По последним оценкам Всемирной организации здравоохранения кампилобактериоз относится к числу самых распространенных инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи. К основным факторам передачи инфекции относят продукты из мяса птицы, реже из говядины и свинины, не прошедшие достаточную термическую обработку или вторично контаминированные вследствие нарушения технологии приготовления пищи, несоблюдения условий хранения и реализации продукции. Определенную долю заболеваний обусловливает потребление загрязненного возбудителем сырого молока.
Бактерии рода Campylobacter распространены повсеместно в природе, они присутствуют в организме домашней птицы или теплокровных животных и могут персистировать длительное время в окружающей среде при неблагоприятных условиях. Вид C. jejuni обычно рассматривается как нормальный обитатель кишечника, обусловливая бактерионосительство у домашней птицы и высокий уровень контаминации птицефабрик и перерабатывающих предприятий. Вследствие этого сырье и продукты из птицы признаны основным источником выделения и фактором передачи возбудителей кампилобактериоза [1]. При высокой частоте обнаружения этих бактерий в разных видах мясного сырья наибольший риск для здоровья человека связан с употреблением куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.
Одной из важнейших характеристик, определяющих биологические особенности бактерий Campylobacter jejuni, является повышение их устойчивости к антимикробным воздействиям и быстрое распространение резистентных штаммов в пищевых продуктах и окружающей среде. Этот процесс чрезвычайно ускоряется в присутствии в среде минорных количеств антибиотиков, как раз в тех дозах, которые используются не для лечения животных, а для стимуляции их откорма или профилактики заболеваний. Неконтролируемое использование антибиотиков в сельском хозяйстве, расширение спектра применяемых биоцидов приводят к селективному отбору наиболее устойчивых форм бактерий, обладающих резистентностью к антибиотикам и множественными факторами патогенности.
В повседневной практике лечение кампилобактериоза осуществляется назначением антибиотиков широкого спектра действия, среди которых препаратами выбора являются макролиды, и главным образом эритромицин. Наряду с антибиотиками этой группы эффективными лечебными препаратами признаны аминогликозиды, фторхинолоны, тетрациклины, хлорамфеникол, нитрофураны и др. [2]. Необоснованное или неправильное применение этих антимикробных средств в медицине и ветеринарии сопровождается появлением большого количества резистентных штаммов, выделяемых от больных людей, животных и попадающих в окружающую среду. Широко используемые ранее для лечения кампилобактериоза фторхинолоны способствовали формированию устойчивости к этой группе антибиотиков у 50-84% циркулирующих штаммов Campylobacter spp., что обусловило ее непригодность для терапевтических целей [3].
Было показано, что использование фторхинолонов в птицеводческих хозяйствах может превратить абсолютно чувствительные штаммы C. jejuni в полностью резистентные в течение нескольких дней [4]. По данным Национальной системы мониторинга антимикробной резистентности возбудителей кишечных инфекций, в США при кампилобактериозах, связанных с употреблением мяса кур, в 14% случаев выделяли резистентные к фторхинолонам штаммы Campylobacter.
В отчете Европейского агентства по безопасности пищи приводятся результаты исследований, проведенных 28 странами Евросоюза по оценке антибиотико-резистентности штаммов нескольких групп возбудителей пищевых зоонозов, включая Campylobacter jejuni и C. coli [5]. Показано, что штаммы, выделенные от больных людей, а также обнаруженные в мясе птицы (кур-бройлеров, индеек), обладали высокой резистентностью к ципрофлоксацину (в среднем 70%), налидиксовой кислоте (65%) и тетрациклинам (54%).
Контаминация пищевых продуктов микробами, несущими детерминанты трансмиссивной резистентности, в целом является одной из наиболее актуальных проблем безопасности пищи. Однако данные о частоте обнаружения резистентности у возбудителей кампило-бактериоза, ее профилях и механизмах формирования до сих пор недостаточны.
