Получение и физико-химическая характеристика функционального пищевого ингредиента - комплекса цинка с ферментолизатом белка куриного яйца

Резюме

Использование биотехнологического подхода, включающего ферментативный гидролиз пищевых белков и последующее комплексирование с эссенциальными микроэлементами (ЭМ), позволяет получать новые пищевые источники этих ЭМ - облигатных антиоксидантов (цинка, меди, марганца) в органической высокобиодоступной форме. Получен и физико-химически охарактеризован новый пищевой источник органической формы цинка в виде комплекса этого ЭМ с пептидными фракциями ферментолизата коагулированного яичного белка. Ингибиторная активность нативного яичного белка была снижена в 2 раза его коагуляцией - одностадийной термической обработкой до +88 °С. Протеолиз коагулированного яичного белка проведен в течение 2 временных интервалов (2 и 5 ч) ферментными препаратами - протеазами бактериального происхож­дения (нейтральная протеаза В 2256, щелочная протеаза С 1986 и щелочная протеаза протозим В). В составе гидролизатов охарактеризовано молекулярно-массовое распределение пептидных фракций методом эксклюзионной хро­матографии и определено содержание азота по методу Къельдаля. 5-часовой протеолиз при использовании ферментного препарата протозим В позволил перевести в водорастворимую фазу 85% общего азота относительно исходного коагулированного яичного белка. В этом гидролизате содержание пептидных фракций с молекулярной массой в интервале от 1,1 до 6,9 кДа составило 58%, менее 1,1 кДа - 21%, содержание цинка в составе комплекса с гидролизатом -19 мг/г. Обсуждается перспективность масштабирования использованного в работе биотехнологического подхода для получения в промышленных условиях высококонцентрированного пищевого источника цинка в органической форме, предназначенного для использования в качестве микроингредиента специализи­рованных продуктов для профилактики микроэлементной недостаточности.

Ключевые слова:белок куриного яйца, цинк, ферментативные гидролизаты, комплексы, функциональные пищевые ингредиенты, функциональные пищевые продукты

Вопр. питания. 2017. № 2. С. 70-75. doi: 10.24411/0042-8833-2017-00035.

При дефиците или недостаточности в рационе чело­века эссенциальных микроэлементов (ЭМ) - облигатных пищевых антиоксидантов, в том числе цинка, повышается риск свободнорадикальной патологии, про­являющейся многочисленными болезнями и клиничес­кими синдромами [1, 2].

Выявление и количественная оценка недостаточной обеспеченности цинком довольно трудоемки, поскольку определение цинка в плазме крови позволяет обнару­жить лишь тяжелую степень его дефицита [3]. Тем не менее имеющиеся данные свидетельствуют о том, что неадекватная обеспеченность этим ЭМ (в основном вследствие его недостаточного поступления с пищей и/или низкой усвояемости в составе пищевых про­дуктов растительного происхождения) распространена в странах Юго-Восточной Азии, Африки, в ряде регио­нов Европы, а также в России [4-6].

Практическая реализация программ, направленных на диетическую профилактику и коррекцию мик­роэлементной недостаточности, предполагает, во-первых, обогащение эссенциальными микроэлемен­тами пищевых продуктов массового потребления, доступных для всех групп детского и взрослого на­селения, регулярно используемых в повседневном питании, и, во-вторых, широкое производство специализированной продукции, включающей диетические профилактические и лечебные продукты, биологи­чески активные добавки (БАД) к пище, продукты для питания спортсменов, детей раннего возраста, функциональные пищевые продукты [7]. Отнесение пищевого продукта к категории "функциональный" определяется наличием в его составе (в определен­ных количественных соотношениях) функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), потребление которых с позиций доказательной медицины способствует снижению риска развития алиментарно-зависимых заболеваний, сохранению и улучшению здоровья [8]. Качество ФПИ, как дополнительных концентрирован­ных источников ЭМ, прежде всего должно обеспечи­ваться их высокой усвояемостью и одновременно бе­зопасностью, а эффективность в полной мере должна отвечать требованиям доказательной медицины. Ис­пользование биотехнологического подхода, включа­ющего ферментативный гидролиз пищевых белков и последующее комплексирование с эссециальными микроэлементами (ЭМ) с незаполненной d-электрон-ной оболочкой, позволяет получать новые пищевые источники этих ЭМ - облигатных антиоксидантов (цинка, меди, марганца) в органической высокобиодоступной форме [1].

