Методические аспекты определения органического йода (йодтирозинов) в пищевых продуктах

РезюмеРазработка биологически активных добавок на основе органической формы йода (йодтирозинов) требует контроля веществ, образующихся в процессе синтеза. Не менее важны контроль содержания йодтирозинов в обогащенных продуктах и возможность технологического использования в рецептуре. Разработанная высокоточная и чувствительная методика определения йодтирозинов в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище позволит определять даже фоновые количества йодтирозинов (до 1 мкг/кг). Идентификацию йодтирозинов осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС). В статье приведены параметры хроматографического разделения 3-йод-Ь-тирозина и 3,5-дийод-Ь-тирозина и масс-спектрометрической идентификации распылением в электрическом поле, приведены методические рекомендации подготовки проб и очистки твердофазной экстракцией. Дано обоснование применению масс-спектрометрии как наиболее чувствительного и селективного метода определения органического йода по сравнению с ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором. Для идентификации и оценки места включения йода в белки использовали мягкий ферментативный гидролиз с применением про-теазы. Очистку пробы проводили методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах типа С18. Перед ВЭЖХ-МС/МС идентификацией йодтирозины предварительно дериватизировали смесью бутанол-ацетил хлорид. Степень извлечения йодтирозинов из матрицы пищевого продукта составила не менее 85%, коэффициент корреляции калибровочной кривой в диапазоне измерений 1-2000 нг/мл составил 0,999, достоверное определение йода в органической форме в пищевых продуктах в диапазоне содержания от 10 до 20 000 мкг/кг.

Ключевые слова:йодтирозины, йод в органической форме, высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектором, пищевые продукты

Вопр. питания. 2016. № 4. С. 91-98.

В настоящее время широкое распространение получили биологически активные добавки (БАД) на основе органической формы йода. В основе процесса получения органической формы йода лежит процесс ферментативного йодирования аминокислотных остатков сывороточных белков коровьего молока с последующей дополнительной очисткой от неорганического йода с помощью ультрафильтрации, а также сублимационной и распылительной сушкой [1]. Йодированные молочные белки используются для обогащения йодом пищевых продуктов, однако содержание органической формы этого микроэлемента в продукте не контролируется из-за отсутствия стандартизированных методик определения органического йода.

Существующие методики определения йода основаны на вольтамперометрическом определении неорганической формы йода [2, 3]. Метод основан на способности иодид-ионов накапливаться на поверхности ртутно-пленочного электрода в виде малорастворимого соединения с ртутью при определенном потенциале с последующим катодным восстановлением осадка при изменении потенциала [4]. Данный метод не применим для подтверждения подлинности БАД на основе йодированного молочного белка, так как необходимо определить органическую форму йода в виде йодтиро-зинов. Титрометрический метод определения йода не применим для обогащенных пищевых продуктов, так как предел количественного определения составляет около 50 мг/кг, что на 2 порядка выше содержания йода в обогащенных продуктах [5].

В 2012 г. во ВНИИМП им. В.М. Горбатова была разработана и аттестована методика контроля содержания йодтирозинов в биологически активных добавках (МИ 103.5-132-2012) [6], позволяющая определять органическую форму йода в виде йодтирозинов. Ключевым этапом является ферментативное расщепление белковой части пробы протеазой и последующая очистка ультрацентрифугированием, идентификацию осуществляют методом обращенно-фазовой хроматографии с классическим ультрафиолетовым детектором (УФ-детектором) поглощения. Однако применить данный метод для обогащенных продуктов невозможно вследствие низкой чувствительности УФ-детектора [7, 8]. Наиболее информативны для этих целей методы тандемной жидкостной масс-спектро-метрии, времяпролетной масс-спектрометрии и мат-рично-активированной лазерной десорбции/ионизации, позволяющие с высокой точностью определять структурные фрагменты, аминокислотную последовательность, посттрансляционные модификации белков и аминокислот, молекулярную массу белков в широком их диапазоне [9, 10].

Целью работы была разработка методики определения йодтирозинов в пищевых продуктах методом тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии. В результате проведенных исследований были выбраны оптимальные условия ферментативного гидролиза, изучена и установлена степень гидролиза и стабильность аналитического сигнала в сложных матрицах, подобраны параметры хромато-масс-спектрометрической идентификации.

Материал и методы

В процессе разработки методики определения органического йода был апробирован вольтамперометричес-кий метод определения йода в пищевых продуктах [11]. Для разрушения органической формы йода пробы предварительно подвергали сухой минерализации в муфельной печи ПМ-16П-1200 (ОАО "Электроприбор", Россия), в качестве стабилизатора использовали 0,5 М раствор нитрата калия, количество образующегося комплекса йодид-ионов определяли на полярографе "Вольта АВС-1.1" (НТФ "Вольта", Россия). Объектами исследований являлись обогащенные в соответствии с рекомендациями [11] добавкой "Йодказеин" хлеб, молоко и кисломолочные продукты. Искомые концентрации находились в диапазоне 80-100 мкг/кг (в пересчете на йод). По результатам анализа не получены сходимые результаты, предположительно это связано с возможными потерями в ходе подготовки проб, так как йод - летучий элемент. В случае обогащения неорганической формой йода погрешность данного метода в диапазоне концентраций 80-100 мкг/кг не превышала 30%.