Наиболее изучены 4 основных биохимических механизма устойчивости бактерий к антибиотикам, в том числе энзиматическая инактивация, модификация молекулы-мишени, активное выведение антибиотика из микробной клетки (efflux pump), изменение проницаемости внешней мембраны микробной клетки. Подобные механизмы описаны и в отношении эритромицина и линкомицина, т.е. антибиотиков, наиболее эффективных при кампилобактериозе. Чаще всего они нарушают функционирование рибосом. Например, метилирование рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) эффективно защищает бактериальную клетку от летального действия эритромицина [6, 7]. В последние годы обнаружены и другие варианты формирования устойчивости, например образование метаболического шунта (приобретение генов метаболического пути, альтернативного тому, который ингибируется антибиотиком), имитация молекулы-мишени, сверхэкспрессия молекулы-мишени [8, 9].
Также широко встречается устойчивость, обусловленная снижением содержания антибиотика в клетке, и, следовательно, доступа его к мишени. Этот механизм может осуществляться двумя основными способами: благодаря активному выведению антибиотика из микробной клетки (efflux pump), основанному на работе специализированного набора белков, образующих так называемые трансмембранные (протонные) помпы, и нарушению проницаемости внешних мембран микробной клетки [10]. На данный момент описано 5 основных семейств бактериальных протонных помп [11].
Таким образом, механизмы резистентности кампило-бактерий к антибиотикам имеют множественный характер, включая изменения структуры рибосом, мутации генов, кодирующих ДНК-гиразу (gyrA), ферментативные модификации антибиотика, метилирование рРНК, активацию протонной помпы и др. Считают, что резистентность кампилобактерий к аминогликозидам связана с наличием ферментов фосфотрансфераз, почти 90% штаммов C. jejuni и C. coli синтезируют β-лактамазы нескольких типов, что сопровождается появлением устойчивых вариантов возбудителей кампилобактериоза [12-15].
Изучение антибиотикорезистентности штаммов C. jejuni, выделенных из пищи и объектов окружающей среды, позволит разработать новые подходы к подтверждению роли пищевого пути передачи этого заболевания и усовершенствовать национальную систему предупредительных мер для уменьшения риска контаминации продуктов патогенами рода Campylobacter, снизить уровни инфекционной заболеваемости населения.
В связи с изложенным целью исследования являлось изучение фенотипических профилей антибиотикорезистентности штаммов Campylobacter spp., выделенных из птицепродуктов и объектов внешней среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности.
В задачи исследования входило проведение скрининговых исследований по выделению возбудителей кампило-бактериоза из продуктов, полуфабрикатов и объектов внешней среды предприятий птицеперерабатывающей промышленности, определение чувствительности выделенных штаммов Campylobacter spp. к расширенному спектру антимикробных препаратов различных фармакологических групп.
Материал и методы
Отбор образцов и подготовку проб к посевам проводили стандартизованными и общепринятыми в пищевой микробиологии методами по ГОСТ 31904-2012 и ГОСТ 26669-85. Для выделения штаммов рода Campylobacter использовали жидкие и плотные питательные среды (бульон и агар Престона, бульон для бруцелл, модифицированный угольный агар с дезоксихолатом натрия, кровяной агар) ("Merck", "HiMedia"); алгоритм посевов и учет результатов выполнены в соответствии с МУК 4.2.2321-08 и ГОСТ ISO 10272-1-2013. Загрязненность пищевых продуктов кампилобактерами оценивали в сопоставлении с наличием в исследуемых образцах санитарно-показательных микроорганизмов -индикаторов гигиены производства (бактерий группы кишечной палочки - БГКП) и патогенных бактерий рода Salmonella [16]. Определение БГКП и сальмонелл проводили по ГОСТ 31747-2012 и ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002).
