Для изучения совокупности свойств организма, опосредованно закодированных в геноме и передающихся по наследству, было сформировано направление генетики, выделившееся в самостоятельную область исследований - эпигенетику. В отличие от мутаций, эпигенетические изменения влияют на экспрессию генов или фенотип клетки, не затрагивая последовательности нуклеотидов ДНК. К наиболее хорошо изученным эпигенетическим изменениям относится метилирование ДНК. Феномен метилирования ДНК встречается у различных организмов, включая прокариотические, у которых, в отличие от эукариотических организмов, ДНК может быть модифицирована путем метилирования цитозина и аденина, что является частью механизма распознавания и защиты от чужеродной ДНК [1]. У эукариот метилирование происходит только по основаниям цитозина и заключается в ковалентном присоединении метильной группы к 5-му положению цитозина, при этом, за редкими исключениями, метилированию подвергаются только молекулы цитозина, предшествующие гуанину в цепи ДНК, т.е. входящие в состав CpG-динук-леотидов. В геноме здорового организма большинство CpG-динуклеотидов метилированы. Неметилированные CpG-динуклеотиды сгруппированы в так называемые CpG-островки, располагающиеся в основном в промоторных участках функциональных генов. Метилирование этих областей приводит к снижению транскрипционной активности генов [2].
У высших эукариот функциональное значение метилирования ДНК заключается в регуляции многих биологических процессов: тканеспецифичной экспрессии генов, ремоделировании структуры хроматина, инактивации Х-хромосомы, геномном импринтинге, дифференцировке клеток во время эмбриогенеза и т.д. [3]. Профиль метилирования ДНК различен для разных тканей и стадий жизненного цикла. Нарушения метилирования ДНК могут приводить к изменению функционирования клеток, оказывая значительное влияние на развитие патологии. Так, к настоящему времени уже доказана взаимосвязь изменения профиля метилирования ДНК с различными заболеваниями - с атеросклерозом, артериальной гипертензией, сахарным диабетом 2 типа, шизофренией, аутизмом, хореей Гентингтона и др. [4]. Кроме того, изменения характера метилирования могут играть существенную роль в процессах трансформации нормальных клеток в опухолевые [5]: согласно целому ряду исследований, опухолевые клетки демонстрируют общее гипометилирование генома, сопровождающееся гиперметилированием CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста. На нарушение процессов метилирования ДНК оказывают влияние экзо-и эндогенные факторы, при этом эпигенетические изменения обычно предшествуют появлению клинических и морфологических симптомов развития патологических процессов, вследствие чего показатели метилирования ДНК могут быть использованы в качестве чувствительных биомаркеров, позволяющих выявить негативные влияния на организм [6]. Следует отметить, что до настоящего времени практика подобного применения показателей метилирования ДНК отсутствовала, однако есть все основания рассматривать их как потенциально пригодные для использования в токсикологических исследованиях.
Исходя из предположения, что при токсических воздействиях метилированию подвергаются определенные гены, был разработан план модельного эксперимента, направленного на выявление изменений метилирования генов печени в условиях воздействия гепатотоксикантов различной природы - афлатоксина В1, солей кадмия, эпигаллокатехингаллата (EGCG), глутамата натрия, парацетамола. Поскольку печень является основным детоксицирующим органом организма, она представляет собой наиболее предпочтительный объект для целей токсикологических исследований. Каждый орган обладает собственным профилем метилирования, кардинально отличающимся от профилей других органов, поэтому моделирование токсического воздействия проводили с учетом органотропности токсикантов, в данном случае - доказанной гепатотропности.
Афлатоксин В1 - вторичный метаболит микроскопических грибов рода Aspergillus - является ядом с выраженным гепатотропным действием [7]. В гепатоцитах афлатоксин В1 превращается в более токсичные и канцерогенные метаболиты с участием цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, происходит реакция эпоксидирования двойной связи терминального фуранового кольца, в результате чего образуется электрофильный метаболит, способный алкилировать нуклеиновые кислоты [8]. Разрушение белков и азотистых оснований ДНК определяет гепатотоксическое действие афлатоксина на печень.
Механизм токсического действия кадмия заключается в связывании карбоксильных, аминных и, особенно, сульфгидрильных групп белковых молекул, приводящем к угнетению активности ферментных систем, нарушению снабжения кислородом тканей и нарушению обменных процессов фосфолипидов [9]. Поскольку печень является главным органом метаболизма ксенобиотиков, токсическое действие кадмия реализуется в этом органе.
