Модификация витаминно-минерального состава рационов как модель снижения адаптационного потенциала крыс для токсикологических исследований

Резюме

В статье представлены результаты исследований, направленных на разра­ботку модели снижения адаптационного потенциала крыс, предназначенной для токсикологических экспериментов. Две серии исследований длительностью ~70 дней каждая проведены на крысах линии Вистар: 1-я серия - на 5 группах животных, получавших рационы со 100, 75, 50, 25 и 0% содержанием витами­нов В1, В2, В3, В6, а также минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+; 2-я серия - на 4 группах животных, получавших рационы с 21,37; 9,94; 4,62; 2,15% содержанием соответствующих витаминов и минеральных веществ. В 1-й серии исследо­ваний были установлены интервалы максимального, среднего и минимального содержания эссенциальных микронутриентов в рационе; во 2-й серии определен диапазон минимально возможного содержания этих элементов, обеспечива­ющий наименьший уровень адаптационного потенциала и не вызывающий развития патологии. Был изучен целый ряд гематологических, биохимичес­ких, иммунологических и др. показателей, в данной статье проанализированы результаты зоометрических исследований, показатели смертности животных, а также результаты исследований антиоксидантного статуса (активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и содержание малонового диальдегида в эритроцитах). На основании анализа данных, полученных в эксперименте 1-й серии исследований, следует, что уменьшение дозы соответствующих эссенциальных веществ до 25% сущес­твенно не сказывалось на значениях изученных показателей, а полное исключе­ние этих веществ влекло за собой массовую гибель животных. В эксперименте 2-й серии исследований отмечены значимые различия между группами в диа­пазоне от повышенной смертности (группы с 2,15 и 4,62% содержанием эссенциальных микронутриентов) до отклонений значений некоторых показателей от центральной тенденции (группа с 21,37% содержанием), что позволило проследить зависимость этих различий от уровней содержания витаминов и минеральных веществ в рационе. На основании анализа полученных данных были определены пороговые значения содержания витаминов и минеральных веществ в рационе, обеспечивающие необходимое снижение уровня адапта­ционного потенциала у самцов и самок. С учетом степени риска развития патологии были установлены 3 дозировки эссенциальных веществ - опти­мальная, маргинальная и субмаргинальная, обеспечивающие последовательное снижение адаптационного потенциала у лабораторных животных: 75, 30 и 19% для самцов и 75, 28 и 18% для самок соответственно. Предложенная модифи­кация витаминно-минерального состава рационов может быть использована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологи­ческих исследованиях.

Ключевые слова:дефицит витаминов, адаптационный потенциал, витаминно-минеральный состав рационов, лабораторные животные, модельный эксперимент

Вопр. питания. 2016. № 6. С. 64-71.

В гигиенических исследованиях для выявления неблагоприятных воздействий на организм широко используются биомаркеры, такие как система антиоксидантной защиты, система ферментов метаболизма ксенобиотиков, ферменты мембран лизосом, иммунная система и др., составляющие основу адаптационного потенциала. При изучении малотоксичных объектов или объектов с неизвестной токсичностью, например новых видов пищевой продукции, полученных в том числе с использованием современных биотехнологий, такие исследования наиболее актуальны и необходимы для выявления возможного неблагоприятного действия анализируемого продукта. Как правило, прямого выра­женного влияния выявить не удается, поэтому одним из дополнительных подходов являются так называемые нагрузочные пробы, направленно снижающие адапта­ционный потенциал [1-3].

Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является модификация состава рациона [1, 2, 4-7]. Состав полусинтетического казе­инового рациона (ПКР), традиционно используемого в исследованиях по оценке безопасности новых видов пищевой продукции, учитывает все физиологические потребности крыс в пищевых веществах и включает в себя казеин, кукурузный крахмал, свиной жир и под­солнечное масло в качестве источников белка, углево­дов и жиров, витаминную и минеральную смеси. Имен­но витаминная и минеральная смеси представляются наиболее простыми и удобными компонентами рациона для формирования необходимых уровней адаптацион­ного потенциала у крыс.

