Сахарный диабет продолжает оставаться одной из наиболее значимых медико-социальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно число заболевших увеличивается на 5-7%, удваиваясь за 15-17 лет. Главным принципом диетического питания при этой патологии является направленность на нормализацию метаболических нарушений. Основными показателями, свидетельствующими о состоянии компенсации при сахарном диабете, являются нормальные величины глюкозы крови натощак и в течение суток, а также отсутствие глюкозы в моче [1, 2]. Помимо гипергликемии заболевание проявляется глюкозурией и полиурией на фоне полидипсии, нарушениями жирового, белкового и минерального обмена и развитием осложнений. При диабете происходит усиленный кетогенез и наблюдается положительная реакция на кетоновые тела, при этом существует корреляция между высокими уровнями глюкозы в крови и кетонами. Чем выше уровень глюкозы, тем вероятнее наличие кетонов.
Известны данные о влиянии воды с модифицированным изотопным составом со сниженным содержанием дейтерия (легкая вода) на нормализацию процессов обмена, в том числе у людей, страдающих сахарным диабетом [3]. Положительный эффект от применения легкой воды заключается в нормализации углеводного и липидного обмена, проницаемости клеточных и лизосомальных мембран за счет улучшения работы различных ферментных систем, в том числе отвечающих за транспорт ионов, глюкозы и инсулина в клетку. Легкая вода позволяет улучшить работу клеточных рецепторов и транспорт глюкозы в клетку за счет разблокирования части рецепторов и увеличения проницаемости клеточных мембран для глюкозы. Это приводит к улучшению работы энергетических цепей в клетке, в том числе к увеличению уровня аденозинтрифосфата в митохондриях, следствием чего является снижение уровня глюкозы в крови, уменьшение глюкозурии, улучшение обменных процессов.
Облегченная по дейтерию вода в условиях формирования в организме окислительного стресса способна приводить к уменьшению интоксикации и повышению антиоксидантного потенциала органов и тканей [4-6]. Введение в пищевой рацион легкой воды может ускорять реакции изотопного обмена, стимулируя органы функциональной системы детоксикации (печень, почки) за счет влияния на термодинамические и термокинетические показатели макромолекул (прежде всего белков, нуклеиновых кислот), изменяя скорость биохимических процессов в клетке [7, 8].
Мясные продукты, характеризующиеся высоким содержанием животного белка с полным спектром незаменимых и заменимых аминокислот, жирорастворимых витаминов и L-карнитина и отсутствием углеводов, должны присутствовать в рационе людей с нарушениями углеводного обмена. В то же время они имеют достаточно высокое содержание жира с преобладанием насыщенных жирных кислот и холестерина, а также калорийность, что может приводить к увеличению содержания липидов в крови и прогрессированию заболевания [9].
Цель работы - изучение влияния воды с пониженным содержанием дейтерия и мясных полуфабрикатов, изготовленных c ее добавлением и предназначенных для оптимизации питания лиц с нарушением углеводного обмена, на показатели лабораторных животных с моделью аллоксанового диабета.
Материал и методы
Для проведения эксперимента в условиях экспериментального стенда ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова" был выработан образец готовых мясных рубленых полуфабрикатов из модельного фарша с добавлением воды с пониженным содержанием дейтерия (исходная концентрация дейтерия - 40 мг/л), которую получали на установке, разработанной в Кубанском государственном университете [10].
Модельный фарш состоял из говядины (70%), рисовой муки (6%), изолята соевого белка (2,5%) и воды (21,5%). Изготовленные полуфабрикаты были доведены до кулинарной готовности запеканием в пароконвектомате (UNOX XVC 205E, Италия) при 180°С в течение 15 мин. Готовность фиксировали при помощи температурного датчика, помещенного в центр продукта.
Данные о пищевой и биологической ценности полуфабрикатов приведены в табл. 1.
