Акриламид (2-пропенамид, CAS79-06-1, LD50 у мышей 170 мг/кг) широко используется в производстве пластмасс и в органическом синтезе. Данное вещество токсично, поражает преимущественно нервную систему, а также печень и почки, легко проникает через неповрежденную кожу, раздражает слизистые оболочки глаз, может способствовать повышению риска онкологических заболеваний [1, 7].
Токсичность акриламида обусловлена небольшой молекулярной массой, маленьким размером молекулы, высокой растворимостью в воде, а также относительно легким проникновением в организм человека через желудочно-кишечный тракт и кожу.
Акриламид не является нативным компонентом пищевых продуктов, не попадает в пищевые продукты из внешней среды и не используются в пищевой промышленности. Однако проведенные в 2002 г. шведскими учеными исследования показали возможность поступления акриламида в организм с пищевыми продуктами, в которых он образуется в процессе термической обработки [2, 4].
Основным механизмом образования акриламида в пищевых продуктах является взаимодействие углеводов и белков при повышенной температуре (так называемая реакция Майара, возможный механизм которой представлен на рис. 1 [4, 5]. Согласно этому, было предположено, что содержание акриламида должно быть наибольшим в продуктах, богатых углеводами и белками, подвергающихся при изготовлении воздействию высоких температур. Наибольшее содержание акриламида (мкг/кг) было обнаружено: в картофельных чипсах (50-2500), кукурузных хлопьях (100-850), крекерах (20-600), жареном картофеле (350-450), жареной кукурузе (100-300), бисквитах (10-650), кофе (100-400), халве (10-230), шоколаде (40-100) [2, 5].
Обнаружение значительного уровня акриламида указывает на его значительное содержание в пищевых продуктах, обусловливая необходимость разработки методик по его идентификации и количественному определению, а также установлению гигиенических нормативов по его содержанию в пищевых продуктах.
Рассматривая аналитические подходы к определению акриламида в пищевых продуктах, необходимо отметить, что акриламид представляет собой сложный объект для анализа: малый размер молекулы, а также растворимость преимущественно только в воде делают его извлечение из пищевых продуктов и очистку сложной нетривиальной задачей. Эта задача еще больше усложняется присутствием в матриксе продукта значительных количеств липидов, а также природных полимеров - белков и полисахаридов [3, 7-9].
В Российской Федерации сегодня отсутствуют какие-либо утвержденные методики определения акриламида в пищевых продуктах. Максимально допустимое его содержание в пищевых продуктах также не регламентировано. За рубежом определение акриламида проводят с помощью газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Наиболее распространенные методы представлены в таблице; они характеризуются высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью получаемых результатов.
Целью нашей работы была разработка методики количественного определения акриламида в пищевых продуктах методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).
С нашей точки зрения, наиболее оптимальным для определения акриламида методом является ГЖХ с детектированием бромпроизводных акриламида на детекторе электронного захвата, что обусловлено физическими свойствами акриламида (малый размер молекулы, низкая температура кипения), высокой селективностью и чувствительностью данного метода, а также тем, что необходимое оборудование широко распространено. Бромпроизводные акриламида обладают лучшей растворимостью в органических растворителях, в частности в этилацетате, что позволяет экстрагировать эти производные в этилацетат. Также бромирование проводилось для улучшения определения акриламида с помощью электронозахватного детектора, поскольку данный вид детектора обладает повышенной чувствительностью к галогенпроизводным.
Рис. 1. Возможный механизм образования акриламида из глюкозы и аспарагина в ходе реакции Майяара
Материал и методы
Газохроматографическое определение проводили на газовом хроматографе "Agilent 7890A" (США) с хроматографической колонкой "Supelcowax" (60 м, 0,53 мм, 1 мкм) (США). Газовый хроматограф оснащен электронозахватным ("Agilent") и масс-селективным (Finnigan Trace DSQ II) (США) детекторами, которые работали поочередно.