Эпигаллокатехингаллат, содержащийся в больших количествах в зеленом чае, при применении в высоких дозах вызывает токсическое повреждение печени, однако механизм его действия до конца не изучен [10]. Согласно одной из версий, EGCG подвергается окислению в печени, что приводит к образованию интермедиата, образующего активные формы кислорода и, соответственно, индуцирующего окислительный стресс [11], что может быть причиной повреждения ДНК, белков и липидов и оказывать гепатотоксическое действие.
Широко используемая в пищевой промышленности пищевая добавка - мононатриевая соль глутаминовой кислоты, попадая в организм, распадается на ионы натрия (Na+) и L-глутамат, который проходит мезотелиальные перитонеальные клетки и поступает в кровоток [12]. Часть L-глутамата конъюгируется в клетках, другая часть превращается в глутаминовую кислоту. Дезаминирование глутаминовой кислоты приводит к образованию ионов аммония (NH4+), которые, до их нейтрализации в ходе реакции образования мочевины, могут оказать повреждающее действие на ткани печени [13].
Лекарственное средство, анальгетик и антипиретик из группы анилидов парацетамол вызывает повреждения печени в условиях истощения запасов глутатиона [14]. Около 5% парацетамола подвергается окислению изоферментами цитохрома Р450 2Е1 и 1А2 с образованием N-ацетил-р-бензохинонимина (NAPQI), который, связываясь с глутатионом, превращается в неактивное соединение и выводится почками. При увеличении дозы парацетамола возрастает количество NAPQI и возникает дефицит глутатиона, свободный NAPQI соединяется с нуклеофильными группами белков гепатоцитов, что в итоге может привести к некрозу ткани печени [15].
Цель данного исследования - выявление генов печени, профиль метилирования которых изменяется при воздействии вышеуказанных гепатотоксикантов.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 60 крысах-самцах линии Вистар (возраст ~30-35 дней), полученных из филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России. Животные были разделены на 6 групп - 1 контрольную и 5 опытных, по 10 крыс в каждой группе, исходная масса тела составляла 83,3±1,5 г. В течение первых 2 нед эксперимента (5 раз в неделю) крысам внутрижелудочно через зонд вводили гепатотоксиканты, растворенные в дистиллированной воде. Животным 1-й опытной группы вводили афлатоксин В1 в дозе 200 мкг/кг массы тела, животным 2-й опытной группы - кадмий хлористый 2,5-водный в дозе 2 мг на 1 кг массы тела, 3-й опытной группы - глутамат натрия в дозе 1000 мг на 1 кг массы тела, животным 4-й опытной группы - EGCG в дозе 1000 мг на 1 кг массы тела, животным 5-й опытной группы -парацетамол в дозе 150 мг на 1 кг массы тела. Крысы контрольной группы получали эквивалентное количество дистиллированной воды. Объем вводимой дозы для крыс всех групп составлял 1 мл раствора на каждые 100 г массы тела животного.
При выборе воздействующих доз каждого токсиканта учитывали диапазон между минимальными гепатотоксичными дозами и LD50, выявленный на основании анализа данных литературы.
На протяжении всего эксперимента животные получали базовый полусинтетический казеиновый рацион [16], имели свободный доступ к воде, содержались в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната с древесной подстилкой, в отапливаемом и кондиционируемом помещении (23-25 °С) с естественным освещением, по 2 особи в клетке. Наблюдение за общим состоянием животных: внешним видом, поведением, двигательной активностью, качеством шерстного покрова проводили ежедневно, массу тела крыс измеряли еженедельно.
Материал для исследований отбирали на 36-й день эксперимента. Определение метилирования генов печени у крыс проводили с помощью высокопроизводительного метода RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, бисульфитное секвенирование ограниченных выборок локусов), основанного на секвенировании геномных библиотек, обработанных бисульфитом натрия. Данный метод позволяет анализировать метилирование отдельных CpG-динуклеотидов и характеризуется высокой чувствительностью. В соответствии с руководством "RRBS for Methylation Analysis. Preparing Samples for the Illumina Sequencing Platform" было выполнено формирование геномных библиотек для метода RRBS (рис. 1).
Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BSMAP. Проведен анализ качества секвенирования и однородности покрытия, прочтения ДНК картированы на геном крысы. Для промотеров и CpG-островков проведен анализ покрытия, подтверждающий их метилирование или отсутствие метилирования. Идентификация дифференциально метилированных регионов выполнена с помощью программного пакета BSSEQ в статистической среде "R" [17]. Условия отбора дифференциально метилированных регионов заключались в том, чтобы как минимум 3 CpG-сайта с покрытием выше 10 попадали в дифференциально метилированные регионы и разница среднего уровня метилирования у двух групп составляла не менее 10%.
Для оценки состояния здоровья крыс были также изучены гематологические, биохимические показатели, определена масса внутренних органов (печени, почек, сердца, легких, селезенки, надпочечников, семенников, тимуса, головного мозга), проведены морфологические исследования печени.
Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета программ прикладного статистического анализа SPSS Statistics (версия 20.0) согласно тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены в виде M±m и min-max.
Результаты и обсуждение
На протяжении эксперимента общее состояние животных было удовлетворительным, гибели крыс не отмечено ни в одной из групп. По внешнему виду, качеству шерстного покрова животные опытных групп не отличались от животных контрольной группы. Еженедельный прирост массы тела крыс контрольной, 1-3-й и 5-й опытных групп соответствовал уровню прироста, характерному для данного вида и возраста животных. Животные 4-й опытной группы демонстрировали замедление прироста массы тела начиная с 3-й недели эксперимента, в среднем на 12-13% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 2), что можно объяснить действием EGCG [18]. Таким образом, снижение массы тела крыс 4-й опытной группы в данных условиях эксперимента было предсказуемо и не являлось следствием токсического действия EGCG, поскольку его доза не выходила за границы клинически верифицированного диапазона, традиционно используемого для снижения массы тела.
Гепатотоксическое действие выбранных веществ подтверждено результатами морфологических исследований печени: у крыс всех опытных групп были выявлены структурные изменения, не характерные для здоровой ткани. Так, воздействие афлатоксина В1 вызывало венозный застой, избыточное кровенаполнение сосудов, что характерно для портальной гипертензии, а также жировую дистрофию. Кадмий вызывал появление участковатрофии и некроза с единичными атипичными клетками печени, в которых стенки гепатоцитов размыты. При воздействии глутамата натрия на некоторых срезах были видны интенсивно окрашенные эозином гепатоциты, увеличенные в размерах, участки жировой дистрофии, что характерно для плазмокоагуляции. EGCG приводил к разрастанию соединительной ткани вокруг сосудов и появлению на периферии долек диффузной разнокалиберной жировой дистрофии гепатоцитов. При воздействии парацетамола по всей площади среза наблюдались гепатоциты в состоянии гидропической дистрофии, при этом клетки печени были увеличены в объеме, что характерно для фокального колликвационного некроза.
Масса внутренних органов у животных контрольной и опытных групп находилась в диапазоне нормальных значений, свойственных крысам линии Вистар. Достоверные отличия от контроля были отмечены только у крыс 4-й опытной группы: относительная масса печени была на 7% ниже, чем у контрольных животных, что можно объяснить жиросжигающим действием EGCG.
Анализ результатов гематологических и биохимических исследований сыворотки крови, выполненный с учетом референсных значений, характерных для крыс линии Вистар [19, 20], не выявил отклонений от нормы: все изученные показатели находились в пределах физиологических колебаний, характерных для животных данного вида и возраста.
Обращает на себя внимание некоторое несоответствие результатов биохимических исследований сыворотки крови, в которых не наблюдалось значимых отличий от нормы, и результатов морфологических исследований печени, в которых был выявлен целый ряд нарушений. В данном случае противоречие отсутствует, поскольку повышение содержания маркеров повреждения печени -билирубина в сыворотке крови, активности аланинами-нотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы - происходит в случае воспаления или разрушения гепатоцитов. В гистологической картине печени крыс опытных групп, демонстрировавшей широкий спектр нарушений, признаки воспаления и разрушения гепатоцитов отсутствовали.
Таким образом, гепатотоксическое действие выбранных токсикантов было подтверждено результатами гистологических исследований печени, что позволило перейти к решению основной задачи эксперимента -изучению профиля метилирования генов печени в каждой группе и последующему сравнению с контролем.
