищевых продуктов.

Цель работы - моделирование реакции меланоидинообразования in vitro на примере взаимодействия гидролизата белка куриного яйца и глюкозы для определения изменения содержания аминокислот в зависимости от условий протекания данной реакции.

Материал и методы

Объектом исследования стал гидролизат белка ку­риного яйца, который получали следующим образом. Белок куриного яйца отделяли от желтка, отбирали 4 пробы по 0,2 г белка. К каждой пробе добавляли по 4 см3 6 н раствора HCl и проводили кислотный гид­ролиз в течение 24 ч при 80 °С. Далее каждую пробу разбавляли дистиллированной водой в мерной колбе объемом 100 см3. Затем гидролизат нейтрализовали 10 н раствором NaOH до рН 7, доводили объем до 100 см3. Отбирали 2 см3 гидролизата и фильтровали его через мембранный фильтр; далее определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хромато­графии (ВЭЖХ) исходное (начальное) содержание ами­нокислот.

По 30 см3 гидролизата отбирали в 3 конические колбы объемом 50 см3 для 3 опытов по одному из па­раметров моделируемой реакции: температуре (50, 70 и 90 °С) и времени (10, 30 и 50 мин). В каждую пробу к гидролизату добавляли по 4,5 г глюкозы для получе­ния 15% раствора глюкозы в гидролизате. Далее прово­дили реакцию меланоидинообразования при рН 7. При исследовании воздействия температуры на реакцию меланоидинообразования реакция продолжалась 30 мин, а при исследовании влияния времени ее проводили при 70 °С. После завершения реакции исследуемые рас­творы охлаждали до комнатной температуры, фильтро­вали через мембранный фильтр в виалы объемом по 2 см3. Подготовленные таким образом пробы анализи­ровали методом ВЭЖХ.

Определение количества аминокислот производили с помощью ВЭЖХ [17] с предколоночной дериватиза-цией с использованием о-фталевого альдегида. Сис­тема включала хроматограф Agilent 1200 ("Agilent", США), диодно-матричный детектор (DAD, G1315D) и аналитическую колонку 3,0x150 мм, 3,5 мкм (ZORBAX Eclipse-AAA). Условия проведения ВЭЖХ-анализа: тем­пература термостатов колонки - 40 °С, расход элюента - 0,4 мл/мин, длина волны детектирования УФ -338 нм. Для количественного определения был построен калибровочный график зависимости площади пика ами­нокислот от их концентрации. Для этого использовали стандартные растворы смеси аминокислот с концент­рациями 25, 100, 250 пмоль/мкл. Время удерживания аминокислот составило (RT), мин: аспартат (ASP) -2,5; глутамат (GLU) - 3,7; серин (SER) - 9,7; гистидин (HIS) - 11,1; глицин (GLY) - 11,6; треонин (THR) - 11,9; аргинин (ARG) - 13,1; аланин (ALA) - 13,6; тирозин (TYR) -15,2; цистин (CYS) - 17,0; валин (VAL) - 18,1; метионин (MET) - 18,4; фенилаланин (PHE) - 20,2; изолейцин (ILE) -20,5; лейцин (LEU) - 21,4; лизин (LYS) - 21,6.

Результаты и обсуждение

Общая схема образования меланоидинов представ­лена на рис. 1 [18-20]. Так, начальная реакция - кон­денсация карбонильной группы редуцирующего сахара (альдозы) со свободной аминогруппой белка или ами­нокислоты, с потерей молекулы воды и образованием N-замещенного глюкозамина (этап 1).

