Воздействие наноразмерного диоксида кремния аморфного на усвояемость витаминов В1, В2 и В6 у крыс

Резюме

Аморфный диоксид кремния (SiO2) в виде наночастиц (НЧ) широко исполь­зуется в качестве пищевой добавки Е551, в том числе в составе обогащенных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище. Целью дан­ного исследования является оценка влияния перорального введения НЧ SiO2 на усвояемость и показатели обмена витаминов В1, В2 и В6 у лабораторных крыс. В работе использован аморфный SiO2 марки "Орисил-300" с размером первичных НЧ 20-60 нм по данным электронной, атомно-силовой микроскопии и динамического рассеяния света. Эксперимент проведен на 8 группах расту­щих крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 70-80 г численностью соответственно 7, 7, 10, 10, 12, 12, 14 и 16 особей. Животные 1,3, 4 и 5-й групп на протяжении всего эксперимента получали сбалансированный полусинтети­ческий рацион. Животные 2-й группы получали рацион с исключением витами­нов В1, В2 и В6 до выведения из опыта на 21-е сутки; животные 6, 7 и 8-й групп -такой же рацион с 1-х по 21-е сутки, а далее, до выведения из эксперимента, рацион, снабженный указанными витаминами группы В до 100% от нормы. С 22-х суток опыта и до выведения из эксперимента на 29-е сутки животные 3-й и 6-й групп получали внутрижелудочно через зонд деионизованную воду (плацебо), крысы 4-й и 7-й групп - водную суспензию SiO2 в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки, а 5-й и 8-й групп - 100 мг/кг в сутки. Суточную экскре­цию с мочой тиамина, рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты, содержание в печени и головном мозге витаминов В1 и В2 после проведения кислотно-фер­ментативного гидролиза определяли флуориметрически. Установлено, что крысы 2-й группы к 21-м суткам опыта значительно отставали в прибавке массы тела от животных 1-й группы и у них развился дефицит витаминов В1, В2 и В6 по изученным показателям обеспеченности. В группах с 6-й по 8-ю на 29-е сутки отмечали частичное восстановление витаминного статуса. Введение SiO2 животным 4-й и 5-й групп, нормально обеспеченным вита­минами группы В, не оказывало достоверного влияния ни на один из изучен­ных показателей витаминной обеспеченности по сравнению с 3-й группой. У животных 7-й и 8-й групп внутрижелудочное введение SiO2 приводило к увели­чению экскреции витаминов В1 и В2 с мочой и снижению их содержания в печени по сравнению с крысами 6-й группы. На показатели обеспеченности вита­мином В6 введение SiO2 воздействия не оказывало. Обсуждаются возможные причины неблагоприятного влияния НЧ SiO2 на обеспеченность витаминами В1 и В2 и на их повышенное вымывание из организма.

Ключевые слова:диоксид кремния, наночастицы, пищевые добавки, витамин В1, витамин В2, витамин В6, обеспеченность, риск

Вопр. питания. 2016. № 6. С. 72-79.

Наноразмерный аморфный диоксид кремния (SiO2), известный под торговыми марками "Аэросил", "Орисил" и др., используется в качестве пищевой добавки Е551. Спецификация JECFA на данную пище­вую добавку не содержит прямых указаний на размер ее частиц [1], вследствие чего природа данного ком­понента как наноматериала часто не декларируется изготовителем продукции. Согласно ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, аро­матизаторов и технологических вспомогательных средств" допускается использование Е551 в соста­ве таких видов пищевой продукции, как пряности (не более 30 г/кг), продукты, плотно обернутые фоль­гой (30 г/кг), продукты сухие порошкообразные, вклю­чая сахарную пудру (10 г/кг), сыры и их заменители (10 г/кг), соль и ее заменители (10 г/кг), ароматизаторы (50 г/кг), детские смеси (до 10 мг/кг), сухие инстантные каши для питания детей (до 2 г/кг). Аморфный SiO2 используется также в качестве вспомогательного компонента в большом числе биологически активных добавок к пище (БАД). Биологические свойства наночастиц (НЧ) SiO2, содержащихся в этой продукции, в настоящее время недостаточно изучены; имеются данные об их возможной токсичности при приеме с пищей [2-4].