Профили антибиотикорезистентности культур определяли дискодиффузионным методом в чашках Петри на агаре Мюллера-Хинтона с дефибринированной кровью (рис. 1) с использованием дисков с антибиотиками ("Oxoid", Великобритания), в соответствии с методикой Европейского комитета по тестированию антимикробной чувствительности (EUСAST), 2015 [17] и МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". В работе были использованы диски с антибиотиками эритромицином (15 мкг), ципрофлоксацином (5 мкг), налидиксовой кислотой (30 мкг), ампициллином (10 мкг), гентамицином (10 мкг), канамицином (5 мкг), амикацином (30 мкг), тетрациклином (30 мкг), окситетрациклином (30 мкг), доксициклином (30 мкг), клиндамицином (2 мкг), линкомицином (15 мкг), хлорамфениколом (30 мкг), флорфениколом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Результаты интерпретировали путем сопоставления величин диаметров зон ингибиции роста культур с пограничными значениями этих параметров. В качестве контроля использовали чувствительные штаммы E. coli АТСС 25922 и C. jejuni 53к, который был выделен ранее из охлажденных птицепродуктов.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05. Расчеты проводили с помощью пакетов программ Excel 2010 и SPSS 18.0.
Результаты и обсуждение
Сопоставление данных о наличии в исследованных образцах различных групп контаминантов показывает, что бактерии рода Campylobacter обнаруживаются преимущественно в сырых птицепродуктах и смывах с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий (33 положительные пробы из 110 исследованных образцов). Характеристики проб, из которых были выделены и идентифицированы штаммы Campylobacter spp., приведены в табл. 1. В большинстве случаев кампилобактеры выделяли из образцов, обсемененных колиформными бактериями (свыше 65% проб), при этом патогенные энтеробактерии рода Salmonella обнаруживали в 17% этих проб. Среди образцов, в которых отсутствовали кампилобактерии (отрицательные пробы), частота обнаружения сальмонелл не превышала 7%, при этом индикаторные группы санитарно-показательных организмов выявляли в основном в пределах установленных нормативов. Это указывает на общую закономерность контаминации кампилобактерами сырья и пищевых продуктов при недостаточной эффективности санитарной обработки отдельных участков производства.
Выделенные штаммы Campylobacter по основным фенотипическим признакам были отнесены к видам C. jejuni (83,7%), также 3 штамма были идентифицированы как С. coli, С. upsaliensis и С. lari, 6 культур не удалось отнести к известным видам кампилобактеров, а потому они были идентифицированы как нетипичные представители рода Campylobacter. Все выделенные штаммы были каталазо- и оксидазоположительными, не росли при температуре ниже +25 °С, утилизировали гиппурат (C. jejuni), редуцировали нитраты до нитритов, не продуцировали сероводород, были устойчивы к цефалотину и характеризовались типичными морфологическими признаками (грамотрицательные спиралевидные подвижные палочки).
Для оценки распространенности антибиотикорезистентных штаммов Сampylobacter проведен скрининг чувствительности выделенных культур к клинически значимым антимикробным препаратам. Всего исследовано 55 штаммов C. jejuni, выделенных из сырых птицепродуктов и смывов с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий.
Основой для выбора антимикробных препаратов (АМП), подлежащих включению в исследование, являются данные о природной чувствительности отдельных видов микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков. Перечень препаратов, выбранных в соответствии с рекомендациями EUCAST в отношении представителей рода Campylobacter [16], приведен в табл. 2. При этом рекомендуемый EUCAST перечень АМП был дополнен некоторыми антибиотиками других фармакологических групп с широким спектром действия с учетом рекомендаций ЦНИИ эпидемиологии по определению чувствительности кампило-бактерий [18].
Основываясь на этих критериях, было проведено изучение фенотипических профилей антибиотикорезистентности выделенных штаммов Сampylobacter spp.; всего в эксперименте было использовано 15 АМП 8 фармакологических групп (хинолонов, макролидов, аминогликозидов, тетрациклинов, фениколов, линкозамидов, пенициллинов, цефалоспоринов).