Для исследования биокорригирующих свойств воды с пониженным содержанием дейтерия и мясных полуфабрикатов, изготовленных с ее использованием, эксперимент проводили на крысах-самцах стока Вистар (n=36) с исходной массой тела 220±20 г, из которых было сформировано 4 группы:
1-я группа состояла из животных, в изокалорийный рацион которых вводили мясные рубленые полуфабрикаты, приготовленные с использованием воды с пониженным содержанием дейтерия взамен части рациона в количестве 50% по содержанию белка (n=10).
2-я группа - животные, потреблявшие на протяжении всего эксперимента стандартный рацион вивария, в качестве питьевого компонента - воду с пониженным содержанием дейтерия (n=10);
3-я группа - животные, содержащиеся на стандартном рационе вивария, на протяжении всего эксперимента потреблявшие в качестве питьевого компонента очищенную водопроводную воду (n=10);
4-я группа - животные, содержащиеся на стандартном рационе вивария, на протяжении всего эксперимента потреблявшие очищенную водопроводную воду (интактная) (n=6).
Эксперимент был разделен на 3 этапа, на протяжении всего эксперимента животные потребляли исследуемые образцы в соответствии с вышепредставленной схемой.
I этап протяженностью 16 сут заключался в адаптации к рационам опытных животных 1-й и 2-й групп.
На II этапе длительностью 7 сут животным 1-й, 2-й и 3-й групп проводили моделирование аллоксанового диабета путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана 1-водного ("Диаэм", РФ) в дозе 12 мг на 100 г массы тела [11-15].
III этап (длительностью 20 сут) заключался в изучении диетотерапевтического действия исследуемых образцов - воды с пониженным содержанием дейтерия и изготовленных на их основе полуфабрикатов.
Все животные в группах содержались в сходных условиях при температуре 23±3 °С, влажности 45±5%, освещение - режим день/ночь: с 7.00 до 19.00. Рацион животных всех групп был сбалансирован по белку. В качестве стандартного рациона использовали концентрированный комбикорм по ГОСТ Р 50258 (ООО "Лабораторкорм", РФ), содержание белка - 19%, жира - 5%, клетчатки - 4% (295 ккал/ 100 г).
На протяжении всего эксперимента вели наблюдение за состоянием животных (поедаемостью корма и потреблением воды, поведением, состоянием шерстного покрова и слизистых оболочек, физической активностью), уделяя особое внимание животным на II этапе эксперимента. Каждые 3-и сутки животных взвешивали с помощью электронных технических весов Ohaus ("AdventurerPro", США) с точностью ±0,1 г, по результатам взвешиваний рассчитывали рацион.
На протяжении эксперимента проводили исследования мочи на автоматическом анализаторе CL-50 ("HTI", США), используя тест-полоски UrineRS H10 ("HTI", США).
Продолжительность всего эксперимента составила 42 сут.
Животных выводили из эксперимента с помощью камеры для эвтаназии углекислым газом ("VetTech", Великобритания). После чего у животных из правого желудочка сердца отбирали кровь на общее клиническое и биохимическое исследования. Проводили патологоанатомическое вскрытие животных, макроскопически оценивали состояние внутренних органов, определяли абсолютную массу печени, почек, селезенки, сердца путем взвешивания на электронных весах ("AcculabVicon", США) с точностью ±0,001 г, после чего рассчитывали относительную массу внутренних органов (в процентах от общей массы тела животного).
Общее клиническое исследование проб цельной крови проводили на полностью автоматическом гематологическом анализаторе Abacus junior vet 2.7 ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), используя наборы реактивов компании "Diatron". В крови животных определяли 18 показателей. Биохимические показатели сыворотки крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе BioChem FS 360 ("HTI", США), используя наборы реактивов ("HighTechnology", США).
Для расчетов использовали программу Statistica 10. Результаты представлены в виде: взвешенное среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую достоверность рассчитывали с применением однопараметрического ANOVA-теста с применением критерия Дункана, в качестве значимого уровня выбрана вероятность 0,05.