Методом RRBS для каждого образца было получено от 12 до 30 млн пар прочтений по 75 нуклеотидов с каждой стороны. Выполнены идентификация дифференциально метилированных регионов и сравнение участков дифференциального метилирования, связанных с введением гепатотоксикантов. Кроме того, были определены гены, демонстрировавшие значимые изменения метилирования при воздействии токсических факторов: афлатоксин В1 вызывал изменения метилирования 57 генов; кадмий - 54 генов; глутамат натрия - 39 генов; EGCG - 198 генов; парацетамол - 167 генов.
Информация о функциях каждого гена была получена с помощью базы данных генома крысы (Gene Editing Rat Resource Center). Установлено, что гены, демонстрировавшие изменения метилирования, отвечают за реализацию различных метаболических процессов: обмен липопротеинов, метаболизм жировой ткани, окислительное фосфорилирование, а также представляют собой маркеры развития болезней - ишемических нарушений, астмы, атеросклероза, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и т.д.
Сопоставление генов с измененным метилированием в опытных группах показало, что ни один из генов не встречался повторно при воздействии каждого из пяти токсикантов, наибольшее количество отмеченных повторов составляло 3. На основании анализа данных были выбраны 7 генов (см. таблицу).
Функции каждого из этих генов в организме различны. Так, белок Fan1 участвует в восстановлении разрывов двухцепочечной ДНК и проявляет флэпэндонуклеазную и 5'-3'-экзонуклеазную активности [21]. Белок Lppr2 обладает активностью фосфатидат-фосфатазы и является неотъемлемым компонентом мембраны [22]. Белок Mlh3 участвует в репарации ошибочно спаренных оснований. Мутации гена Mlh3 обнаруживают у больных наследственным неполипозным раком толстой и прямой кишки [23]. Белок Sirt7 участвует в связывании хроматина, в деацетилировании гистонов Н3 и Н4, негативной регуляции транскрипции промотора РНК-полимеразы II, стимулирует связывание РНК полимеразы I с промоторной областью рекомбинантной ДНК и кодирующей областью, восстанавливая транскрипцию рибосомальной РНК [24]. Кроме того, он играет ключевую роль в опухолевой трансформации за счет локус-специфического деацетилирования Н3К18Ас в промоторных областях и подавления экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста [25]. Белок Fbxo15 ответственен за поддержание плюрипотентности стволовых клеток [26]. Белок E2f1 играет решающую роль в контроле клеточного цикла и действии белков опухолевых супрессоров за счет связывания (в зависимости от фазы клеточного цикла) с белком ретинобластомы, что может опосредовать как клеточную пролиферацию, так и p53-зависимый/независимый апоптоз [27]. Белок Mrps16 участвует в трансляции, а также связан с дефицитом окислительного фосфорилирования [28].
Таким образом, в эксперименте было показано, что биомаркеры метилирования, отражающие реакцию организма на действие токсических факторов, являются высокочувствительными и могут быть использованы в токсикологических исследованиях. На основании полученных данных был сформирован проект панели генов-биомаркеров токсического воздействия, включающей гены Fan1, Lppr2, Mlh3, Sirt7, Fbxo15, E2f1, Mrps16.
Литература
1. Пендина А.А., Гринкевич В.В., Кузнецова Т.В. и др. Метилирование ДНК - универсальный механизм регуляции активности генов // Экол. генетика. 2004. Т. 1 (II). С. 27-37.
2. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. Vol. 5, N 3. Р. 309-314.
3. Kelsey G., Feil R. New insights into establishment and maintenance of DNA methylation imprints in mammals // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2013. Vol. 368, N 1609. Article ID 20110336.
4. Jones M.J., Goodman S.J., Kobor M.S. DNA methylation and healthy human aging // Aging Cell. 2015. Vol. 14, N 6. P. 924-932.
5. Киселева Н.П. Деметилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. 2005. Т. 70, № 7. C. 900-911.
6. Widschwendter M., Apostolidou S., Raum E. et al. Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breast cancer risk: a proof of principle study // PLoS One. 2008. Vol. 3, N 7. Article ID 0002656.
7. Yener Z., Celik I., Ilhan F. et al. Effects of Urtica dioica L. seed on lipid peroxidation, antioxidants and liver pathology in aflatoxin-induced tissue injury in rats // Food Chem. Toxicol. 2009. Vol. 47, N 2. P. 418-424.