Результаты определения антибиотикочувствительности штаммов C. jejuni, выделенных из различных образцов птицепродуктов и объектов внешней среды птицеперерабатывающих предприятий, приведены в табл. 3.
Все выделенные штаммы были устойчивы к цефалотину, что подтверждает их принадлежность виду C. jejuni, данный показатель входит в тест-наборы для биохимической идентификации кампилобактерий API Campy ("БиоМерье", Франция). Практически все выделенные культуры C. jejuni были чувствительны к АМП групп фениколов и линкозамидов. Число штаммов кампилобактерий, устойчивых к этим лекарственным средствам, не превышало 9,1%.
Почти 90% культур C. jejuni были нечувствительны к налидиксовой кислоте, что свидетельствует об усилении этого признака резистентности среди "пищевых" изолятов кампилобактерий и снижении информативности данного теста, традиционно используемого в стандартных схемах видовой идентификации Campylobacter spp. Выявленная закономерность установлена также исследователями ряда стран Евросоюза и Юго-Восточной Азии при проведении мониторинга антибиотикорезистентности кампилобактеров, контаминирующих пищевые продукты [19-21].
Большинство выделенных культур были также устойчивы к ципрофлоксацину - основному представителю группы фторхинолонов (96,3%), который ранее широко применялся в составе ветеринарных лекарственных средств, а затем вследствие приобретения кампилобактерами признака резистентности практически утратил терапевтическое назначение. Это подтверждает данные, полученные ранее для штаммов C. jejuni, выделенных из птицепродуктов, частота устойчивости к ципрофлоксацину у которых составляла 95% [22], а также показывает отсутствие положительной динамики снижения резистентности к данной группе антимикробных препаратов и, по всей видимости, отсутствие эффективных мер противодействия ей в птицеперерабатывающей промышленности страны.
Наиболее известные в России антибиотики тетрациклиновой группы также оказывали слабое воздействие на Campylobacter spp.: 88,6% пищевых изолятов C. jejuni обладали устойчивостью к тетрациклину, окситетрациклину и доксициклину, не подавляя рост микробных популяций при тестировании штаммов дискодиффузионным методом (рис. 2).
Антибиотик эритромицин из группы макролидов имеет большое значение при лечении кампилобактериозных инфекций, поскольку до недавнего времени считалось, что бактерии рода Campylobacter не обладают генетически закрепленной устойчивостью к этому АМП, резистентность к эритромицину может возникать в результате мутаций в рибосомных РНК. Трансмиссивная плазмидная резистентность к эритромицину была впервые описана лишь в 2014 г. при исследовании штаммов Campylobacter, выделенных в Китае от продуктивных животных и птиц, при этом уровень резистентности достигал очень высоких значений 512 мг/л [23, 24].
В данном эксперименте было выделено 17 штаммов C. jejuni, устойчивых к эритромицину, что составляет 34% от общего числа выделенных культур. Это существенно превышает уровни антибиотикорезистентности к макролидам, выявляемые в настоящее время в ряде стран Евросоюза: 5,9-14,5% штаммов Campylobacter, выделенных из бройлеров, были микробиологически резистентны к эритромицину [5]. Полученные данные свидетельствуют о необходимости оценки ситуации с применением эритромицина в птицеводстве, а также исследований генетической природы резистентности.
Мультирезистентность возбудителей кампилобактериоза является предметом специальных исследований, направленных на изыскание эффективных способов лечения этого зоонозного заболевания у людей. Штаммы C. jejuni считаются мультирезистентными, если они проявляют устойчивость одновременно к 3-4 и более АМП разных фармакологических групп.