Поскольку наноразмерный SiO2 имеет большую удель­ную площадь поверхности (более 175 м2/г, типично 300 или 380 м2/г, согласно ГОСТ 14922-77), для него характерна высокая адсорбционная способность в рас­чете на единицу массы. С учетом весьма низкой вса­сываемости НЧ SiO2 в кишке это создает возможность эффекта снижения биодоступности ряда микронутриентов в процессе их переваривания и всасывания за счет их адсорбции на этих НЧ. В частности это может быть характерно для водорастворимых витаминов группы В, присутствующих в БАД в свободном виде.

Целью данного исследования является оценка вли­яния наноразмерного аморфного SiO2 на усвояемость и показатели обмена витаминов В1, В2 и В6 при совмест­ном введении лабораторным крысам на фоне адекват­ной обеспеченности организма и при их сочетанном дефиците.

Материал и методы

В работе использован химически чистый SiO2 амор­фный пирогенный "Орисил-300" с частицами нанометрового размера, удельной площадью поверхности 300 м2/г, соответствующий ГОСТ 14922-77. Продукт представлял собой рыхлый белый порошок, легко дис­пергируемый в воде под действием ультразвука с образованием стабильного прозрачного опалесцирующего коллоидного раствора. Характеристика этой формы SiO2 как наноматериала методами трансмиссионной элек­тронной и атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния была дана ранее [5].

В эксперименте использованы всего 88 растущих крыс-самцов линии Вистар c исходной массой тела 70-80 г, полученных из питомника "Столбовая". Живот­ные были разделены на 8 групп (1-8-я группы) общей численностью соответственно 7, 7, 10, 10, 12, 12, 14 и 16 особей.

Крыс содержали по 3 особи в клетке из полипропи­лена при 12/12-часовом режиме освещения и неограни­ченном доступе к воде. Животные 1, 3, 4 и 5-й групп на протяжении всего эксперимента получали сбалансиро­ванный полусинтетический рацион, соответствующий AIN-76. Животные 2-й группы получали с 1-х суток и до выведения из эксперимента такой же рацион, из кото­рого были исключены витамины В1 (в форме тиамин-пирофосфата), В2 (рибофлавин) и В6 (пиридоксин гид­рохлорид); животные 6, 7 и 8-й групп - такой же рацион с 1-х по 21-е сутки опыта, а далее, до выведения из эк­сперимента, рацион, снабженный указанными формами витаминов группы В до 100% от нормы [6]. Доза каждого из трех витаминов группы В при этом составила 6,75 мг на 1 кг массы сухих веществ рациона.

Начиная с 22-х суток опыта и до выведения из экс­перимента животные 3-й и 6-й групп получали внутрижелудочно через зонд деионизованную воду (плацебо), крысы 4-й и 7-й групп - водную суспензию SiO2, обрабо­танную ультразвуком (частота - 44 кГц, время - 5 мин, мощность - 2 Вт/см3, температура +2 оС) в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки в расчете на SiO2, а крысы 5-й и 8-й групп - такую же суспензию в дозе 100 мг/кг в сутки. В ходе эксперимента крыс ежесуточно взве­шивали на электронных весах с точностью ±1 г, фик­сировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, осо­бенности поведения.

Животных 1-й и 2-й групп выводили из эксперимента на 22-е сутки опыта, а 3-8-й групп - на 29-е сутки путем обескровливания под эфирной анестезией. За 1 сут до этого проводили сбор суточной мочи в обменных клет­ках. Отбирали образцы ткани печени для определения содержания витаминов. Массу внутренних органов оп­ределяли на аналитических весах с точностью ±0,1 г.