Для целей данного исследования была выбрана мо­дель дефицита минеральных веществ - железа (Fe3+) и магния (Mg2+), и витаминов группы В - тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пиридоксина (В6), био­логическая роль которых определяет состояние адап­тационного потенциала [8-15]. В частности железо входит в состав цитохромов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, а также в состав каталазы - одного из ключевых ферментов системы антиоксидантной за­щиты [16]. Магний, входящий в состав кофакторов более 350 ферментов, регулирует окислительные про­цессы и выработку целого ряда цитокинов и других гуморальных факторов [17, 18], витамины группы В, являющиеся кофакторами оксидоредуктаз, обеспечи­вают энергией все биохимические процессы в организ­ме, в том числе процессы поддержания антиоксидан­тного статуса, составляющего основу адаптационного потенциала [12, 16].

Целью данного исследования стало определение маргинальных уровней этих эссенциальных веществ в рационе, с одной стороны, обеспечивающих физио­логические потребности экспериментальных животных, с другой стороны, снижающих адаптационный потен­циал и, как следствие, повышающих чувствительность к токсическому воздействию.

Материал и методы

Эксперименты длительностью -70 дней каждый про­водили на крысах линии Вистар. Исходная масса тела самцов составила 77-90 г, самок - 71-80 г; возраст ~30 дней.

Проведены 2 серии исследований: 1-я серия -на 5 группах животных, получавших рационы со 100, 75, 50, 25 и 0% содержанием витаминов В1, В2, В3, В6, а также минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+ (1-5-я груп­пы соответственно); 2-я серия - на 4 группах животных, получавших рационы с 21,37, 9,94, 4,62, 2,15% содер­жанием соответствующих витаминов и минеральных веществ (6-9-я группы соответственно). Эксперимен­тальные рационы, представляющие собой полусинте­тический казеиновый рацион [19, 20] с модифицирован­ным составом витаминно-минеральных смесей (табл. 1), крысы получали на протяжении всего срока исследований. Всего в экспериментах были использованы 220 самок и 220 самцов крыс линии Вистар (100+100♀ в 1-й серии, 120+120♀ во 2-й серии).

Крыс содержали в пластиковых клетках (в каждой по 2 особи) с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. В течение экспериментов вели на­блюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, пост-мортальную некропсию и отбор материала для иссле­дований у животных 1-4-й и 6-7-й групп проводили на 70-й день экспериментов, соответствующий стадии взрослого половозрелого организма, характеризую­щегося стабильными физиолого-биохимическими по­казателями (~100-й день жизни животных). Животные 5-й группы были подвергнуты эвтаназии на 56-й день эксперимента в связи с началом массовой гибели живот­ных, при этом из-за невозможности отбора необходимого для исследований количества крови (низкая масса тела и высокая свертываемость крови) у крыс этой группы не были определены показатели, материалом для исследо­вания которых являлась кровь. Умершие животные были подвергнуты постмортальной некропсии для определе­ния причин смерти. Животные 8-9-й групп также были подвергнуты эвтаназии на 56-й день эксперимента.

В 1-й серии исследований были установлены интер­валы максимального, среднего и минимального содер­жания в рационе соответствующих эссенциальных нутриентов; во 2-й серии определен диапазон минимально возможного содержания этих веществ, обеспечиваю­щий наименьший уровень адаптационного потенциала и не вызывающий развития патологии (в данном слу­чае первыми симптомами развития патологии, которые можно было выявить при динамическом наблюдении за животными, являлись значительное снижение массы тела и впоследствии смертность животных).