Центрифугирование образцов проводили на центрифугах: "Rotina 38" (ФРГ) и "Eppendorf 5418" (ФРГ), встряхивание - в шейкере "Biosan OS-10" (США).
В процессе подготовки пробы использовались следующие реактивы: бидистиллированная вода, гексан х.ч., этилацетат х.ч., калия бромид х.ч., калия бромат х.ч., кислота серная х.ч., натрия тиосульфат ч., натрия сульфат х.ч., триэтиламин (≥99%; импортный).
Объекты исследования
Для разработки методики были выбраны следующие объекты: чипсы картофельные (как объект, заведомо содержащий акриламид в концентрации >0,5 мг/кг), сухое молоко (как объект со сложной матрицей, не содержащий акриламид в пределах обнаружения существующих методик), кофе растворимый (как сильноокрашенный объект с содержанием акриламида в концентрациях <0,5 мг/кг).
Приготовление стандартного раствора
Стандартный образец акриламида (≥99%) был получен от фирмы "Merck Schuchardt OHG" (США).
Около 50 мг акриламида (навеска с точностью 0,1 мг) отвешивали в мерную колбу объемом 50 мл. Добавляли 20 мл дистиллированной воды и перемешивали до полного растворения. После этого объем доводили до метки дистиллированной водой и перемешивали (основной раствор, концентрация 1 мг/мл). 1 мл основного раствора переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали (рабочий раствор, концентрация 10 мкг/мл).
Приготовление контрольных образцов
Контрольные образцы готовили с целью оценки метрологических характеристик методики. Для этого к навеске сухого молока (предварительно проверенного на отсутствие акриламида) добавляли акриламид до концентраций от 0,005 до 5,0 мг/кг.
Методы, применяемые для определения акриламида в Европе [5]
Подготовка пробы Экстракция
Из твердых объектов акриламид экстрагировали дистиллированной водой (к 2,0 г продукта добавляли 20 мл дистиллированной воды). После экстракции полученный раствор подвергали центрифугированию (5000 об, 10 мин) и отбирали 15 мл прозрачного слоя.
Полученный таким образом экстракт содержал значительное количество белка и жира, что потребовало введения операций по их удалению.
Удаление белков и жиров
Для удаления жиров 15 мл водного экстракта, полученного указанным выше способом, обезжиривали 15 мл гексана 2 раза. Предварительно нами была проведена проверка отсутствия потерь акриламида в этих условиях. Полученные данные показали, что акриламид нерастворим в гексане и не может переходить в гексан в указанных условиях.
Для осаждения белков к очищенному от жиров водному экстракту добавляли 50% серную кислоту до рН<1. Выбор серной кислоты был обусловлен также необходимостью ее присутствия в образце для последующего бромирования. Денатурированные белки удаляли центрифугированием.
Бромирование
К 10 мл очищенного водного экстракта добавляли калия бромид (5 г) и перемешивали до полного растворения. После этого добавляли раствор калия бромата (0,2 М), перемешивали, помещали в холодильник на 90 мин.
Экстракция
К полученному раствору добавляли 10 мл этилацетата, встряхивали в течение 30 мин, центрифугировали. Слой этилацетата отбирали.
Рис. 2. Хроматограмма образца картофельных чипсов
Рис. 3. Хроматограммы образцов сухого молока (нижняя линия - без добавок, акриламид не обнаружен; верхняя линия - с добавкой акриламида на уровне 1,0 мг/кг)
Очистка этилацетатного экстракта
После бромирования образуется неустойчивое дибромпромпроизводное, которое постепенно переходит в более устойчивое монобромпроизводное. Для ускорения этого перехода в полученный экстракт добавляли триэтиламин (0,2 мл на 10 мл этилацетатного извлечения).