Перспективным исходным пищевым белком - объек­том ферментолиза для последующего получения орга­нической формы цинка в качестве ФПИ является белок куриного яйца, обеспечивающий, как известно, питание эмбриона и обладающий биологической ценностью, превышающей этот показатель для большинства других пищевых белков [9]. Данные сравнительной оценки со­держания незаменимых аминокислот в белковой части яйца и в составе "идеального белка" по шкале ФАО/ ВОЗ свидетельствуют об отсутствии лимитирующих аминокислот в составе яичного белка. Переваривание сырого яичного белка в желудочно-кишечном тракте существенно снижается, поскольку в его составе со­держатся ингибитор сериновых протеиназ овомукоид (около 10%) и в существенно меньших количествах не­которые другие ингибиторы ферментов (овоингибитор, овостатин, цистатин). Соответственно сырой яичный белок не только плохо усваивается, но и может снижать усвояемость других белков пищи. Тепловая обработка снижает ингибиторную активность овомукоида, облег­чая его протеолиз in vitro [10].

Цель работы - представить результаты исследования, направленного на получение и физико-химическую ха­рактеристику нового пищевого источника органической формы цинка в виде комплекса этого ЭМ с пептидными фракциями ферментолизата коагулированного яичного белка.

Материал и методы

Образец коагулированного яичного белка был полу­чен его отделением от желтка, перемешиванием жид­кой белковой массы, подкислением лимонной кислотой с добавлением хлористого натрия (0,13 и 0,8% соответс­твенно), выдерживанием при комнатной температуре (24 °С) в течение 15 мин и последующей одностадийной тепловой обработкой смеси (нагревание до +88 °С при постоянном перемешивании). После этого была отде­лена жидкая фаза, а полученный коагулят охлажден и лиофильно высушен. Образец нативного яичного белка был получен его отделением от желтка и лиофильно высушен.

При проведении ферментативного гидролиза ис­пользовали протеазы бактериального происхождения: нейтральная протеаза В 2256 (продуцент - Bacillus licheniformis, активность 57775 ед/г, Ладыженский завод ферментных препаратов, Украина), щелочная протеаза С 1986 (продуцент - Acremonium, 77850 ед/г, Ладыжен­ский завод ферментных препаратов, Украина) и ще­лочная протеаза протозим В (активность 100 000 ед/г, "Микробиопром", Украина). Ферментативные актив­ности определены согласно [11].

Определение ингибиторной активности нативного и коагулированного яичного белка по отношению к трипсину из поджелудочной железы крупного рогатого скота ("Sigma", США) проведено согласно методике [12] c некоторыми модификациями. Навески 4,00 г нативного или коагулированного яичного белка диспер­гировали в объеме 36,0 см3 0,01М фосфатно-солевого буфера (рН 7,4) в течение 1 ч при постоянном переме­шивании при комнатной температуре (24 °С) с после­дующим центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин, центрифуга 6В, Beckman, Германия) Для проведения реакции в пробирки вносили по 0,2 см3 супернатанта (в различных разведениях: 10-3200 раз), по 1,7 см3 0,1 М трис-HCl, рН 7,8 с 0,001 М Са2+ и 0,1 см3 0,01% раствора трипсина в 0,001 н. HCl. В пробу "бланк" вносили 0,2 см3 фосфатно-солевого буфера, 1,7 см3 трис-HCl буфера и 0,1 см3 раствора трипсина. Растворы термостатировали 10 мин при 37 °С, после чего вносили по 0,5 см3 1,09% раствора N-альфа-бензоил-DL-аргинин-р-нитроанилид гидрохлорид (БАПНА) в диметилформамиде. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 0,5 см3 0,5 н H2SO4. Определяли экстинкцию растворов при λ=405 нм против пробы "бланк".