Был изучен целый ряд показателей, включающий зоометрические, гематологические и биохимические показатели, показатели системы антиоксидантной защиты, показатели, характеризующие резистент­ность организма (бактерицидная и лизоцимная ак­тивность крови, содержание иммуноглобулинов и цитокинов), показатели, характеризующие активность процессов апоптоза, показатели, характеризующие гормональный статус, также проведены морфологические исследования внутренних органов. В данной статье проанализированы результаты зоометрических исследований, включая показатели динамики массы тела и поедаемости корма, показатели смер­тности животных, а также результаты исследований антиоксидантного статуса (активность ферментов системы антиоксидантной защиты эритроцитов -супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и содержание продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в гемолизатах эритроцитов (1:1) по [21]. Активность ферментов измеряли на биохимическом анализаторе StatFax1904+ ("Awareness Technology", США), содержание малонового диальдегида - на спек­трофотометре SmartSpec 3000 ("BioRad", США).

Полученные данные обработаны методами парамет­рической статистики: характер распределения коли­чественных признаков определен с помощью х2-критерия Пирсона, равенство дисперсий - с помощью F-критерия Фишера. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального рас­пределения и равенству дисперсии, оценена методом f-критерия Стьюдента. Критический уровень значи­мости (p) принят равным 0,05 [22-26].

При анализе выживаемости животных использовали Х2-критерий, в качестве нулевой статистической гипо­тезы принят F1(x)=F2(x), где Fi - функция распределения i-генеральной совокупности, из которой извлечена вы­борка.

Для характеристики стабильности изучаемых по­казателей было использовано понятие центральной тенденции (в качестве мер центральной тенденции применялись среднее арифметическое, среднее геомет­рическое, среднее гармоническое, мода, медиана).

Результаты и обсуждение

В 1-й серии исследований общее состояние крыс 1-4-й групп было удовлетворительным, по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению разницы между группами не отмечено. В течение первых 3 нед эксперимента динамика массы тела самцов 1-4-й групп не имела статистически значимых различий, начиная с 28-го дня масса тела самцов 1-2-й групп была до­стоверно выше (на 6-8%), чем у крыс 3-4-й групп. При этом поедаемость корма самцами 1-3-й групп была примерно одинаковой и составляла ~18-19 г/крысу в сутки, тогда как поедаемость корма самцами 4-й груп­пы была несколько ниже и составляла ~14-15 г/крысу в сутки. Масса тела самок 1-4-й групп не имела значимых различий между группами на протяжении всего экспе­римента, поедаемость корма составляла ~17-18 г/крысу в сутки.

Общее состояние крыс 5-й группы было неудовлетво­рительным, отмечены ухудшение качества шерстного покрова (облысения), склонность к кровотечениям (сли­зистые оболочки носа и глаз), снижение поедаемости корма (~10-12 г/крысу в сутки у самцов и ~11-13 г/крысу в сутки у самок). Начиная с 35-го дня эксперимента зафиксированы случаи гибели животных 5-й группы (к 56-му дню эксперимента смертность самцов состав­ляла 25%, самок - 30%). При проведении постмортальной некропсии выявлены патологические изменения, характерные для кахексии: истощение висцеральной и подкожной жировой ткани, атрофия всех групп ске­летных мышц, уменьшение размеров внутренних орга­нов и др. Масса тела самцов и самок 5-й группы была значительно ниже, чем масса тела крыс 1-4-й групп (на 14-й день исследований на 9-14%, на 56-й день -на 62-69% соответственно, p<0,05).

При изучении массы внутренних органов, гематоло­гических, биохимических показателей, а также пока­зателей системы антиоксидантной защиты был отме­чен ряд незначительных различий между группами, не выходящий за пределы физиологических колебаний, характерных для самцов и самок крыс линии Вистар данного возраста. Не выявлено явных закономерностей изменения оцениваемых параметров в зависимости от уровней содержания витаминов и минеральных ве­ществ в рационе, однако 4-я группа характеризова­лась большей нестабильностью центральной тенден­ции, причем у самцов она была более выражена, чем у самок.

