Изучение характера контаминации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции

РезюмеИзучен характер контаминации бактериями рода Campylobacter пищевых продуктов растительного и животного происхождения (птицепродукты сырые, мясо говяжье сырое, молоко сырое, салаты листовые, овощи резаные сырые) и объектов окружающей среды на предприятиях по их производству. Из 148 исследованных проб выделено 50 штаммов Campylobacter spp., 38 (75%) из которых по основным фенотипическим признакам идентифицированы как C. jejuni ssp. jejuni и C. jejuni ssp. doylei. Наиболее высокий уровень обнаружения возбудителей кампилобактериоза (свыше 45%) установлен для сырых птицепродуктов, включая тушки кур-бройлеров, индеек, перепелов и производимых из них полуфабрикатов. Из 27 штаммов, выделенных из птицепродуктов, 19 (70,4%) культур принадлежали виду C. jejuni. Среди штаммов, выделенных из объектов внешней среды, включая смывы с поверхностей оборудования, 91% изолятов были представлены видом C. jejuni. Установлено, что исследованные группы пищевой продукции характеризуются высокими уровнями контаминации бактериями семейства Enterobacteriaceaе: их содержание было сопоставимо с выявленным количеством мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов. Патогенные бактерии рода Salmonella обнаруживали в 19,0% исследованных образцов мяса птицы и в 14,3% проб сырого коровьего молока. При исследовании смывов с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий установлено, что частота обнаружения штаммов Campylobacter spp. составляла 38,7%, бактерий рода Salmonella - 12,9%; при этом наиболее часто кампилобактерии и сальмонеллы обнаруживали в смывах с поверхностей в цехах первичной обработки тушек птицы: частота выделения сальмонелл в цехах убоя составляла 25%, кампилобактерий - 43%. В смывах, отобранных в условиях пищеблоков сетевых предприятий быстрого питания, бактерии родов Campylobacter и Salmonella не обнаружены. Для исследования контаминации поверхностей оборудования бактериями рода Campylobacter разработана методика, включающая комплексное взятие смывов из исследуемой зоны и посев в 3 вида питательных сред для транспортирования и накопления искомых трудно культивируемых патогенов (бульон Престона с кровью, бульон для бруцелл, среда Кери-Блейра), повышающая вероятность их обнаружения на объектах внешней среды.

Ключевые слова:Campylobacter jejuni, пищевые продукты, птицепродукты, молоко, листовые салаты, резаные овощи, говядина сырая, смывы с поверхностей оборудования, микробная контаминация

Вопр. питания. 2016. № 5. С. 52-59.

Учитывая широкую распространенность в природе бактерий рода Campylobacter и разнообразие источ­ников их выделения, большое внимание на совре­менном этапе уделяется частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах, в том числе при выработке пищевых продуктов. Кампилобактеры присутствуют в окружающей среде как комменсалы или патогены в организме животных и могут персистировать длительное время при неблагоприятных условиях.

Бактерии рода Campylobacter все чаще регистриру­ются в качестве этиологического агента при массовых вспышках заболеваний, обусловленных потреблением недоброкачественной пищи и воды, а также в спо­радических случаях бактериальных гастроэнтеритов и диарей [1-3]. Наибольшее значение в возникновении пищевых инфекций имеют Campylobacter jejuni и C. coli, а в развивающихся странах эпидемически значимым также считается вид С. upsaliensis [4]. В настоящее время описано 27 видов в составе рода Campylobacter, однако в 85% случаев кампилобактериоза у людей этиологическим агентом заболевания является вид C. jejuni [4, 5]. Кампилобактериоз в большинстве случаев протекает с симптомами энтероколита и гастроэнтери­та, сопровождается диареей, абдоминальными болями, высокой температурой. Заболевание может осложнять­ся реактивными артритами, а также нейропатиями, включая синдромы Гийена-Баре и Миллера-Фишера, которые являются иммунным ответом на гастроинтестинальную инфекцию [3].