Протеолиз коагулированного яичного белка прово­дили следующим образом: 2% водную взвесь коагу­лированного белка выдерживали в течение 2 ч на во­дяной бане при температуре +53-55 °С (в случае протеазы В и С) или при +57-59 °С в (случае протозима В). Затем вносили фермент в количестве 5,0% (по массе от навески белка) и при постоянном перемешивании проводили ферментативный гидролиз в течение 5 ч, поддерживая рН в диапазоне 7,1-7,3 (для протеазы В и протеазы С) или 7,4-7,6 (для протозима В) 5,0-процен­тным раствором KOH:NaOH (2:1). Аликвоты реакционной смеси отбирали через 2 ч от начала реакции и через 5 ч (окончание ферментолиза) Реакцию останавливали нагреванием смеси до 75 °С и выдерживанием при этой температуре в течение 30 мин. Затем ферментолизаты центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин, центрифуга "Beckman J-6B", "Beckman", США), декантировали надосадок, промывали осадок дистиллированной водой и объединяли супернатанты. Количественно отбирали осадок. Осадок и супернатант лиофильно высушивали (лиофильная сушилка ЛС 500, "ПРОИНТЕХ-био", РФ) и по окончании процесса лиофилизации взвешивали сухие продукты.

В аликвотах гидролизатов оценивали молекулярно-массовое распределение методом эксклюзионной хроматографии согласно [13] [колонка Супероза 12, 1,0x30 см, ("Serva", Германия), элюент 0,2 М NaCl, ско­рость элюирования 0,4 см3/мин, длина волны проточного УФ-детектора УФ132 - 280 нм, программа для обработки данных "Мультихром 3.1"]. Хроматограммы интегриро­вались весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Комплекс цинка с ферментативным гидролизатом коагулированного белка, полученного с использова­нием протеазы В, получали по методике [14] с не­значительными модификациями. К осветленному ферментолизату при комнатной температуре добавляли 10% водный раствор ZnCl2 в соотношении по сухим веществам 20:1. Реакцию при постоянном перемешивании проводили в течение 60 мин при рН 7,0-7,1 при комнатной температуре (24 °С). По окончании инкубации полученную смесь осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, супернатант лиофильно высушивали.

Содержание азота в образцах яичного белка и его ферментолизатов определяли по методу Къельдаля [15] и содержание белка рассчитывали, используя коэф­фициент 6,25. Содержание цинка в составе комплекса с ферментолизатом определяли атомно-абсорбционным методом [16].

Авторы выражают благодарность старшему науч­ному сотруднику лаборатории пищевых биотехноло­гий и специализированных продуктов ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" С.Н. Зорину за помощь в работе.

Результаты и обсуждение

Вследствие мягких условий коагуляции ингибирующая активность яичного белка по отношению к панкре­атическому трипсину снизилась в 2 раза. Однако даже такое относительно незначительное снижение ингибиторных свойств яичного белка способствовало доста­точно эффективному одностадийному проведению протеолиза in vitro, о чем свидетельствуют представленные в таблице результаты сравнительной количественной оценки молекулярно-массового распределения пептид­ных фракций ферментолизатов коагулированного яич­ного белка, полученных с использованием трех различ­ных ферментативных препаратов.

Увеличение времени протеолиза с использованием протеазы С от 2 ч до 5 ч практически не влияло на уве­личение содержания фракций пептидов с молекулярной массой ниже 2,6 кДа, а при использовании протеазы В и протозима В этот показатель возрастал соответственно на 6% и 3%. Ферментолиз в течение 5 ч (в за­висимости от выбранного ферментного препарата) поз­волял перевести в водорастворимую фазу 52% (при использовании протеазы С), 69% (при использовании протеазы В) и 85% (при использовании протозима В) общего азота относительно исходного коагулирован­ного яичного белка. Для получения комплекса с цинком был выбран полученный в результате 5-часового рас­щепления коагулированного яичного белка протозимом В ферментолизат № 3, содержащий в своем составе 58% пептидных фракций в интервале молекулярных масс 6,9-1,1 кДа и 21% фракций с молекулярной массой менее 1,1 кДа. Высокая степень расщепления пептидных связей в ферментолизате определила эффективность связывания цинка, содержание которого в комплексе составило 19 мг/г.

Добавление цинка в составе ФПИ в 100 г пищевого продукта в количестве, обеспечивающем не менее 30% от его суточной потребности, является отличительным признаком функционального пищевого продукта с высо­ким содержанием цинка [8]. Ожидаемый благоприятный эффект при систематическом приеме функциональных пищевых продуктов с высоким содержанием цинка связан с тем, что этот ЭМ способствует нормализации кислотно-щелочного баланса. В соответствии с выше­изложенным содержание полученного комплекса цинка с гидролизатом № 3 в качестве ФПИ может составлять всего 0,2% и не влиять на органолептические свойства продукта.