Для определения места включения йода и подтверждения наличия йодированных аминокислот была разработана методика хромато-масс-спектрометрической идентификации йодтирозинов. Для оценки места включения йода в белки был использован мягкий ферментативный гидролиз йодированного белка и анализ методами хроматографии и масс-спектрометрии.

В качестве стандартных образцов были использованы 3-йод-Ьтирозин (МИТ) и 3,5-дийод-Ь-тирозин (ДИТ) ("Sigma Aldrich", США). Для приготовления градуировоч-ных растворов проводили дериватизацию йодтирозинов (МИТ и ДИТ). Для этого стандартные образцы МИТ и ДИТ массой по 10 мг растворяли в 100 см3 метанола, с применением ультразвуковой ванны "Branson 5510" ("Branson", США). Отбирали 1 см3 раствора и упаривали на роторном испарителе "Laborota 4003" ("Heidolph", Швейцария). Сухой остаток растворяли в 1 см3 смеси бутанол: ацетилхлорид (4:1) и проводили термостати-рование на водяной бане при 60 °С в течение 15 мин. Смесь упаривали и перерастворяли в 10 см3 20% водного раствора ацетонитрила. Градуировочные растворы индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ) доводили до концентрации 10 и 1 нг/мл последующим разведением в 20% растворе ацетонитрила в воде.

Подготовка проб включала ферментативный гидролиз пищевого продукта, извлечение и очистку целевых веществ методом твердофазной экстракции (ТФЭ), с последующей дериватизацией экстракта.

Перед проведением анализа пробу предварительно высушивали в сушильном шкафу при 65-70 °С и обезжиривали на аппарате Сокслета "Behr R 106 S" ("Behr Labor-Technik", Германия). Молоко и молочные продукты не нуждаются в предварительной подготовке. Навеску образца гидролизовали в буферном растворе Трис-HCl, pH 8,0, добавляли протеазу из Streptomyces griseus ("Sigma Aldrich", США) в количестве, составляющем 1/10 от массы пробы белка, и термостатировали не менее 16 ч при 37 °C. Гидролизат центрифугировали и фильтровали, после подвергали очистке методом ТФЭ. Патрон ТФЭ предварительно кондиционировали последовательно 2 см3 метанола и 2 см3 бидистиллированной воды. Отбирали 0,4 см3 гидролизата пробы, добавляли 0,1 см3 ацетонитрила, смесь наносили на патрон. Экстракцию с патрона осуществляли в две стадии последовательным элюированием 1 см3 метанола и 1,5 см3 смеси аце-тонитрил:0,1 М HCl (4:1,8). Элюент упаривали досуха при 60 °С, затем дериватизировали смесью бутанол:хлорис-тый ацетил (4:1) подобно стандартным образцам и перерастворяли в 20% водном растворе ацетонитрила.

Параметры анализа йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Анализ выполняли методом ВЭЖХ-МС/МС после хро-матографического разделения в установленных условиях на системе ВЭЖХ "Agilent 1200 series" ("Agilent Technologies", США) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) на масс-спектрометре "Agilent 6410 Triple Quadrupole" ("Agilent Technologies", США). Хрома-тографическое разделение гидролизата смеси после дериватизации проводили методом обращенно-фазной хроматографии на колонке с фазой С18 ("Agilent Eclipse XDB C18", 4,6x50 мм, 1,8 мкм) в условиях градиентного элюирования, представленных в табл. 1.

Для анализа подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования: температура источника - 100 °С; температура газа десольвации -320 °С; скорость потока газа десольвации - 8 л/мин; давление иглы распылителя - 30 psi.

Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в табл. 2.

Приготовленные стандарты анализировали 5-кратно, затем с помощью программного обеспечения "Masshunter Quantitative Analysis" (Version Build 4.0.225.0) по зависимости площадей MRM-переходов хроматогра-фических пиков стандартных образцов исследуемого соединения от концентрации аналита строили калибровочную кривую. Идентификацию аналитов осуществляли по абсолютному времени удерживания дочерних ионов целевых веществ, регистрируемых в режиме MRM. Нижний предел количественного определения по йодти-розинам (МИТ, ДИТ) составил 1 мкг/кг. Линейный коэффициент корреляции был равен 0,9994 в диапазоне измерений концентраций йодтирозинов от 1 до 2000 нг/мл. За счет использования колонок с мелкозернистым сорбентом (1,8 мкм) время анализа не превышало 5 мин. Полученные хроматограммы стандартных образцов йодтирозинов и калибровочные кривые представлены на рис. 1-3.