Глюкозамин нестабилен и подвергается перегруппи­ровке Амадори с формированием 1-амино-1-дезокси-2-кетозы (кетозамина) (этап 2). Продукты перегруп­пировки Амадори во второй фазе могут реагировать тремя путями. Один из них - дальнейшая дегидратация (потеря двух молекул воды) с образованием редуктонов и дегидроредуктонов (этап 3). Второй путь - об­разование короткоцепочечных продуктов гидролиза, таких как диацетил, ацетон, пировиноградный альдегид и т.д. (этап 4), которые далее с участием аминокислот подвергаются распаду по Стреккеру до альдегидов (этап 5) и альдольной конденсации, либо при отсутствии аминных соединений реагируют с образованием аль-долей и высокомолекулярных безазотистых полимеров (этап 6). Третий путь - через Шиффовы основания и фурфурол. При этом отщепляются 3 молекулы воды (этап 3), затем протекает реакция с участием амино­кислот и воды. Все продукты второй фазы реагируют далее с аминокислотами в третьей фазе с образова­нием азотистых полимеров и сополимеров, называемых меланоидинами, коричневого цвета (этап 7). Они имеют различный аромат: от горького (жженого, лукового, про­горклого, капустного) до приятного (солодовый, корки хлеба, карамели, кофе). Этап 8 иллюстрирует прямой путь расщепления глюкозамина, минуя стадию пере­группировки Амадори.

Стандартный меланоидин содержит гидроксильные, карбонильные и карбоксильные группировки, кратные и эфирные связи, а его молекулярная масса колеблется между двумя и тридцатью тысячами Да. Многие иссле­дователи, изучавшие реакцию Майара на различных примерах, выделили производные фурана, пиррола, пиридина, пиразина, карболина и других гетероцикли­ческих соединений [21].

Общая схема разложения аминокислот при реакции меланоидинообразования описывается последова­тельностью реакций по Стреккеру (рис. 2) [18-20].

В результате проведенных исследований по модели­рованию реакции меланоидинообразования были выяв­лены следующие особенности.

Влияние продолжительности реакции на процесс меланоидинообразования неоднозначно (см. таблицу). Для SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU с увеличением продолжи­тельности реакции с 10 до 50 мин концентрации аминокислот практически линейно возрастали. ASP и HIS харак­теризуются скачкообразным изменением концентрации с максимумом при продолжительности процесса 30 мин. Минимальные концентрации следующих аминокислот: GLU, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE и LYS были отме­чены при продолжительности реакции 30 мин.

При исследовании зависимости протекания реакции меланоидинообразования от концентрации глюкозы в растворе гидролизата белка с увеличением количест­ва глюкозы наблюдалось уменьшение концентраций аминокислот, причем для большинства аминокислот их концентрация уменьшалась плавно, практически линейно, и только для CYS имело место резкое паде­ние содержания, а в случае TYR концентрация сначала сильно уменьшалась, затем незначительно возрастала (рис. 3).

Подобная зависимость наблюдалась при исследова­нии влияния температуры на протекание реакции меланоидинообразования: реакция проходила уже при тем­пературе 30 °С, дальнейшее изменение температуры в диапазоне 50-90 °С практически не влияло на процесс меланоидинообразования (рис. 4).

При термической обработке происходит дальнейшая поликонденсация, а при температуре выше 400 °С образуются так называемые пиромеланоидиды. Меланоидины не расщепляются пищеварительными ферментами человека, и следовательно, они не усваи­ваются. Однако они могут образовывать комплексы с белками-ферментами, влияя на их каталитическую активность [21].

Важную роль в реакции меланоидинообразования играет термическая трансформация глюкозы. Так, глюкоза при нагревании в кислой среде до 100 °С способна превращаться в фурфурол или 5-гидроксиметилфур-фурол [21].

Известно, что 5-гидроксиметилфурфурол малоустой­чив и легко разлагается с образованием муравьиной и левулиновой кислот; при его конденсации также могут образовываться гуминовые вещества. Гуминовые ве­щества небольшой степени конденсации растворимы в воде и окрашивают продукт в желтый цвет [21].

Наиболее значительное влияние на аминокислотный состав пробы оказывает уровень рН среды, в которой протекает реакция (рис. 5).

Так, было установлено, что в кислой среде про­цесс меланоидинообразования замедлялся для всех исследуемых кислот. Наибольшая устойчивость к раз­рушению отмечена у CYS, наименьшая - у LYS. Также установлено значительное снижение концентраций ILE, LEU и PHE, их содержание было практически на одном уровне. Другие аминокислоты, такие как MET, ALA, THR, GLY, HIS, SER, GLU, ASP, имели близкое содержание, наиболее сохранились CYS и TYR.