Содержание в моче тиамина [7], рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты (4-ПК) [8] определяли флуориметрически. Содержание в печени и головном мозге витаминов В1 и В2 после проведения кислотно-ферментативного гидролиза определяли флуориметрически согласно [9].

Статистическая обработка результатов измерений включала построение вариационного ряда, расчет вы­борочного среднего (М), стандартной ошибки (m), проверку гипотезы о совпадении выборочных средних с использованием t-критерия Стьюдента, гипотезы об однородности распределения с использованием кри­терия one-way ANOVA, гипотезы о совпадении распре­деления выборок по группам с помощью непараметри­ческого критерия Манна-Уитни. Различия принимали достоверными на уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Как следует из данных рис. 1 и 2, к 22-м суткам пре­бывания животных 2-й группы на рационе с исключени­ем витаминов В1, В2 и В6 у них развивались признаки дефицита этих витаминов, состоящие в достоверном (Р1-2<0,05) отставании в прибавке массы тела от жи­вотных 1-й группы, снижении экскреции рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты (4-ПК) с мочой, содер­жания витамина В1 в печени, витаминов В1 и В2 в го­ловном мозге. Помимо этого у животных 2-й группы по сравнению с крысами 1-й группы отмечались дис­пропорции в относительной массе печени (1-я группа -3,52±0,20%, 2-я группа - 4,23±0,19%), почек (0,92±0,05 и 0,75±0,02% соответственно) и головного мозга (1,29±0,06 и 0,98±0,04% соответственно); р1-2<0,05 во всех случаях. Таким образом, пребывание крыс на рационе с исключением 3 витаминов группы В приводило в течение 21 сут к развитию выраженных симптомов их недостаточности (дефицита).

Как следует из данных рис. 3, крысы 6-8-й групп, также получавшие в течение 21 сут витаминдефицитный рацион, характеризовались таким же отставанием в прибавке массы от животных с 3-й по 5-ю группу, что и крысы 1-й группы от 2-й группы. Однако дальнейшее введение им на протяжении 7 сут добавки этих витами­нов приводило к быстрому увеличению скорости роста. Тем не менее отставание в массе тела от животных групп, получавших сбалансированный рацион, сохра­нялось (р3_6;4_7;5_8<0,05 на 8, 15, 21 и 28-е сутки опыта). Помимо этого, у животных 6 -8-й групп по сравнению с крысами 3-5-й групп к 29-м суткам сохранялись дис­пропорции в массе печени, почек и головного мозга, аналогичные тем, что имели место у животных 2-й груп­пы по сравнению с крысами 1-й группы (p3_6;4_7;5_8 в<0,05 на 29-е сутки опыта).

На рис. 4 и 5 приведены показатели, характеризую­щие состояние обмена витаминов группы В (экскреция с мочой и содержание в печени) у крыс с 3-й по 8-ю группу по завершении эксперимента, в зависимости от дозы потребляемого SiO2. Как видно из представлен­ных данных, введение SiO2 животным 4-й и 5-й групп, нормально обеспеченным витаминами группы В на протяжении всего эксперимента, не оказывало досто­верного влияния ни на один из изученных показателей витаминной обеспеченности по сравнению с животны­ми 3-й группы, получавшими путем зондового введения плацебо (деионизованную воду). В отличие от этого у животных 7-й и 8-й групп, которые испытывали де­фицит витаминов группы В в первые 21 сут, а далее получали их в количестве около 100% от нормы, внутрижелудочное введение SiO2 приводило к достоверным сдвигам в показателях витаминной обеспеченности по сравнению с крысами 6-й группы, находившимися на том же рационе, но получавшими внутрижелудочно плацебо. В случае витамина В1 отмечалось достовер­ное усиление его экскреции с мочой как при низкой, так и при высокой дозе вводимого наноматериала (p6-7,7-8<0,05) и достоверное снижение его содержания в печени при высокой дозе SiO2 (p6-8<0,05). Такая же картина наблюдается и для экскреции и содержания в печени витамина В2, за исключением того, что при низкой дозе наноматериала увеличение его экскреции оказывается недостоверным. На показатель обеспе­ченности витамином В6 (экскреция 4-ПК) внутрижелудочное введение SiO2 достоверного воздействия не оказывало. Не выявлено также никакого влияния приема SiO2 на содержание витаминов В1 и В2 в головном мозге, независимо от типа применявшегося рациона (данные не показаны).