8. Sun L.H., Lei M.Y., Zhang N.Y. et al. Individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1, zearalenone, deoxynivalenol and fumonisin B1 on BRL 3A rat liver cells // Toxicon. 2015. Vol. 95. P. 6-12.
9. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S. et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity // Biotech. Histochem. 2016. Vol. 91, N 3. P. 170-181.
10. Federico A., Tiso A., Loguercio C. A case of hepatotoxicity caused by green tea // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43. P. 474.
11. Thangapandiyan S., Miltonprabu S. Epigallocatechin gallate effectively ameliorates fluoride-induced oxidative stress and DNA damage in the liver of rats // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2013. Vol. 91, N 7. P. 528-537.
12. Ataseven N., Yuzbasioglu D., Keskin A.C. et al. Genotoxicity of mono-sodium glutamate // Food Chem. Toxicol. 2016. Vol. 91. P. 8-18.
13. Onyema O.O., Farombi E.O., Emerole G.O. et al. Effect of vitamin E on monosodium glutamate induced hepatotoxicity and oxidative stress in rats // Indian J. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 43, N 1. P. 20-24.
14. Mahmoud Y.I., Mahmoud A.A. Role of nicotinamide (vitamin B3) in acetaminophen-induced changes in rat liver: Nicotinamide effect in acetaminophen-damged liver // Exp. Toxicol. Pathol. 2016. Vol. 68, N 6. P. 345-354.
15. Sarges P., Steinberg J.M., Lewis J.H. Drug-Induced Liver Injury: Highlights from a Review of the 2015 Literature // Drug Saf. 2016. Vol. 39, N 5. Article ID 01145916.
16. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. C. 30-38.
17. Gentleman, R., Carey V., Huber W. et al. Bioinformatics and computational biology solutions using R and Bioconductor. New York : Springer Science + Business Media, 2005. 473 p.
18. Sae-Tan S., Grove K.A., Kennett M.J. et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate increases the expression of genes related to fat oxidation in the skeletal muscle of high fat-fed mice // Food Funct. 2011. Vol. 2. P. 111-116.
19. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam : Elsevier/North-Holland Biochemical, 1981. 358 p.
20. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington : Elsevier Academic Press, 2006. 912 р.
21. Segui N., Mina L.B., Lazaro C. et al. Germline Mutations in FAN1 Cause Hereditary Colorectal Cancer by Impairing DNA Repair // Gastroenterology. 2015. Vol. 149, N 3. P. 563-566.
22. Theofilopoulos S., Lykidis A., Leondaritis G. et al. Novel function of the human presqualene diphosphate phosphatase as a type II phosphatidate phosphatase in phosphatidylcholine and triacylglycer-ide biosynthesis pathways // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 178, N 11-12. P. 731-742.
23. Lhotska H., Zemanova Z., Cechova H. et al. Genetic and epigenetic characterization of low-grade gliomas reveals frequent methylation of the MLH3 gene // Gene Chromosome Cancer. 2015. Vol. 54, N 11. P. 655-667.
24. Kim W., Kim J.E. SIRT7 anemerging sirtuin: deciphering newerroles // J. Physiol. Pharmacol. 2013. Vol. 64, N 5. P. 531-534.
25. Kim J.K., Noh J.H., Jung K.H. et al. Sirtuin7 oncogenic potential in human hepatocellular carcinoma and its regulation by the tumor suppressors MiR-125a-5p and MiR-125b // Hepatology. 2013. Vol. 57. P. 1055-1067.
26. Chen B.B., Coon T.A., Glasser J.R. et al. E3 ligase subunit Fbxo15 and PINK1 kinase regulate cardiolipin synthase 1 stability and mitochon-drial function in pneumonia // Cell Rep. 2014. Vol. 7, N 2. P. 476-487.
27. Jiang X., Nevins J.R., Shats I. et al. E2F1-Mediated Induction of NFYB Attenuates Apoptosis via Joint Regulation of a Pro-Survival Transcriptional Program // PLoS One. 2015. Vol. 10, N 6. Article ID 0127951.
28. Miller C., Saada A., Shaul N. et al. Defective mitochondrial translation caused by a ribosomal protein (MRPS16) mutation // Ann. Neurol. 2004. Vol. 56, N 5. P. 734-738.