C. jejuni является частью нормальной микрофлоры же­лудочно-кишечного тракта большого числа домашних и диких животных и птицы. Степень бактерионосительства у домашней птицы очень высока и достигает 90%, в связи с чем контаминированное куриное мясо преиму­щественно рассматривается в качестве основного ис­точника возникновения пищевого кампилобактериоза [6-10]. По сравнению с другими пищевыми патогенами, такими как энтерогеморрагические E. coli или сальмо­неллы, C. jejuni более чувствительны к неблагоприятным условиям внешней среды. Для роста им необходим определенный набор нутриентов, обеспечивающий за­данный окислительно-восстановительный потенциал среды и специальные микроаэрофильные условия с оптимальной температурой культивирования возбу­дителя не ниже 30 оС. Такие избирательные свойства теоретически не должны позволять C. jejuni выживать вне организма хозяина в природных аэробных условиях или в пищевой цепи. Однако в реальных условиях эти микроорганизмы активно персистируют во внешней среде и обнаруживаются в продуктах, воде и других объектах [11]. Механизм такого выживания и последую­щей перекрестной контаминации C. jejuni изучен недо­статочно и требует проведения детальных исследований с целью снижения риска возникновения пищевых забо­леваний, связанных с употреблением зараженных про­дуктов, особенно куриного мяса, поскольку его удель­ный вес в структуре питания населения очень велик.

В связи с изложенным целью исследования яви­лось установление частоты обнаружения бактерий рода Campylobacter, а также характера общей микробной кон­таминации образцов пищевой продукции, в том числе продовольственного сырья растительного и животного происхождения, а также объектов производственной среды на разных стадиях производства.

Микробиологические исследования включали вы­явление и подсчет бактерий рода Campylobacter на фоне количественного определения общей бактери­альной обсемененности исследуемых образцов и санитарно-показательных микроорганизмов (бактерий семейства Enterobacteriaceae, включая колиформы и Escherichia coli). В задачи исследования также входила оценка видовой принадлежности выделенных штаммов Campylobacter spp., включая определение фенотипических и молекулярно-генетических признаков.

Материал и методы

Всего было исследовано 148 проб, в том числе 30 об­разцов листовых салатов и свежих овощей, 14 проб сы­рого коровьего молока, 64 образца мяса цыплят-брой­леров и субпродуктов куриных сырых (охлажденных и замороженных), индейки, перепелов, мяса говяжьего, упакованного в полимерные пленки, а также более 50 смывов с поверхностей оборудования, посуды и инвен­таря на птицеперерабатывающих предприятиях.

Образцы отбирали в соответствии с требованиями ГОСТ 31904-2012 и ГОСТ 31467-2012. Доставку проб осу­ществляли при соблюдении условий и сроков годности, установленных для хранения конкретных изучаемых про­дуктов. Скоропортящиеся продукты доставляли в сум­ках-холодильниках и хранили до проведения анализа не более 6 ч при 2-6 оС. Подготовка проб к посеву осущест­влялась в соответствии с требованиями ГОСТ 26669-85. Выделение и подсчет бактерий рода Campylobacrter проводили в соответствии с МУК 4.2.2321-08 и ГОСТ ISO 10272-1-2013. Для посевов использовали бульон и агар Престона, бульон Дойла, бульон Мюллера-Хинтона, бульон для бруцелл, модифицированный угольный агар с дезоксихолатом натрия (агар mCCD) и кровя­ной агар. В работе использовали питательные среды и ростовые добавки фирм "Merck", "HiMedia", "Difco" и "BioMerieux". Для повышения селективных свойств сред использовали антибиотики (полимиксин В, рифампицин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин в различных комбинациях). Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического дейст­вия кислорода добавляли стерильную дефибринированную баранью кровь (4-7%). Идентификацию культур по морфологическим и биохимическим признакам прово­дили с использованием микроскопии по Граму, тестов на подвижность, оксидазу и каталазу, нитрат/нитрит ре­дукции, гидролиза гиппурата, ферментации углеводов, чувствительности к антибиотикам или с применением тест-систем АРІ Campy ("BioMerieux", Франция). На­ряду с традиционными бактериологическими тестами использовали альтернативный метод скрининга кампилобактерий в пищевых продуктах - фермент-связанный флюоресцентный иммуноанализ с использованием ав­томатического анализатора miniVIDAS® ("BioMerieux", Франция), позволяющий проводить качественное не­дифференцированное суммарное определение бактерий видов C. jejuni, С. coli, С. lari. Идентификацию выделенных штаммов Campylobacter также проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) c использованием тест-наборов "Кам-Бак" (ФБУН "ЦНИИ эпиде­миологии" Роспотребнадзора).