Как следует из результатов эксперимента, внутри-желудочное введение крысам наноразмерного SiO2 приводит к таким изменениям показателей обеспе­ченности и экскреции витаминов В1 и В2, которые можно интерпретировать как повышенное вымывание этих витаминов из организма на фоне пищевого вос­становления их предварительно нарушенной обеспе­ченности. Предположение о том, что наноразмерный SiO2 препятствует кишечной абсорбции этих нутриентов, не подтверждается полученными эксперимен­тальными данными, поскольку в этом случае, напро­тив, следовало бы ожидать, снижения их экскреции с мочой. Одним из объяснений данного явления может быть токсическое действие НЧ SiO2 на почки животных, следствием чего могла стать нарушенная реабсорбция обоих витаминов в почечных канальцах. Сочетание увеличенной экскреции витаминов группы В с мочой и сниженных системных показателей их обеспечен­ности ранее наблюдали у детей с дисметаболическими нефропатиями [10]. Однако в случае с животными, подвергнутыми пероральному воздействию наноразмерного SiO2, токсическое воздействие на почки, по-видимому, маловероятно ввиду отсутствия изменений в интегральных показателях (массе органа) и марги­нальных, находящихся в пределах нормы для животных данной линии, пола и возраста, сдвигах в показате­лях уровня мочевины, мочевой кислоты и креатинина в крови при дозе наноматериала вплоть до 100 мг на 1 кг массы тела [5, 11]. В работе [2] не установлено гистопатологических изменений в почках крыс, получавших НЧ аморфного SiO2 в течение 84 сут в очень высоких дозах (до 2500 мг на 1 кг массы тела).

Альтернативное объяснение выявленных эффектов может состоять в ускорении процессов обмена вита­минов группы В на системном уровне у животных, получавших наноразмерный SiO2. Согласно имеющимся в литературе данным [2], небольшие количества НЧ аморфного SiO2, поступающего с пищей, могут вса­сываться в кишечнике и накапливаться во внутренних органах, в частности в печени. Как показали дан­ные подострого 92-суточного эксперимента по включению аморфного наноразмерного SiO2 в рацион крыс, этот компонент мог оказывать системное токсичес­кое воздействие на организм, маркерами которого являлись общее содержание цитохрома Р450 печени, активности некоторых его изоформ, а также глутатионтрансферазы и лизосомальных арилсульфатаз [11]. Наблюдались сдвиги в состоянии Т-клеточного звена иммунитета, состоящие в повышении числа цитотоксических Т-клеток при снижении количества Т-хелперов, резком возрастании продукции фактора некроза опухолей α [4]. Последний, как известно, наряду со мно­жеством иммунорегуляторных функций оказывает вы­раженный прямой катаболический эффект в отношении клеток скелетных мышц и жировой ткани [12]. Развитие катаболической реакции может сопровождаться уско­рением процессов окисления углеводов, аминокислот и жирных кислот, что сопровождается функциональным напряжением ферментных систем энергетического об­мена и дыхательной цепи, ключевыми компонентами которых являются тиаминзависимые ферменты и флавиновые оксидоредуктазы. Следствием этого может быть интенсификация метаболизма витаминов В1 и В2, что отражается в снижении их стационарного уровня в печени и усилением их вымывания из организма. При­мечательно, что эти эффекты наглядно проявляются у животных с нестабильным уровнем обеспеченности этими витаминами на фоне их алиментарного восста­новления после развившегося дефицита, но не у крыс, нормально обеспеченных ими на протяжении всего эксперимента.

