Качество воды, являющейся важным компонентом рациона человека, определяется санитарно-гигиеническими показателями и регулируется на региональном, национальном и международном уровнях. В Российской Федерации в питьевой воде нормируются органолептические и некоторые физико-химические параметры, а также содержание вредных химических веществ. Однако предельно допустимые концентрации (ПДК) установлены не для всех химических элементов и их соединений.
Концентрация тяжеловодородной воды 1HD16O и тяжелокислородной воды 1H218O в воде пресноводных источников составляет примерно 330 мг/л и 2 г/л соответственно, что сопоставимо с содержанием минеральных солей в питьевой воде или даже превышает их предельно допустимые нормы [1]. Стоит отметить, что при длительном воздействии на организм минимальных концентраций дейтерия, превышающих ПДК, могут возникать патологические изменения или заболевания на любых сроках жизни настоящего и последующего поколений. Если рассматривать дейтерий как микроэлемент, входящий в состав не только воды, но и важнейших органических соединений, по значимости его влияние на живые системы можно поставить на одно из первых мест [2].
Специфическое влияние на биологические процессы низких концентраций дейтерия воды доказано многими исследованиями [3, 4]. При употреблении воды с пониженным содержанием дейтерия происходит снижение его концентрации в жидкостях и тканях организма [5], изменяется окислительный метаболизм [6]. Также показано, что под воздействием воды с модифицированным изотопным (D/H) составом у млекопитающих наблюдаются позитивные изменения функциональной активности ряда органов и систем: изменяется скорость метаболических процессов в центральной нервной системе [7], гормональная регуляция, функционирование системы детоксикации [8], активизируются неспецифические защитные системы, повышается устойчивость систем организма к токсическим соединениям, в том числе к химиопрепаратам [9-13]. Имеются данные о стимулирующем действии воды с пониженным содержанием дейтерия на рост микроорганизмов [4, 14].
Однако, несмотря на столь широкий интерес и наличие различных положительных эффектов влияния низких концентраций дейтерия воды на живые системы различного уровня организации, по-прежнему нет ответа на вопрос о влиянии данного фактора на генеративную функцию (гонадотоксическое, эмбрио-, фетотоксическое и тератогенное действие) животных.
Цель работы - проведение сравнительного исследования репродуктивной функции и постнатального развития крыс, получавших воду с модифицированным D/H составом (пониженное содержание тяжелых изотопов водорода).
Материал и методы
Исследования выполнены на 4 поколениях крыс стока Вистар (90 взрослых животных и 547 крысят): родительском (F0), первом (F1), втором (F2) и третьем (F3). Эксперимент состоял из подготовительной стадии, стадии изучения репродуктивной функции крыс поколений F0, F1, F2 и постнатального развития крыс поколений F1, F2, F3. Подготовительная стадия предназначалась для выведения животных (поколение F1), получавших воду с модифицированным D/H составом на протяжении всего срока онтогенетического развития организма. Исходную колонию крыс [поколение F0, самцы и самки массой тела (248±14) г], полученную из филиала "Андреевка" ФГБУН НЦБМТ ФМБА (Московская область, Солнечногорский район, п. Андреевка) и прошедшую карантин на протяжении 10 сут, произвольно разделяли на 2 группы. На протяжении всего срока исследований животные 1-й группы потребляли воду с модифицированным D/H составом, крысы 2-й группы - очищенную водопроводную воду. Адаптацию исходной колонии крыс (F0) -замену питьевого компонента рациона на воду с модифицированным D/H составом - осуществляли на протяжении 20 сут, после чего проводили спаривание. Для оплодотворения самок (в каждой группе n=10) подсаживали к самцам в соотношении 2:1 на 14 сут. В период спаривания возраст крыс составлял 100110 сут. Крысят отсаживали от материнских животных на 30-й день жизни; для продолжения эксперимента отбирали потомство от разных самок (с целью рандомизации исследований и исключения возможности инцеста).
Репродуктивную функцию оценивали по фертильности поколений животных F0, F1 и F2 и характеру постнатального развития потомства F1, F2 и F3. Фертильность оценивали по способности к оплодотворению самок и самцов в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. При этом беременность обеих или одной самки подтверждала фертильность самца. В случае, если ни одна из самок не беременела, самец считался нефертильным, а обе самки - потенциально фертильными.