Общее количество мезофильных аэробных и фа­культативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15-94. Бактерии семейства Enterobacteriaceae определяли по ГОСТ Р 54005-2010, бактерии группы кишечных палочек (БГКП) и Escherichia coli - по ГОСТ 31747-2012, ГОСТ 30726-2001, ГОСТ Р 52830-2007.

Анализ смывов с поверхностей оборудования и объектов внешней среды на наличие бактерий рода Campylobacter проводили в соответствии с разрабо­танной и модифицированной методикой в 3 вариантах: пробы в исследуемой зоне отбирали тремя тампонами с участка площадью 100 см2 для каждого тампона и вносили в три жидких среды - бульон Престона с кровью, бульон для бруцелл и транспортную среду Кери-Блейра, с последующими пересевами в жидкие селективные среды и/или на поверхность агаровых дифференциально-диагностических сред. Результаты высева из 3 жидких сред оценивали как 1 пробу.

Культивирование штаммов проводили при оптималь­ных для каждого вида режимах, в том числе C. jejuni выращивали в микроаэрофильных условиях (10% СО2, 5% О2, 85% N2) при 37-42 °С; бактерии семейства Enterobacteriaceae - в аэробных условиях при 37 °С в течение 24-48 ч.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признава­ли статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Расчеты проводили с помощью пакетов про­грамм Excel и SPSS версия 18.0.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных экспериментальных данных по­казал, что все исследованные виды сырых продуктов животного и растительного происхождения характеризуются высокими уровнями микробной контаминации (табл. 1). Оценка загрязненности продуктов грамотрицательными бактериями семейства Enterobacteriaceae свидетельствует о том, что данная группа микроор­ганизмов является основным видом контаминантов, ее уровни сопоставимы с общим количеством посто­ронней микрофлоры (КМАФАнМ). БГКП обнаружены в 100% проб, наиболее высокое содержание колиформ выявлено в сырых птицепродуктах и сыром молоке (105-107 КОЕ/г/см3). На фоне столь высокой микробной загрязненности число положительных проб, в кото­рых были обнаружены бактерии рода Campylobacter, в сырых птицепродуктах составляло 45,5%, что ука­зывает на высокую частоту их обнаружения в этой группе продукции. Количество Campylobacter spp. в исследованных пробах птицепродуктов колебалось в пределах от 0,1 до 1000 КОЕ/г, в среднем составляя lg(0,81±0,73) КОЕ/г. Распределение исследованных об­разцов по уровням контаминации кампилобактериями в пределах данной выборки представлено на рис. 1.

При изучении микробного фона исследованных об­разцов птицепродуктов было выделено 27 штаммов возбудителей кампилобактериоза, из них 19 (70%) были идентифицированы как вид C. jejuni (включая подвиды C. jejuni spp. jejuni и C. jejuni spp. doylei в соотношении 70:30). Видовая принадлежность 32% изолятов рода Campylobacter по результатам биохимической иденти­фикации не была определена.

Патогенные бактерии рода Salmonella обнаруживали в 19,0% исследованных образцов мяса птицы. В сыром молоке патогенные бактерии рода Salmonella обнару­живались в 14,3% случаев, тогда как кампилобактеры в данной выборке не были обнаружены.

Учитывая отсутствие данных о возможности выде­ления бактерий рода Campylobacter на предприятиях по производству перепелиного мяса и яиц, проведены выборочные исследования тушек перепелов и смывов с оборудования производственного цеха. Всего изучено 14 проб по основным микробиологическим показателям, включая определение Campylobacter и Salmonella. Ус­тановлено, что частота обнаружения кампилобактерий при исследовании тушек достигала 70% при среднем уровне 100-1000 КОЕ/г, при этом всего было выделено и идентифицировано 5 штаммов, отнесенных по комплек­су фенотипических признаков к виду C. jejuni ssp. jejuni. Патогенные бактерии рода Salmonella отсутствовали во всех исследованных образцах.