Результаты и обсуждение
В течение всего эксперимента сохранность животных была 100%. Поедаемость исследуемых мясных рубленых полуфабрикатов была полная. Наблюдения за животными не выявили никаких отклонений от нормы в физиологическом состоянии на I этапе эксперимента - состояние животных находилось в пределах физиологической нормы. Крысы были подвижны и активны; мышцы в тонусе; тактильная реакция сохранена; шерсть плотно прилегает к телу, невзъерошенная, гладкая, чистая, блестящая, кожный покров эластичный, без нарушения целостности; видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, истечений и других признаков воспалительных реакций нет. Глаза ярко-красного цвета. Акты мочеиспускания и дефекации находились в пределах физиологической нормы.
При моделировании сахарного диабета, начиная со 2-х суток после введения аллоксана, было отмечено снижение двигательной активности, первичная полидипсия и полифагия.
Известно, что после введения аллоксана содержание глюкозы в крови повышается, через 24-36 ч после начала эксперимента у подопытных крыс развиваются все симптомы заболевания: глюкозурия, гипергликемия, полидипсия, полифагия и полиурия, через 30-45 дней повышается гематокрит, время свертывания крови и лимфы у крыс сокращается, а их вязкость повышается. В это же время у крыс появляется глюкозурия, приводящая к усиленному мочеотделению и как следствие к уменьшению плазменной части крови и сгущению крови. У крыс c аллоксановым диабетом содержание общего белка в лимфе и плазме крови снижается, повышается активность ферментов аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ). Данные показатели свидетельствуют об активации цитолитических процессов в печени и поджелудочной железе животных [16-17].
Наблюдение за динамикой изменения массы тела лабораторных животных в ходе эксперимента (рис. 1) показало, что на I этапе животные всех групп, в том числе крысы опытных 1-й и 2-й групп, увеличивали вес в среднем от 2 до 7 г/сут начиная с 1-х суток. На этапе моделирования аллоксанового диабета у животных 1-3-й групп отмечена выраженная потеря массы тела, наиболее интенсивно она снижалась у крыс 2-й группы, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия. При наблюдении за животными на III этапе эксперимента была выявлена стабилизация массы тела у животных 1-й и 2-й групп, при этом у крыс 2-й группы, которым спаивали воду с пониженным содержанием дейтерия, отмечалось менее выраженное увеличение массы тела.
Прибавка массы тела животных на I этапе (17 сут) составили: в 1-й группе крыс, потреблявших образцы мясных продуктов, - 61,2%, у животных 2-й группы, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия, - 54,3%, у животных 3-й и 4-й групп - 61,3 и 59,9% соответственно. На II этапе (7 сут) прирост массы тела животных составил: в 1-й группе животных - 1,3%, у животных 2-й группы - -0,2%, у животных 3-й группы - 0,1%, у интактных животных 4-й группы - 9,4%. Прибавка массы тела животных на III этапе (20 сут) составила у животных 1-й и 2-й групп - 17,6 и 16,2%, 3-й группы - 16,0%, у интактных животных 4-й группы - 20,7%.
Снижение массы тела животных объясняется развитием диабетического состояния - нарушением водно-минерального обмена и преобладанием катаболических реакций над анаболическими. Более выраженное снижение массы тела у животных, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия, связано со свойствами воды - способностью изменять скорость биокаталитических процессов в клетках органов и оказывать некоторое стрессовое воздействие на организм [4].
Сравнительный анализ содержания кетонов и глюкозы в моче показал, что в процессе развития патологического состояния изменяются концентрации оцениваемых показателей (рис. 2). При этом у животных 1-3-й групп глюкозурия и кетонурия отмечалась уже на 2-е сутки после введения аллоксана (18-е сутки эксперимента) - содержание глюкозы в моче достигало 28 ммоль/л, кетонов - до 1,5 ммоль/л соответственно. Стоит отметить, что у животных 3-й группы глюкозурия и кетонурия сохранялась на протяжении всего этапа моделирования, содержание глюкозы у крыс данной группы достигло максимальных значений на 21-е сутки эксперимента (5-е сутки моделирования соответственно).