Результаты и обсуждение

Проблема создания, внедрения и промышленного выпуска йодсодержащих препаратов тесно связана с необходимостью разработки чувствительных методов анализа органических полигалогенидов на различных этапах получения, в БАД и биообъектах. Необходимость контроля содержания йодтирозинов обусловлена как технологическими факторами при производстве пищевых продуктов, так и использованием в рецептуре все большего количества химических соединений, которые могут взаимодействовать с образованием новых веществ.

Контроль качества пищевых продуктов на содержание йода в органической форме требует использования методов хроматографии, тандемной масс-спектрометрии. Основными критериями доказательства подлинности йодированных молочных белков является подтверждение наличия йодированных аминокислот, в частности йодтирозинов, и определение степени их йодирования. Идентификация йодтирозинов в сложных пищевых матрицах, обогащенных органической формой йода (мясомолочная продукция, хлебобулочная продукция, консервированные соки и др.), требует применения техники ВЭЖХ-МС/МС. Поведенные исследования показали, что при кислотном гидролизе (при 110 °С в течение 24 ч) йодированные аминокислоты, в частности йодти-розины, неустойчивы в присутствии концентрированной соляной кислотой. При щелочном гидролизе происходит рацемизация некоторых аминокислот и разрушение аргинина, лизина, цистина и цистеина. Гидролиз белков, осуществляемый с помощью протеолитических ферментов, лишен недостатков кислотного гидролиза. При ферментативном гидролизе были получены частичные гидролизаты, содержащие в различных соотношениях как малые пептиды, так и аминокислоты, в том числе триптофан. Для гидролиза использовали ферменты: папаин, панкреатин, протеазу. Максимальная степень гидролиза была достигнута при использовании протеазы из Streptomyces griseus.

Степень извлечения йодтирозинов из матрицы пищевого продукта составила не менее 85% (находилась в пределах 85-90%). Вследствие чего при вычислении массовой доли йодтирозинов, был введен эмпирический коэффициент 0,85, учитывающий потери йодтиро-зинов на стадии пробоподготовки.

Хроматограммы пробы пищевого продукта, обогащенного йодтирозинами, представлены на рис. 4


Установлено, что методы тандемной хромато-масс-спектрометрии в целях контроля качества обогащенной продукции (после внесения функциональных добавок, содержащих йодированные молочные белки) позволяют достоверно идентифицировать форму органического йода и контролировать ее количество (в виде йодтиро-зинов) в пищевых продуктах в диапазоне содержания от 10 до 20 000 мкг/кг. По результатам проведенных исследований разработан ГОСТ 33422 -2015 "Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором".

Работа выполнена в рамках, гранта Российского научного фонда № 15-16-10000.

Литература

1. Томчани О.В. Разработка технологий йодказеина и молочных продуктов, обогащенных йодированным белком : автореф. дис. ... канд. тех. наук. Обнинск, 2002. 36 с.

2. AOAC (2005). Official method of Analysis. 18th ed. Washington, DC : Association of Officiating Analytical Chemists, method 935.14 and 992.24.

3. AOAC (2007). Official method of Analysis (18th ed.). Washington, DC: Association of Officiating Analytical Chemists, method 992.22.

4. Жукова Г.Ф., Савчик С.А., Хотимченко С.А. Методы количественного определения йода в пищевых продуктах и продовольственном сырье // Вопр. питания. 2004. № 5. С. 42-48.

5. МУК 4.1.1106-02. "Определение массовой доли йода в пищевых продуктах и сырье титриметрическим методом". М., 2002. 10 с.

6. МИ 103.5-132-2012/01.00225-2011 "Определение содержания йодтирозинов в йодированных молочных белках и БАДах на их основе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии". М., 2012. 16 с.

7. Judprasong K., Jongjaithet N., Chavasit V. Comparison of methods for iodine analysis in foods // Food Chem. 2016. Vol. 193. P. 12-17.

8. Nitschke U., Stengel D.B. A new HPLC method for the detection of iodine applied to natural samples of edible seaweeds and commercial seaweed food products // Food Chem. 2015. Vol. 172. P. 326-334.

9. Comprehensive Handbook of Iodine. Determination of Iodine In Vivo and In Vitro by X-Ray Fluorescence Analysis: Methodology and Applications. Elsevier, 2009. P. 29.

10. Чернецова Е.С., Корякова А.Г. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией для исследования новых лекарственных веществ// Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7, № 2. С. 101-112. 11. MP 2.3.7.1916-04 "Применение йодказеина для предупреждения йоддефицитных заболеваний в качестве средства популяционной, групповой и индивидуальной профилактики йодной недостаточности". М., 2004. 12. МУК 4.1.1187-03. "Вольтамперометрическое определение йода в пищевых продуктах", М., 2003. 23 с.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»