На основании анализа данных, полученных в 1-й серии исследований, следует, что уменьшение дозы соответст­вующих эссенциальных веществ до 25% существенно не сказывалось на значениях изученных показателей, а полное исключение этих веществ влекло за собой массовую гибель животных. Полученные данные легли в основу дизайна эксперимента 2-й серии, предназна­ченного для выявления диапазона минимально воз­можного (от 0 до 25%) содержания в рационе витаминов и минеральных веществ, не приводящего к развитию патологии и обеспечивающего наименьший уровень адаптационного потенциала. Следует отметить, что при расчете дозировок витаминов и минеральных веществ в рационе в 1-й серии эксперимента был использован принцип линейной зависимости, тогда как во 2-й серии -принцип степенной зависимости (показательная функ­ция). Такой подход позволял при минимальном числе экспериментальных групп получить достаточное коли­чество информации, в том числе о влиянии сверхнизких дозировок на рост и развитие крыс. В качестве исходной точки расчета дозировок было использовано значе­ние, не превышающее 25% и являющееся четвертой степенью от наименьшего значения, которое должно было быть выше 1. Проведенный расчет позволил оп­ределить соответствующие крайние значения как 21,37 и 2,15% (21,37=2,154) и промежуточные значения как 4,62 и 9,94%, являвшиеся производными второй (2,152) и тре­тьей (2,153) степени от наименьшего показателя.

Во 2-й серии исследований общее состояние крыс 6-й и 7-й групп было удовлетворительным, по внешне­му виду, поведению и качеству шерстного покрова не выявлено разницы между группами. В течение первых 5 нед эксперимента динамика массы тела самцов и самок 6-й и 7-й групп не имела статистически значимых различий, начиная с 35-го дня масса тела крыс 6-й группы была достоверно выше (самцов - на 10%, самок - на 8%), чем у крыс 7-й группы (рис. 1а). Поедаемость корма самцами 6-й группы составляла ~19 г/крысу в сутки, самками - ~18 г/крысу в сутки, тогда как поедаемость корма крысами 7-й группы составляла ~16 г/крысу в сутки у самцов и самок.

Общее состояние крыс 8-й и 9-й групп было неудов­летворительным, отмечены ухудшение качества шерст­ного покрова, склонность к кровотечениям, снижение поедаемости корма: у самцов и самок 8-й группы этот показатель составлял ~14 г/крысу в сутки, 9-й группы -~12 г/крысу в сутки. Начиная с 45-го дня эксперимента зафиксированы случаи гибели животных 8-й группы (к 56-му дню эксперимента смертность самцов со­ставляла 30%, самок - 37%) и 9-й группы (56 и 53% соответственно). Масса тела крыс 8-й и 9-й групп была значительно ниже, чем у животных 6-й и 7-й групп (на 21-й день исследований более чем на 5%, на 56-й день - более чем на 40%, р<0,05) (рис. 1б).

При изучении результатов гематологических, биохи­мических и др. исследований был отмечен ряд значи­мых различий между группами, демонстрировавших явные закономерности отклонения от центральной тенденции в зависимости от уровней содержания вита­минов и минеральных веществ в рационе. Так, показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов эритроцитов проявляли линейные изменения (повышения концентрации) в ряду пониже­ния содержания эссенциальных веществ в рационах (табл. 2).

На основании полученных результатов была сфор­мирована графическая оценочная шкала "доза-риск" (рис. 2), которая была использована для определения пороговых значений витаминов и минеральных ве­ществ, обеспечивающих необходимое снижение уровня адаптационного потенциала у самцов и самок. При пос­троении графика были заданы следующие ключевые условия: уровень риска развития патологии выше 50% принимался в случае выявления достоверных различий выживаемости животных в группах (по критерию χ2) для данной дозы эссенциальных веществ, уровень риска от 50 до 25% - в случае выявления системных различий по ряду показателей, уровень риска менее 5% - в случае отсутствия системных различий (см. рис. 2).