Характер постнатального развития потомства F1, F2 и F3 оценивали в течение первого месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (масса тела), общему физическому развитию (срок отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, опускания семенников, открытия влагалища), эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений [16]. Массу тела крысят измеряли с помощью электронных технических весов Ohaus ("Adventurer Pro", США) с точностью (±0,1) г, на 2, 7, 14, 21, 28 и 30-е сутки жизни. Определяли средний размер помета, число живых и мертвых новорожденных, вычисляли выживаемость с 0-го по 5-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня), соотношение самцов и самок [17, 18]. В течение эксперимента также учитывали потребление воды с модифицированным D/H составом (в пересчете на животное).
Воду с модифицированным D/H составом получали на разработанной в Кубанском государственном университете установке, остаточное содержание дейтерия 50 мг/л [15]. В качестве исходной для получения питьевой воды для поения 2-й группы животных с природной концентрацией дейтерия (150 мг/л) использовали воду, полученную на установке водоподготовки EMD Millipore RiOs™ 50. Минерализацию воды осуществляли путем добавления в нее минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального состава (минерализация 314-382 мг/л: гидрокарбонаты -144-180, сульфаты - <1, хлориды - 60-76, кальций - 6, магний - 3, натрий - 50-58, калий - 50-58). Температура воды для поения взрослых животных составляла 10-12 °С, молодняка - 15-20 °С соответственно.
В период проведения эксперимента животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в пластмассовых клетках TECNIPLAST тип IV S, в которые помещали не более 6 крыс (в соответствии с нормами размещения животных) [19]. Условия содержания животных были стандартизированы: температура - (20±3) °С, влажность -(48±2)%, освещение режим день/ночь (с 6.00 до 18.00/ с 18.00 до 6.00). В качестве подстила использовали березовую стружку. На протяжении всего эксперимента животные потребляли стандартный концентрированный комбикорм по ГОСТ Р 50258.
Эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа Минздрава России от 19.06.2003 № 267 "Об утверждении правил лабораторной практики", Правил лабораторной практики (GLP), Хельсинкской декларации (2000) и Директив Европейского сообщества 86/609 EEC.
Результаты приведены в виде Р25-75 (25-й и 75-й процентили) и min-max (минимальное и максимальное значение измеряемой величины), а также в долях (процентах) или в абсолютных числах.
Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью χ2-критерия, равенство дисперсий - с помощью критерия Левена. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметрический аналог для независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05 [18].
Результаты и обсуждение
Наблюдение в процессе проведения эксперимента показало, что общее состояние животных F0-F3 было удовлетворительным. По внешнему виду, поведенческим реакциям, скорости роста, в том числе физическому развитию, эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений опытные животные не отличались от контрольной группы и соответствовали нормам для животных данного вида и возраста.
Поедаемость корма составляла 13,5-29,8 г/сут на крысу (для самцов) и 12,6-25,8 г/сут (для самок). В период адаптации животных F0 потребление воды с модифицированным D/H составом составило 24,8± 2,2 мл/сут (самки) и 27,4±1,8 мл/сут (самцы), у животных 2-й группы - 22,9±3,4 и 25,8±2,4 мл/сут для самок и самцов соответственно. В период беременности и лактации животных F0 потребление воды возрастало в 1-й группе с 32,9 до 43,6 мл/голову, во 2-й - с 35,6 до 44,7 мл/голову. Потребление воды с модифицированным D/H составом животных F1 и F2 колебалось в пределах 32,9-33,1 мл/голову в период беременности и 44,9-46,5 мл/голову - в период лактации. Животные F1 и F2 контрольной группы в период беременности потребляли 33,9-34,7 мл воды/голову, лактации -45,5-46,7 мл/голову соответственно. В период адаптации к воде с модифицированным D/H составом животные набирали в среднем 0,8-1,9 г/сут, животные 2-й группы - 1,2-2,2 г/сут (рис. 1).