У животных 1-й группы, потреблявших мясной продукт, глюкозурия сохранялась до 28-х суток (11-е сутки после введения аллоксана), кетонурия - до 34-х (17-е сутки после моделирования). У крыс 2-й группы, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия, на 2-е сутки после введения аллоксана содержание глюкозы в моче составило 2,5 ммоль/л, на 5-е сутки достигало 28 ммоль/л. При этом глюкоза в моче животных 2-й группы не детектировалась уже на 7-е сутки после введения аллоксана, кетоны - на 17-е сутки после моделирования заболевания соответственно.
Гематологические исследования в конце эксперимента показали, что у животных 3-й группы по отношению к интактным животным (4-я группа) отмечалось увеличение содержания лейкоцитов за счет лимфоцитов (на 73,8 и 96,0%), смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток. При этом у 62,5% животных выявлялся выраженный лейкоцитоз и лимфоцитоз; увеличение однородности популяции эритроцитов (уменьшении ширины распределения эритроцитов) при относительной неизменности концентрации эритроцитов, гемоглобина, среднего объема эритроцита и среднего содержания гемоглобина в эритроците на фоне увеличения концентрации тромбоцитов и тромбокрита (до 24% соответственно). У животных 1-й и 2-й групп отмечалась схожая тенденция, однако менее выраженная: концентрация гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов и тромбокрит находилось в пределах физиологических значений (см. табл. 2).
При анализе результатов биохимического исследования сыворотки крови в конце эксперимента (табл. 3) у животных 1-3-й групп выявлена гипергликемия, наиболее выраженная у крыс 3-й группы (у 37,5% животных концентрация глюкозы в сыворотке крови достигала 14,5 ммоль/л). Уровень глюкозы у животных 1-й и 2-й групп был выше показателей интактных животных на 38% и соответствовали верхней границе физиологической нормы. Полученные результаты коррелируют с данными литературы: при моделировании аллоксанового диабета максимальный уровень гипергликемии отмечается на 3-4-е сутки после введения аллоксана, совпадая по срокам с разрушением 70-80% β-клеток островков Лангерганса, а уже на 9-е сутки начала моделирования концентрация глюкозы в крови опытных животных снижается ввиду способности β-клеток поджелудочной железы крыс и мышей восстанавливать свою численность и структурно-функциональное состояние при аллоксановом диабете [19].
У животных 1-3-й групп отмечено повышение уровня мочевины, креатинина, активности щелочной фосфатазы, АЛТ и АСТ, что свидетельствует об усилении глюконеогенеза, характерного для развития диабетического состояния, и активации цитолитических процессов в печени и поджелудочной железе животных (см. табл. 3).
Таким образом, по результатам эксперимента можно отметить следующее. У животных опытных групп (модель аллоксанового диабета) отмечались признаки воспалительного процесса. Результаты клинического анализа крови в конце эксперимента отражали повышение содержания лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов. Для остальных показателей выявлены колебания в пределах их биологической вариабельности. Введение в рацион животных с моделью диабета в качестве питьевого компонента воды с пониженным содержанием дейтерия как на I, так и на II этапе эксперимента не оказало существенного влияния на показатели крови.
Установлено положительное воздействие воды с пониженным содержанием дейтерия и мясного продукта, изготовленного с ее применением, на организм лабораторных животных. Протекторное воздействие воды с пониженным содержанием дейтерия, в том числе в составе мясного продукта, на организм лабораторных животных проявляется в снижении глюкозурии на 5-е сутки моделирования заболевания и нормализации содержания в моче глюкозы и кетонов на 17-е сутки после введения аллоксана, что, по-видимому, свидетельствует о возможности применения легкой воды для коррекции метаболических процессов людей с нарушением углеводного обмена.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 15-16-00008.
Литература
1. Мирошниченко Л.А., Золоедов В.И., Волынкина А.П., Кулакова С.И. Влияние диетотерапии с использованием подсолнечного масла и масла амаранта на показатели иммунной реактивности у больных сахарным диабетом типа 2 // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 4. С. 30-36.