Кривая зависимости концентрации аминокислот от рН среды имеет максимум в нейтральной среде (рН 7) для PHE и CYS. Так же как и в кислой среде, в наибольшей степени подверглась деградации аминокислота LYS, а наиболее устойчивой оказалась CYS. Концентрация аминокислот VAL и TYR снизилась незначительно.

В щелочной среде наиболее устойчивыми оказались ILE, MET, VAL, причем максимальную устойчивость проявили аминокислоты MET и ILE при рН 12, причем для ILE наблюдалось линейное снижение концентрации при переходе из щелочной среды в кислую. Сильной де­градации подверглись следующие аминокислоты: THR, HIS, GLY, SER, ASP, LYS, CYS, GLU. Относительно устой­чивыми оказались LEU, PHE, ARG, TYR, ALA.

В целом исследования показали, что при прочих рав­ных условиях эксперимента наиболее полно процесс меланоидинообразования протекал в щелочной среде при рН 12.

Анализ результатов исследований показывает, что процесс образования меланоидинов многостадиен, и на каждой стадии сахароаминной реакции могут образовываться побочные продукты. Чередующиеся кратные связи хиноидной системы стабилизируются, принимая ароматический характер гетероциклических соединений. Меланоидины способны окисляться и вос­станавливаться, причем первая реакция идет быстрее второй [21].

Наблюдаемое существенное снижение концентраций аминокислот в гидролизате белка куриного яйца, по-види­мому, связано с протеканием реакции меланоидинообразования и процессов термического разрушения аминокислот.

Кроме того, активность реакции меланоидинообра-зования во многих случаях зависит от особенностей строения и физико-химических свойств органических соединений (моноуглеводов и аминокислот). Многие органические соединения имеют сложную иерархичную структуру и способны "ступенчато маскировать" свое сродство к реакции меланоидинообразования, т.е. на каждом из иерархических уровней организации данные вещества имеют свою активность. При этом именно на последнем иерархическом уровне сродство к реакции меланоидинообразования наибольшее. К веществам, обладающим сложной и многоуровневой иерархич­ностью, можно отнести белковые молекулы.

Наблюдаемое повышение концентрации некоторых аминокислот может быть связано с частичным ресинтезом. Установлено, что аминокислоты могут образовы­ваться при определенных условиях из простых неорга­нических соединений [22, 23].

Таким образом, в результате проведенных исследова­ний по моделированию реакции меланоидинообразованиявыявлены следующие закономерности: при увеличении температуры реакции Майяра снижались концентрации GLU, SER, HIS, THR, ARG, ALA, CYS, VAL, MET, LEU, LYS. В то же время с увеличением продолжительности реакции наблюдалось увеличение концентрации SER, THR, VAL, MET, ILE, LEU. Колебания концентрации аминокислот в ре­акционной среде (повышение и понижение) при повыше­нии температуры проведения реакции были характерны для ASP, GLY, TYR, PHE, ILE, а при увеличении времени проведения реакции - для ASP, GLU, HIS, GLY, ARG, ALA, TYR, CYS, PHE, LYS. Наиболее существенные изменения отмечены при изменении рН в щелочную сторону.

Исследование влияния условий проведения экспери­мента показало, что в процессе меланоидинообразования происходит снижение содержания некоторых ами­нокислот (в том числе незаменимых) и, следовательно, снижение пищевой ценности продукта. В результате протекания этой реакции теряется от 20 до 50% свобод­ных аминокислот, причем с возрастанием температуры и увеличением продолжительности нагревания эти по­тери возрастают. Полученные данные важно учитывать при разработке новых технологий пищевых продуктов с максимальным сохранением их химического состава, пищевой ценности и потребительских свойств.

Литература

1. Schamberger G.P., Labuza Th. P. Effect of green tea flavonoids on Maillard browning in UHT milk // LWT Food Sci. Technol. 2007. Vol. 40, N 8. P. 1410-1417.

2. Andrewes P. Changes in Maillard reaction products in ghee during storage // Food Chem. 2012. Vol. 135, N 3. P. 921-928.

3. Bekedam E.K., Roos E., Schols H.A., Van Boekel M.A.J.S., Smit G. Low molecular weight melanoidins in coffee brew // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56, N 11. P. 4060-4067.

4. Wellner A., Huettl Ch., Henle Th. Formation of Maillard reaction prod­ucts during heat treatment of carrots // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, N 14. P. 7992-7998.