Эффективность спаривания, демонстрирующая фертильность экспериментальных животных, составила: 100% - для самок и самцов поколения F0 1-й и 2-й групп, 90% - для самок 1-й группы поколений F1 и F2, 70 и 80% - для самок 2-й группы поколений F1 и F2 соответственно (рис. 2). Фертильность самцов 1-й и 2-й групп поколений F1 и F2 составляла 89-100% соответственно. При данных условиях эксперимента эффективность спаривания соответствовала ожидаемой - количество неоплодотворивших самцов и незабеременевших самок находилось в пределах физиологической нормы. При этом определенной тенденции не отмечено, следовательно, данные являлись случайными, не были связаны с влиянием каких-либо внешних факторов. Смертности, связанной с родами, у самок поколений F0, F1 и F2 не зарегистрировано.
Сравнительный анализ данных постнатального развития потомства в опытной и контрольной группах показал высокую выживаемость в поколениях F1, F2 и F3 (табл. 1). Соотношение самцов и самок в каждом поколении в 1-й и 2-й группах различалось, при этом отмеченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для крыс данной линии.
Комплексная оценка морфофункциональных показателей постнатального онтогенеза потомства крыс позволила выявить некоторые различия. Анализ динамики массы тела детенышей трех поколений обоих экспериментальных групп не выявил значимых колебаний в первые 30 сут. Однако отмечено, что детеныши F1, F2 и F3, родители которых потребляли воду с модифицированным D/H составом (1-я группа), на протяжении первых 20 сут менее интенсивно прибавляли в весе, чем животные этих поколений 2-й группы. При этом начиная с 25-х по 30-е сутки масса тела детенышей 1-й группы поколений F1, F2 и F3 превышала в среднем на 4-18% показатели животных 2-й группы. Прирост массы тела за этот период у животных 1-й группы достигал: для F1 и F2 - 20%, F3 - 25% по сравнению с таковым у детенышей 2-й группы (F1 - 8%, F2 - 10%, F3 - 15% соответственно). Наиболее выражена данная тенденция у поколения F3 (табл. 2).
Наблюдение в динамике за крысятами 1-й и 2-й групп F1, F2 и F3 показало отсутствие достоверных отличий в физическом развитии с первых суток после рождения (табл. 3). Также не выявлено достоверных отличий в скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов и физических параметров крысят опытной группы F1, F2 и F3 в сравнении с контрольными группами животных (табл. 4).
При исследовании эмоционально-двигательного поведения и способности к тонкой координации движений было зафиксировано, что переворачивались в свободном падении все крысята обеих групп с 16-х суток жизни (см. табл. 4).
На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что при формировании изотопного градиента за счет реакций D/H-обмена, обусловливающих достоверное снижение содержания дейтерия в плазме и в тканях печени, почек и сердца [12, 13], сопровождающееся умеренной стимуляцией процессов свободнорадикального окисления, отражающего активацию функционирования прооксидантной системы организма и повышение его адаптационных возможностей, не оказывает влияния на генеративную функцию организма животных.
Заключение
На основании выполненных исследований необходимо отметить, что по внешнему виду, поведенческим реакциям, скорости роста, в том числе физическому развитию, эмоционально-двигательному поведению и способности к координации движений опытные животные не отличались от контрольной группы и соответствовали нормам для животных данного вида и возраста. Смертности, связанной с родами у самок опытных и контрольных групп F0, F1 и F2 не зарегистрировано. Сравнительный анализ данных постнатального развития потомства в опытной и контрольной группах показал высокую выживаемость в поколениях F1, F2 и F3. Эффективность спаривания, демонстрирующая фертильность животных в опытных и контрольных группах, не имела достоверных отличий. При данных условиях эксперимента эффективность спаривания соответствовала ожидаемой - количество неоплодотворивших самцов и незабеременевших самок находилось в пределах физиологической нормы. Выживаемость потомства, средняя величина пометов у крыс опытных и контрольных групп также не имели достоверных отличий. Соотношение самцов и самок в каждом поколении в группах незначительно различалось, при этом отмеченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для крыс данной линии.