Что же касается отсутствия увеличения экскреции 4-ПК у животных, получавших SiO2, это может быть следстви­ем повышенного в 7-й и 8-й группах выведения из орга­низма рибофлавина, что приводило к относительному ухудшению обеспеченности витамином В2 по сравнению с 6-й группой, получавшей плацебо. Известно, что коферментные формы витамина В2 участвуют в метаболизме пиридоксина. В частности ФМН-зависимая пиридоксам ин(пиридоксин)фосфатоксидаза превращает пиридоксамин в пиридоксальфосфат, ФАД-зависимая альдегидоксидаза окисляет пиридоксаль до 4-ПК, экскретируемой с мочой. Ранее подобный эффект у крыс наблюдали при алиментарном дефиците витамина В2 [13-15].

Таким образом, показатели, характеризующие обмен витаминов В1 и В2 в организме, являются чувстви­тельными маркерами токсического действия НЧ SiO2 в условиях развивающегося дефицита и последующего алиментарного восстановления обеспеченности орга­низма этими витаминами. Потребление НЧ SiO2 приводит к снижению показателей обеспеченности витамина­ми В1 и В2 и усилением их вымывания из организма. С учетом известных данных о том, что дефицит вита­минов группы В, в частности рибофлавина, может по­вышать чувствительность организма к разнообразным токсическим воздействиям [16], поступление с пищей НЧ SiO2 на фоне этого алиментарного дефицита может рассматриваться как источник агрегированного риска здоровью.

Литература

1. Silicon Dioxide, Amorphous. Rome : JECFA, 1973-1992. 2 p. URL: http://www.fao.org/food/food-safety-quality/scientific-advice/jecfa/jecfa-additives/en/.

2. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Groot M.J., Kramer E. et al. Subchronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica // Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 8.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного мето­дом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 65-72.

4. Шумакова А.А., Ефимочкина Н.Р., Минаева Л.П., Быкова И.Б. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. III. Микроэкологические, гематологические показатели, состояние системы иммунитета // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 55-65.

5. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Кошелева О.В. и др. Эффективность разных доз витаминов для коррекции полигиповитаминоза у крыс // Бюл. экспер. биол. 2014. Т. 157, № 5. С. 626-629.

7. Коденцова В.М., Сокольников А.А. Исаева В.А. Сравнительная оценка биохимических критериев обеспеченности организма тиамином // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 3. С. 50-53.

8. Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А. и др. Методы оценки витаминной обеспеченности населения. М. : ПКЦ "Альтекс", 2001. 68 с.

9. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б, Алексеева И.А. и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. 1994. Т. 63, № 6. С. 9-12.

10. Гордеева Е.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Харитончик Л.А. и др. Обеспеченность витаминами В2 и В6 детей с дизметаболическими нефропатиями: патогенетическая роль дефицита // Вопр. соврем. педиатрии. 2004. Т. 3, № 6. С. 32-34.

11. Шумакова А.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Кравченко Л.В. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния II. Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 4. С. 58-66.

12. Tisdale M.J. Catabolic mediators of cancer cachexia // Curr. Opin. Support Palliat. Care. 2008. Vol. 2, N 4. P. 256­261.

13. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Сокольников А.А., Бекетова Н.А. и др. Влияние обеспеченности рибофлавином на обмен водорастворимых витаминов // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 5. С. 29-33.

14. Коденцова В.М., Якушина Л.М., Вржесинская О.А., Бекето­ва Н.А. и др. Влияние обеспеченности рибофлавином на метаболизм витамина В6 // Вопр. питания. 1993. № 5. С. 32­36.

15. Коденцова В.М. Экскреция с мочой витаминов и их метаболитов как критерий обеспеченности витаминами организма чело­века // Вопр. мед. химии. 1992. Т. 38, № 4. С. 33-37.

16. Pussa Т. Principles of Food Toxicology. 2nd ed. Boca Raton; London; New York : CRC Press, 2014. P. 55.