Следует отметить, что в данном эксперименте среди антибиотикорезистентных штаммов C. jejuni преобладали изоляты, устойчивые к действию АМП нескольких фармгрупп. В изученной выборке 65,5% штаммов C. jejuni обладали мультирезистентностью к 3-7 антибиотикам различных групп, в том числе 40% культур -к 4 антибиотикам и более. Выявлено 5 полирезистентных штаммов, одновременно устойчивых к 6-8 видам АМП. Такая мультирезистентность может объясняться наличием у C. jejuni разных путей и механизмов формирования защитных свойств к неблагоприятным воздействиям в присутствии тех или иных АМП. Распределение штаммов C. jejuni по профилям резистентности к различным группам антибиотиков приведено в табл. 4.
Кроме того, эти данные свидетельствуют о прогрессировании мультирезистентности у пищевых изолятов за короткий временной период, поскольку в более ранних исследованиях [22] частота резистентности к трем и более антибиотикам у C. jejuni составляла в 2 раза меньшую величину (30%).
Высокий уровень мультирезистентности выделенных штаммов C. jejuni свидетельствует об интенсивных процессах формирования генетически закрепленных признаков изменчивости, что сопровождается появлением толерантных популяций кампилобактеров и усилением их патогенного потенциала в условиях повсеместного применения антимикробных средств в медицине, ветеринарии и животноводстве.
Заключение
Изучены фенотипические профили антибиотикорезистентности 55 штаммов C. jejuni, выделенных из сырых птицепродуктов и смывов с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий. Определена чувствительность выделенных штаммов к 15 антимикробным препаратам 8 фармакологических групп (эритромицину, ципрофлоксацину, налидиксовой кислоте, ампициллину, гентамицину, канамицину, амикацину, тетрациклину, окситетрациклину, доксициклину, клиндамицину, линкомицину, хлорамфениколу, флорфениколу и цефотаксиму) дискодиффузионным методом. Все выделенные штаммы были устойчивы к цефалотину, что соответствует признаку, характерному для вида С. jejuni. Почти 90% культур были нечувствительны к налидиксовой кислоте, что свидетельствует об усилении этого признака резистентности среди "пищевых" изолятов кампилобактерий и снижении информативности данного теста, традиционно используемого в стандартных схемах видовой идентификации Саmpylobacter spp. Большинство исследованных культур были устойчивы к ципрофлоксацину (96,3%), 88,6% штаммов также обладали устойчивостью к тетрациклину, 34% -к эритромицину; 40% выделенных штаммов C. jejuni были мультирезистентны к 4 антибиотикам и более. Полученные данные свидетельствуют не только о высокой распространенности антибиотикорезистентных штаммов среди кампилобактерий, контаминирующих птицепродукты в процессе производства и переработки сырья, но и об усилении этой тенденции в последние годы.
Результаты проведенных исследований подтверждают необходимость дальнейшего изучения процессов формирования антибиотикорезистентности Campylobacter jejuni, основанного на определении генетических профилей и внутриклеточных механизмов экспрессии других факторов патогенности.
Исследование выполнено за счет гранта
Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).
Литература
1. CAC/GL 78-2011. Guidelines for the control of Campylobacter and Salmonella in chicken meet. URL: http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/standards/
2. Тазалова Е.В. Чувствительность кампилобактерий к антибиотикам и некоторые механизмы формирования антибиотикоре-зистентности // Дальневосточ. мед. журн. 2012. № 3. С. 120-123. URL: http://www.fesmu.ru/dmj/20123/2012336.aspx
3. Engberg J., Aarestrup F.M., Taylor D.E. et al. Quinolone and macro-lide resistance in Campylobacter jejuni and C. coli: resistance and trends in human isolates // Emerg. Infect. Dis. 2001. Vol. 7, N 1. P. 24-34.
4. McDermott P.E., Bodeis S.M., English L.L., White D.G., Wagner D.D. High-level ciprofloxacin MICs develop rapidly in Campylobacter jejuni following treatment of chickens with sarafloxacin // American Society for Microbiology, 101st Annual Meeting, Orlando, Florida. Washington, DC : ASM Press, 2001. P. 742. Abstract Z-20.
5. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2014 // EFSA J. 2016. Vol. 14, N 2. Article ID 4380. URL: www.efsa.europa.eu/efsa-journal.
6. Kohanski M., Dwyer D., Collins J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks // Nat. Rev. Microbiol. 2010. Vol. 8, N 6. P. 423-435.
7. Spratt B. Resistance to antibiotics mediated by target alterations // Science. 1994. Vol. 264, N 5157. P. 388-393.
8. Franz C.M.A.P., Holzapfel W.H. Enterococci // Emerging Foodborne Pathogens / eds Y. Motarjemi, M. Adams. Cambridge : Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC, 2006.
9. Poehlsgaard J., Douthwaite S. The bacterial ribosome as a target for antibiotics // Nat. Rev. Microbiol. 2005. Vol. 3, N 11. P. 870-880.
10. Li X.-Z., Nikaido H. Efflux mediated resistance in bacteria: an Update // Drugs. 2010. Vol. 69, N 12. P. 1555-1623.
11. Nikaido H. Preventing drug access to targets: cell surface permeability barriers and active efflux in bacteria // Semin. Cell Dev. Biol. 2001. Vol. 12, N 3. P. 215-223.
12. Thakur S., Gebreyes W.A. Campylobacter coli in swine production: antimicrobial resistance mechanisms and molecular epidemiology //J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43, N 11. P. 5705-5714.
13. Jeon B., Muraoka W., Scupham A., Zhang Q. Roles of lipooligosaccharide and capsular polysaccharide in antimicrobial resistance and natural transformation of Campylobacter jejuni // J. Antimicrob. Chemother. 2009. Vol. 63, N 3. P. 462-468.
14. Zhang Q., Plummer P.J. Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter jejuni // Campylobacter / eds I. Nachamkin, C.M. Szymanski, M.J. Blaser. Washington, DC : ASM Press, 2008. P. 263-276.
15. Alfredson A.D., Korolik V. Antibiotic resistance and resistance mechanisms in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli //FEMS Microbiol. Lett. 2007. Vol. 277, N 2. P. 123-132.
16. Ефимочкина Н.Р., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Минаева Л.П., Пичугина Т.В., Маркова Ю.М. и др. Изучение характера контаминации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 5. С. 66-73.
17. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 5.0, January. 2015.
18. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных микроаэрофильными изогнутыми бактериями : пособие для врачей ЦНИИ эпидемиологии. М., 2002.
19. Padungtod P., Kaneene J.B., Hanson R., Morita Y., Boonmar S. Antimicrobial resistance in Campylobacter isolated from food animals and humans in northern Thailand // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006. Vol. 47, N 2. P. 217-225.
20. Fraqueza M.J., Martins A., Borges A.C. et al. Antimicrobial resistance among Campylobacter spp. strains isolated from different poultry production systems at slaughterhouse level // Poult. Sci. 2014. Vol. 93, N 6. P. 1578-1586.
21. Rahimi E., Momtaz H., Ameri M., Ghasemian-Safaei H., Ali-Kasemi M. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter species isolated from chicken carcasses during processing in Iran // Poult. Sci. 2010. Vol. 89, N 5. P. 1015-1020.
22. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н., Пискарева И.И. Загрязненность пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. № 6. С. 38-44.
23. Qin S., Wang Y., Zhang Q., Deng F., Shen Z., Wu C. et al. Report of ribosomal RNA methylase gene erm(B) in multidrug resistant Campylobacter coli // J. Antimicrob. Chemother. 2014. Vol. 69, N 4. P. 964-968. URL: http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkt492/
24. Wang Y., Zhang M., Deng F., Shen Z., Wu C., Zhang J. et al. Emergence of multidrug-resistant Campylobacter species isolates with a horizontally acquired rRNA methylase // Antimicrob. Agents Che-mother. 2014. Vol. 58, N 9. P. 5405-5412.