Ферментолизаты яичного белка находят все более широкое применения при создании новых видов специ­ализированных пищевых продуктов [17, 18]. Использо­вание одностадийного гидролитического расщепления яичного белка с помощью ферментного препарата Flavopro 786MDP позволило получить высокоусвояемый ферментолизат, лишенный горького вкуса [19]. Тем не менее в доступной литературе нам не встречались публикации, свидетельствующие об использовании комплексов ферментолизатов яичного белка с ЭМ в качестве ФПИ.

Таким образом, очевидна перспективность масшта­бирования использованного в работе технологического подхода для получения в промышленных условиях вы­сококонцентрированного пищевого источника цинка в органической форме, в качестве микроингредиента специализированных пищевых продуктов для профи­лактики микроэлементной недостаточности.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04047).

Литература

1. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. М. : Миклош, 2009. 208 с.

2. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В., Сысоев Ю.А. Цинк в питании человека: физиологические потребности и био­доступность // Вопр. питания. 2002. Т. 71, № 3. С. 46-51.

3. Hotz С., Brown K. Assessment of the risk of zinc deficiency in populations and options for its control // Food Nutr. Bull. 2004. Vol. 25. P. S99-S199.

4. Epstein M.M., Kasperzyk J.L., Andmn O., Giovannucci E.L. et al. Dietary zinc and prostate cancer survival in a Swedish cohort // Am. J. Clin. Nutr. 2011. Vol. 93, N 3. P. 586-593.

5. Rubio C., Gutmrrez A.J., Revert C., Reguera J.I. et al. Daily dietary intake of iron, copper, zinc and manganese in a Spanish popula­tion // Int. J. Food Sci. Nutr. 2009. Vol. 60, N 7. P. 590-600.

6. Вильмс Е.А., Турчанинов Д.В., Турчанинова М.С. Микроэлементозы у детского населения мегаполиса: эпидемиологическая характеристика и возможности профилактики // Педиатрия. 2011. Т. 90, № 1. С. 96-101.

7. Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания / под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. М. : ДеЛи плюс, 2014. 520 с.

8. ГОСТ Р 55577-2013. Продукты пищевые функциональные; информация об отличительных признаках и эффективности. М. : Стандартинформ, 2014. 16 с.

9. Пищевая и биологическая ценность яиц и яичных продуктов : справочник / под. общ. ред. В.И. Фисинина. Сергиев Посад : ВНИТИП, 2013. 28 с.

10. Баяржаргал М., Розанцев Э.Г., Зорин С.Н., Бурдза Е.А. и др. Двухстадийный ферментативный гидролиз белков куриного яйца // Хранение и переработка сельхозсырья. 2005. № 4. С. 34-36.

11. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы опре­деления протеолитической активности (с изменением N 1). М. Государственный комитет СССР по стандартам, 1988. 11 с.

12. Биохимические методы исследования в клинике/ под ред. А.А. Покровского. М. : Медицина, 1969. С. 206-208.

13. Зорин С.Н., Баяржаргал М. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых ком­мерческих ферментных препаратов и различных схем про­ведения гидролиза // Биомед. химия. 2009. Т. 55, вып. 1. С. 73-80.

14. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Мазо В.К., Арнаутов М.В. и др. Новый источник органических форм цинка // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 72-75.

15. ГОСТ 10846-91. Зерно и продукты его переработки. Метод опре­деления белка. М. : Стандартинформ, 2009. 7 с.

16. ГОСТ 30178-96 Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. М. : Стандартинформ, 2010. 7 с.

17. Ruiz B. Debut of cutting edge and healthy egg products in Spain [Электронный ресурс]. Электрон. текстовые дан. Испания, 2015. URL: http://www.wattagnet.com/articles/24567-debut-of-cutting-edge-and-healthy-egg-products-in-spain.

18. Zambrowicz A., Eckert E., Bobak L., Dabrowska A. et al. Biological activity of peptides derived from de-fatted egg yolk granules hydrolysed with serine protease from Y. lipolytica yeast // Worlds Poultry Sci. J. 2015. Vol. 71, suppl. 1. Egg Meat Simposia. Book of Abstracts. P. 135.

19. Garces-Rimona M., Sandovalb M., Molinaa E., Lоpez-Fandiсoa R. Egg protein hydrolysates: New culinary textures // Int. J. Gastronomy Food Sci. 2016. Vol. 3. P. 17-22. Вопр. питания. 2017. № 2. С. 15-17.