Условия хроматографического разделения и детектирования
Были подобраны следующие условия газохроматографического разделения: 140 °C - 1 мин, далее 5 °C/мин - до 220 °C, изотерма 33 мин, газ-носитель - азот (4 мл/мин). Параметры работы электронозахватного детектора: температура 300 °С, поток поддува - 30 мл/мин.
Время удерживания монобромпроизводного акриламида в этих условиях составило 18,5 мин. По приготовленным контрольным пробам ориентировочная чувствительность метода составляет <0,005 мг/кг. Полученные хроматограммы представлены на рис. 2 и 3.
Результаты и обсуждение
Изучение продуктов бромирования акриламида
При использовании ГЖХ с масс-спектрометрическим детектором было показано, что образующийся при бромировании дибромпропанамид при действии триэтиламина переходит в монобромпропенамид. При этом было обнаружено, что:
- при бромировании акриламида образуются только дибромпропанамид и монобромпропенамид;
- после добавления триэтиламина к продуктам бромирования акриламида обнаруживается только монобромпропенамид;
- акриламид, не подвергшийся бромированию, в экстракте не обнаружен (он либо не экстрагируется в этилацетат, либо бромирование проходит полностью);
- в качестве сопутствующих веществ были обнаружены кротоновая кислота, ксилол, метилбензальдегид и ряд других веществ, указывающих на необходимость дополнительной очистки исходных реактивов.
Метрологические характеристики методики
Для оценки некоторых метрологических характеристик метода было проведено исследование серии контрольных образцов (на основе сухого молока) с содержанием акриламида в диапазоне от 0,005 до 5,0 мг/кг. Результаты проведенных исследований показали, что существующая методика имеет следующие метрологические характеристики: чувствительность 0,005 мг/кг (соотношение сигнал/шум не менее чем 1 к 3), пределы количественного определения от 0,01 мг/кг (соотношение сигнал/шум не менее чем 1 к 10) до 5,0 мг/кг (р=0,998).
Определение акриламида в картофельных чипсах и растворимом кофе
Для количественного определения акриламида в картофельных чипсах и растворимом кофе был использован метод добавок. Содержание акриламида в исследованных образцах картофельных чипсов составило 3,2 мг/кг, в образцах растворимого кофе - 0,23 мг/кг, что соответствует данным аналогичных исследований [2, 5].
Проведенные исследования показали возможность использования бромирования акриламида с целью придания ему необходимых свойств для лучшей экстракции, очистки и детектирования. Также выявлена возможность качественного и количественного определения акриламида в пищевых продуктах методом ГЖХ с детектированием на детекторе электронного захвата. Обнаруженное в образцах пищевой продукции содержание акриламида является токсикологически значимым, что делает необходимым проведение дальнейших исследований с целью возможной разработки гигиенического норматива.
Литература
1. Багрянцева О.Н., Шатров Г.Н., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 4-12.
2. Acrylamide. The toxicological evaluation of compounds on the agenda. Evaluation of certain food contaminants: sixtyfourth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. - Geneva, 2005. - Р. 8 -26.
3. Castle L . // J. Agricultur. Food Chemistry. - 1993. - Vol. 41. - P. 12 6 1-12 6 3 .
4. Dhiraj A., Shetty V., Shetty K. // Innovat. Food Science Emerg. Technolog. - 2003. - Vol. 4. - P. 331-338.
5. Health implications of acrylamide in food: report of a joint FAO/WHO consultation. - Geneva, 2002. - 32 р.
6. Klapp C . // The Lancet. - 2002. - Vol. 360. - P. 64-71.
7. Nemoto S., Takatsuk S.,Sasaki K. et al. // Shokuhin Eiseigaku Zasshi. - 2002. - P. 371-376.
8. Wenzl T., Beatriz de la Calee M., Anklam E. Overview on analytical methods for the determination of acrylamide in food products. - London: Science, 2003. - 148 p.
9. Zhu Y., Li G., Duan Y. et. al. // Food Chemistry. - 2008. - Vol. 109. - P. 899-908.