Анализ графиков позволил определить пороговые значения содержания в рационе изученных веществ: их содержание в количестве менее 9% соответствовало уровню риска выше 50%, в количестве 9-12% - уровню риска от 50 до 25%, в количестве 13-24% - уровню риска выше 5%, в количестве выше 25% - уровню риска менее 5%.

С учетом степени риска развития патологии были уста­новлены 3 дозировки эссенциальных веществ, с опреде­ленной степенью условности обозначенные как оптималь­ная, маргинальная и субмаргинальная, обеспечивающие последовательное снижение адаптационного потенци­ала у лабораторных животных: 75, 30 и 19% для самцов и 75, 28 и 18% для самок соответственно.

Таким образом, предложенная модификация витамин-но-минерального состава рационов может быть исполь­зована в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой продукции.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 16-16-00124)

Литература

1. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. М. : Медицина, 1986. 280 с.

2. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М. : Медицина, 1975. 328 с.

3. Братусь А.С., Новожилов А.С., Платонов А.П. Динамические сис­темы и модели биологии. М. : Физматлит, 2010. 400 с.

4. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание обще­го адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 20-25.

5. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Микроэлементный и антиоксидантный статус крыс при полигиповитаминозе // Вопр. биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2013. Т. 11, № 2. С. 64-68.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окис­лительный стресс // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 3. С. 11-18.

7. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые пара­метры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

8. Коденцова В.М. Витамины. М. : МИА, 2015. 408 с.

9. Кравченко Л.В., Аксенов И.В., Трусов Н.В., Гусева Г.В. и др. Вли­яние поливитаминной недостаточности на активность фермен­тов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 2. С. 28-33.

10. Кукес В.Г., Ребров В.Г., Стародубцев А.К., Булаев В.М. и др. Вита­мины и микроэлементы в клинической фармакологии / под ред. В.А. Тутельяна. М. : Палея-М, 2001. 560 с.

11. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Суханов Б.П., Кудашева В.А. Микронутриенты в питании здорового и больного человека. М. : Колос, 2002. 424 с.

12. Human vitamin and mineral requirements. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Geneva : World Health Organization, 2004. 341 p

13. Guardia M. de la. Handbook of Mineral Elements in Food. Valencia, 2015. 792 p.

14. Frisancho R.A. Human Adaptation and Accommodation. Michigan : University of Michigan Press, 1993. 532 p.

15. Thimann K.V. Vitamins and Hormones. London : Academic Press, 1980. Vol. 37. 353 p.

16. Human vitamin and mineral requirements. Report of a Joint FAO/ WHO Expert Consultation. Bangkok : World Health Organization, 2001. 286 p.

17. Yang W., Lee J. Y., Nowotny M. Making and breaking nucleic acids: two-Mg2+-ion catalysis and substrate specificity // Mol. Cell. 2006. Vol. 22. P. 5-13.

18. Bobkowski W., Nowak A., Durlach J. The importance of magnesium status in the pathophysiology of mitral valve prolapse // Magnes. Res. 2005. Vol. 18, N 1. P. 35-52.

19. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

20. Benevenca N., Calvert C., Eckhert C. et al. Nutrient Requirements of Laboratory Animals. Washington : National Academy Press, 1995. 192 p.

21. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхожде­ния: Методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М. : Федераль­ный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

22. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. : Медиа Сфера, 2006. 312 с.

23. Scott I., Mazhindu D. Statistics for Health Care Professionals. London : SAGE Publications Ltd., 2005. 241 p.

24. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обра­ботка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

25. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии: руководство : в 2 т. / под ред. Ю.М. Комарова. Т. 1. Теоретическая статистика. М. : Медицина, 2000. 412 с.

26. Хромушкин В.А., Китанина К.Ю., Хромушкин О.В., Федоров С.Ю. Совершенствование алгоритма алгебраической модели конс­труктивной логики // Вестн. новых медицинских технологий. 2015. Т. 22, № 2. С. 11-19.