Уровни общей микробной загрязненности продуктов растительного происхождения, в том числе упакован­ных в пленки с модифицированной атмосферой, были ниже, чем в мясной и молочной продукции. Бактерии родов Campylobacter и Salmonella в данной группе про­дуктов не выявлены.

Исследования смывов с поверхностей оборудования и объектов внешней среды проводили в условиях трех отечественных птицеперерабатывающих предприятий, применяющих охлаждение тушек погружным спосо­бом с добавлением технологического вспомогательного средства на основе надуксусной кислоты. Отбор проб проводили на различных участках технологического процесса, включая цеха убоя птицы (конвейер, ванны крови, оборудование для удаления клоаки, обрезания шей, чистки желудков, тара для пера), участки контак­тного охлаждения тушек (конвейеры передачи тушек в ванны водяного охлаждения, ленты транспортерные, барабаны для стекания воды, столы сортировки), цеха полуфабрикатов (разделочные столы, пилы, ванны для полуфабрикатов, устройство для обвалки окорочков, транспортеры), упаковки (столы сортировки, упаковоч­ные автоматы).

Анализ характера микробной контаминации поверх­ностей оборудования птицеперерабатывающих пред­приятий (табл. 2) показал, что частота обнаружения штаммов Campylobacter spp. составляла 38,7%, бакте­рий рода Salmonella - 12,9%; при этом наиболее часто кампилобактерии и сальмонеллы обнаруживали в цехах первичной обработки тушек птицы на этапах ошпарива­ния, удаления крови, потрошения, разделки. Частота выделения сальмонелл в цехах убоя составляла 19%, кампилобактерий - 43% (рис. 2). Результаты исследования смывов после этапа погружения тушек птицы в ванны охлаждения показали менее интенсивное загрязнение поверхностей оборудования в отношении исследуе­мых групп патогенов. Частота выделения Campylobacter spp. на участках разделки полуфабрикатов и упаковки составляла суммарно 27,3%, сальмонеллы на поверх­ностях инвентаря и столов не обнаружены. На участках упаковки тушек, полуфабрикатов и субпродуктов птицы Campylobacter spp. были обнаружены только в одной пробе (стол сортировки тушек) из пяти.

Следует отметить, что частота обнаружения сальмо­нелл существенно снижалась (почти в 3 раза) после охлаждения и антимикробной обработки тушек кур, тогда как количество проб, содержащих Campylobacter spp., при тех же условиях практически не менялось или уменьшалось незначительно. Это указывает на недоста­точную эффективность в отношении кампилобактеров мер деконтаминации, традиционно применяемых для подавления сальмонелл, и требует дальнейшего подбора оптимальных способов технологической обработки, направленных на инактивацию возбудителей кампилобактериоза.

Оценка видового состава 23 изолятов Campylobacter spp., выделенных с поверхностей оборудования, пока­зала, что 21 из них (91%) представлены видом C. jejuni, в данной выборке подвиды C. jejuni spp. jejuni и C. jejuni spp. doylei были представлены практически поровну. 2 культуры по фенотипическим признакам не удалось отнести к известным видам кампилобактеров, потому они были идентифицированы как нетипичные предста­вители рода Campylobacter.

Анализ результатов исследований смывов на нали­чие бактерий рода Campylobacter подтвердил эффек­тивность разработанной комбинированной методики отбора проб с использованием не менее трех вариантов транспортных сред. При установленной частоте выявле­ния Campylobacter в количестве 38,7% открываемость проб в трех вариантах сред различалась: в бульоне для бруцелл и в среде Кери-Блейра она была примерно равной и составляла 19,4%, а в бульоне Престона - 9,7% положительных проб. При этом в большинстве случаев выявленные позитивные пробы не дублировались одно­временно на всех использованных средах и их обнару­жение носило мозаичный характер (табл. 3).

Наряду с вышеописанными исследованиями проводи­ли анализ микробной контаминации пищеблоков пред­приятий общественного питания типа фастфуд с однозальной планировкой. Оценка санитарного состояния включала посевы смывов с поверхностей инвентаря, посуды, столов, санитарной одежды и рук персонала. Всего было исследовано свыше 20 проб на разных участках хранения и реализации готовой продукции. В образцах, отобранных в условиях сетевых предпри­ятий быстрого питания, бактерии родов Campylobacter и Salmonella обнаружены не были.