Комплексная оценка морфофункциональных показателей постнатального онтогенеза потомства крыс позволила выявить некоторые различия. Анализ динамики изменения массы тела животных F1, F2 и F3 не выявил значимых колебаний в первые 14 сут. У детенышей F1, F2 и F3 опытной группы отмечено менее интенсивное увеличение массы с 1-х по 21-е сутки, что связано с большим количеством крысят в помете. При этом масса тела животных опытной группы (F1, F2 и F3) начиная с 25-х по 30-е сутки превышала показатели контрольных животных на 4-18% Наблюдение в динамике за крысятами опытной и контрольной групп F1, F2 и F3 показало отсутствие достоверных отличий в физическом развитии с первых суток после рождения. Также не выявлено изменений в скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов и физических параметров крысят опытной группы F1, F2 и F3 в сравнении с контрольными группами животных.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что вода с модифицированным D/H составом не оказывает патологического влияния на фертильность и плодовитость крыс, выживаемость и развитие потомства.
Исследование выполнено в рамках гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008).
Литература
1. Bowen G.J., Winter D.A., Spero H.J., Zierenberg R.A. et al. Stable hydrogen and oxygen isotope ratios of bottled waters of the world // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19. Р. 3442-3450.
2. Мухачев В.М. "Живая" вода. М. : Наука, 1975. 143 с.
3. Kirkina A.A., Lobyshev V.I., Lopina O.D., Doronin Y.K. et al. Isotopic effects of low concentration of deuterium in water on biological systems // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 2. P. 326-333.
4. Samkov A.A., Dzhimak S.S., Barishev M.G., Volchenko N.N. et al. The effect of water isotopic composition on Rhodococcus erythropolis biomass production // Biophysics. 2015. Vol. 60, N 1. P. 107-112.
5. Dzhimak S.S., Barishev M.G., Basov A.A., Timakov A.A. Influence of deuterium depleted water on freeze dried tissue isotopic composition and morphofunctional body performance in rats of different generations // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 4. Р. 614-619.
6. Basov A.A., Baryshev M.G., Dzhimak S.S., Bykov I.M. et al. The effect of consumption of water with modified isotope content on the parameters of free radical oxidation in vivo // Fiziol. Zh. 2013. Vol. 59, N 6. P. 49-56.
7. Fernandes De Lima V.M. Modulation of CNS excitability by water movement. The D2O effects on non-linear neuron-glial dynamics // J. Biophys. Chem. 2011. Vol. 2, N 3. P. 353-360.
8. Lisicin A.B., Barishev M.G., Basov A.A., Barisheva E.V. et al. Influence of deuterium depleted water on the organism of laboratory animals in various functional conditions of nonspecific protective systems // Biophysics. 2014. Vol. 59, N 4. Р. 620-627.
9. Avila D.S., Somlyai G., Somlyai I., Aschner M. Anti-aging effects of deuterium depletion on Mn-induced toxicity in a C. elegans model // Toxicol. Lett. 2012. Vol. 211. P. 319-324.
10. Somlyai G., Gyongyi Z., Budan F., Szabo I. et al. Deuterium depleted water effects on survival of lung cancer patients and expression of Kras, Bcl2 and Myc genes in mouse lung // Nutr. Cancer. 2013. Vol. 65, N 2. P. 240-246.
11. Cong F., Zhang Y., Sheng H., Ao Z. et al. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis // Exp. Ther. Med. 2010. Vol. 1. P. 277-283.
12. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г., Джимак С.С. и др. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 43-50.
13. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Дыдыкин А.С. и др. Коррекция метаболических процессов у крыс при хроническом эндотоксикозе с помощью реакций изотопного (D/H) обмена // Изв. РАН. Сер. биол. 2015. № 5. С. 518.
14. Назаров Н.М., Синяк Ю.Е., Ефременко Е.Н., Степанов Н.А. и др. Влияние легкоизотопной воды на рост бактериальной культуры // Авиакосм. и экол. мед. 2011. Т. 45, № 3. С. 63-66.
15. Фролов В.Ю., Барышев М.Г., Болотин С.Н., Джимак С.С. Способ получения биологически активной питьевой воды с пониженным содержанием дейтерия. Пат. РФ № 2438765 с приоритетом от 25.05.2010. Опубл. 10.01.2012. Заявка № 2010121324/05.
16. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М. : Гриф и К, 2012. 944 с.
17. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Оценка влияния ГМО растительного происхождения на развитие потомства крыс в трех поколениях // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 1. С. 14-28.
18. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А. и др. Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 1. С. 33-43.
19. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington, DC : The National Academies Press, 2011. 248 р.