2. Балаболкин М. И. Патогенез и механизм развития ангиопатий при сахарном диабете // Кардиология. 2000. № 10. С. 74-87.
3. Тимаков А.А., Турова Е.А., Головач А.В., Акимов Б.К. Способ лечения больных сахарным диабетом. Пат. РФ № 2270017. Опубл. 20.02.2006. Заявка № 2004120854/14.
4. Лисицын А.Б., Барышев М.Г., Басов А.А., Барышева Е.В., Быков И.М., Дыдыкин А.С. и др. Воздействие воды со сниженным содержанием дейтерия на организм лабораторных животных при различном функциональном состоянии неспецифических защитных систем // Биофизика. 2014. Т. 59, № 4. С. 757-765.
5. Джимак С.С., Басов А.А., Барышев М.Г. Распределение дейтерия в биологических жидкостях и внутренних органах: влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на градиент D/H и процессы адаптации // Докл. АН. 2015. Т. 465, № 2. С. 245-248.
6. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Дыдыкин А.С., Быков И.М., Арцыбашева О.М. и др. Коррекция метаболических процессов у крыс при хроническом эндотоксикозе с помощью реакций изотопного (D/H) обмена // Известия РАН. Сер. биол. 2015. № 5. С. 518-527.
7. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г., Джимак С.С., Быков М.И. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 43-50.
8. Джимак С.С., Барышев М.Г., Басов А.А., Тимаков А.А. Влияние воды со сниженным содержанием дейтерия на изотопный состав лиофилизированных тканей и морфофункциональные показатели организма у крыс из разных поколений // Биофизика. 2014. Т. 59, вып. 4. С. 749-756.
9. Деревицкая О.К., Солдатова Н.Е. Проектирование состава мясных полуфабрикатов для функционального питания при диабете // Мясная индустрия. 2015. № 2. С. 33-35 .
10. Фролов В.Ю., Барышев М.Г., Болотин С.Н., Джимак С.С. Способ получения биологически активной питьевой воды с пониженным содержанием дейтерия. Пат. РФ № 2438765 с приоритетом от 25.05.2010. Опубл. 10.01.2012. Заявка № 2010121324/05
11. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М. : Гриф и К, 2012. 944 с.
12. Корженевский Д.А., Селищева А.А., Савельев С.В. Определение содержания эндогенного аллоксана в крови человека// Биомед. химия. 2009. Т. 55, вып. 3. С. 343-349.
13. Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю. Антиоксиданты при экспериментальном сахарном диабете // Пробл. эндокринол. 2008. Т. 54, № 5. С. 43-50.
14. Баранов В.Г, Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г. и др. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии. Л. : Медицина, 1983. 240 с.
15. Гати Моханнад, Федорин Д.Н., Полякова-Семенова Н.Д. Физиолого-биохимические аспекты адаптации крыс к условиям аллоксанового диабета // Фундам. исслед. 2013. № 11-3. С. 465-469.
16. Черкасова О.П., Кузнецова Н.В., Пальчикова Н.А., Селятицкая В.Г. Активность адренокортикальной системы при экспериментальном диабете у крыс // Экспер. диабетол. 2011. № 2. С. 37-40.
17. Демченко Г.А., Булекбаева Л.Э., Абдрешов С.Н., Балхыбекова А.О. Функциональное состояние лимфатической системы при экспериментальном диабете // Соврем. наукоемкие технологии. 2010. № 2. С. 82-84.
18. Evans G.O., George A. Animal Clinical Chemistry: A Practical Handbook for Toxicologists and Biomedical Researchers. 2nd ed. UK : CRC Press, 2009. 368 р.
19. Золотарева С.Н., Мубаракшина О.А. Окислительный стресс и антиоксидантный статус при экспериментальном аллоксановом диабете // Материалы Международной научно-практической конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных". Воронеж, 2002. С. 47-52.