Результаты идентификации выделенных штаммов рода Campylobacter были верифицированы путем тес­тирования культур методами фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа с использованием авто­матического анализатора miniVIDAS® и методом ПЦР с использованием тест-систем "Кам-Бак". В результатесравнительного анализа была подтверждена диагности­ческая достоверность результатов идентификации для 89,5% изолятов Campylobacter spp.

Заключение

Изучен характер контаминации бактериями рода Campylobacter процессов производства пищевой про­дукции растительного и животного происхождения. Наиболее высокий уровень обнаружения возбудите­лей кампилобактериоза (свыше 45%) установлен для сырых птицепродуктов, включая тушки цыплят-бройлеров, индеек, перепелов и производимых из них по­луфабрикатов.

Из общего числа 148 исследованных проб было вы­делено 50 штаммов Campylobacter spp. (33,8%), которые по основным фенотипическим признакам были идентифицированы как C. jejuni spp. jejuni и C. jejuni spp. doylei (свыше 75%). Из 27 штаммов, выделенных из птицепродуктов, 19 культур (70%) принадлежали C. jejuni. Среди штаммов, выделенных из объектов внешней среды, включая смывы с поверхностей обо­рудования, 91% изолятов были представлены видом C. jejuni.

Установлено, что наряду с загрязненностью бактерия­ми рода Campylobacter исследованные группы пищевой продукции характеризуются высокими уровнями общей микробной контаминации, включая бактерии семейства Enterobacteriaceae, содержание которых было сопоста­вимо с выявленными значениями КМАФАнМ. Патоген­ные бактерии рода Salmonella обнаруживали в 19,0% исследованных образцов мяса птицы и в 14,3% проб сырого коровьего молока.

При исследовании смывов с поверхностей оборудова­ния птицеперерабатывающих предприятий установлено, что частота обнаружения штаммов Campylobacter spp. составляла 38,7%, бактерий рода Salmonella - 12,9%; при этом наиболее часто кампилобактерии и сальмо­неллы обнаруживали в смывах с поверхностей в цехах первичной обработки тушек птицы: частота выделения сальмонелл в цехах убоя составляла 19%, кампилобактерий - 43 %. В смывах, отобранных в условиях пищеб­локов сетевых предприятий быстрого питания, бактерии родов Campylobacter и Salmonella не обнаружены.

Для исследования смывов с поверхностей оборудо­вания и объектов внешней среды на наличие бактерий рода Campylobacter разработана модифицированная методика отбора и посевов проб, включающая ком­плексный анализ тестирования в исследуемой зоне с применением трех видов сред для транспортирования и накопления кампилобактеров (бульон Престона с кро­вью, бульон для бруцелл, среда Кери-Блейра).

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).

Литература

1. European Food Safety Authority (EFSA). The European Union sum­mary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2014. // EFSA J. 2015. Vol. 13, N 12. Article ID 4329. doi:10.2903/j.efsa.2015.4329. URL: www.efsa.europa.eu/efsajournal

2. World Health Organization. WHO estimates of the global bur­den of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiol­ogy reference group 2007-2015. ISBN 978-92-4-156516-5. URL: www.who.int

3. Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections // Foodborne Pathogens. Microbiology and Molecular Biology. Caister Academic Press, 2005. P. 285-293.

4. Vidal A.B., Davies R.H., Rodgers J.D., Ridley A. et al. Epidemiol­ogy and control of Campylobacter in modern broiler produc­tion // Campylobacter Ecology and Evolution / ed. S.K. Shep-pard. Caister Academic Press, 2014. 360 p. ISBN: 978-1-908230­36-2.

5. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, 3. С. 24-29.

6. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 3. P. 237-257.

7. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н., Пискарева И.И. Изучение загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. 6. С. 38-43.

8. EFSA. Analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, 2008. Pt A: Campylobacter and Salmo­nella prevalence estimates // EFSA J. 2010. Vol. 8. P. 1-99.

9. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M. et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: A sys­tematic review // Poultr. Sci. 2010. Vol. 89. P. 1070-1084.