5. Coimbra M.A., Nunes C., Cunha P. R., Guine R. Amino acid profile and Maillard compounds of sun-dried pears. Relation with the red­dish brown colour of the dried fruits // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 233, N 4. P. 637-646.

6. Jing H., Yap M., Wong P.Y.Y., Kitts D.D. Comparison of physicochemical and antioxidant properties of egg-white proteins and fructose and inulin Maillard reaction products // Food Bioprocess Technol. 2011. Vol. 4, N 8. P. 1489-1496.

7. Hong J.-H., Kwon K.-Y., Kim K.-O. Sensory characteristics and con­sumer acceptability of beef stock containing the glutathione-xylose Maillard reaction product and/or monosodium glutamate // J. Food Sci. 2012. Vol. 77, N 6. P. S233-S239.

8. Wang R., Yang Ch., Song H. Key meat flavour compounds formation mechanism in a glutathione-xylose Maillard reaction // Food Chem. 2012. Vol. 131, N 1. P. 280-285.

9. Жаркова И.М., Кучменко Т.А., Росляков Ю.Ф. Исследование запаха хлеба их смеси ржаной и пшеничной муки, приготовленного на раз­ных заквасках и подкислителе // Хлебопродукты. 2015. 8. С. 47-49.

10. Lee S.M., Jo Ye-Jin, Kim Y.-S. Investigation of the aroma-active com­pounds formed in the Maillard reaction between glutathione and reduc­ing sugars // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 5. P. 3116-3124.

11. Alves R.C., Costa A.S.G., Jerez M., Casal S., Sineiro J., Nunez M.J. et al. Antiradical activity, phenolics profile, and hydroxymethylfurfural in espresso coffee: influence of technological factors // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 23. P. 12 221-12 229.

12. Liu Y., Kitts D. D. Confirmation that the Maillard reaction is the prin­ciple contributor to the antioxidant capacity of coffee brews // Food Res. Int. 2011. Vol. 44, N 8. P. 2418-2424.

13. Lopez de Lerma N., Peinado J., Moreno J., Peinado R. A. Antioxidant activity, browning and volatile Maillard compounds in Pedro Ximenez sweet wines under accelerated oxidative aging // LWT Food Sci. Technol. 2010. Vol. 43, N 10. P. 1557-1563.

14. Carrieri G., De Bonis M.V., Pacella C., Pucciarelli A., Ruocco G. Mod­eling and validation of local acrylamide formation in a model food during frying // J. Food Eng. 2009. Vol. 95, N 1. P. 90-98.

15. Gokmen V., Senyuva H. Z. Study of colour and acrylamide formation in coffee, wheat flour and potato chips during heating // Food Chem. 2006. Vol. 99, N 2. P. 238-243.

16. Mestdagh F., De Wilde T., Delporte K., Van P. C., De Meulenaer B. Impact of chemical pre-treatments on the acrylamide formation and sensorial quality of potato crisps // Food Chem. 2008. Vol. 106, N 3. P. 914-922.

17. Agilent Technologies (PN: 5980-1193EN) Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids / пер. на русский язык: В. Панкратов, Д. Янович. Минск, 2006. 10 с.

18. Полумбрик М.О., Литвяк В.В., Ловкис З.В., Ковбаса В.Н. Углеводы в пищевых продуктах. Минск : ИВЦ Минфина, 2016. 592 с.

19. Щербаков В.Г., Лобанов В.Г., Прудникова Т.Н., Минакова А.Д. Био­химия. СПб. : ГИОРД, 2003. 440 с.

20. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. Пищевая химия / под ред. А.П. Нечаева. СПб. : ГИОРД, 2001. 592 с.

21. Давидянц С.Б. Темное царство меланоидинов // Химия и жизнь. 1980. 3. С. 44-48.

22. Johnson A.P., Cleaves H.J., Dworkin J.P., Glavin D.P., Lazcano A., Bada J.L. The Miller volcanic spark discharge experiment // Science. 2008. Vol. 322. P. 404.

23. Bada J.L., Lazcano A. Prebiotic soup - revisiting the Miller experi­ment // Science. 2003. Vol. 300. P. 745-746.