Характеристика биодоступности наночастиц нульвалентного селена у крыс

РезюмеБиодоступность нульвалентного селена (Se) в форме наночастиц со средним диаметром 60 нм была охарактеризована у крыс, получавших селенодефицитный рацион. Показано, что внутрижелудочное введение наночастиц Se приводит к дозозависимому возрастанию концентрации Se в сыворотке крови, способствует нормализации пула тканевых тиолов, показателей иммунного статуса и апоптоза гепатоцитов. Обсуждаются перспективы использования наночастиц Se в качестве его источника в питании.

Ключевые слова:нульвалентный селен, наночастицы, крысы, биодоступность

Селен (Se), являющийся биоантиоксидантом непрямого действия [ 9] и участвующий в построении ряда важных ферментов [3, 9, 19], поступает в организм с пищей в естественных условиях в форме содержащихся в пищевых белках аминокислот селеноцистеина и селенометионина. В качестве источников Se, применяемых при коррекции его дефицита и обогащении специализированных продуктов для энтерального питания и заменителей женского молока, наиболее часто используют неорганические соли - селенат и селенит натрия [4]. До недавнего времени было принято считать, что элементарный (нульвалентный) Se биодоступен для человека и животных в очень малой степени [2, 11]. Вместе с тем перевод этого вещества в форму наночастиц размером <100 нм, сопровождающийся резким возрастанием химического потенциала и реакционной способности [1], может, по-видимому, существенно изменить его биохимические свойства. Так, в некоторых работах недавно показано, что элементарный Se в виде наночастиц при введении в заведомо завышенных, нефизиологических количествах может усваиваться в организме мышей [16, 23]. Целью настоящего исследования было изучение биодоступности нульвалентного Se в составе наночастиц при их внутрижелудочном введении в нутритивно адекватных количествах крысам с алиментарной недостаточностью данного микроэлемента.

Материал и методы

Наночастицы (НЧ) Se были получены при помощи абляции массивной мишени элементарного (красного) Se квалификации х.ч. в деионизованной воде без добавления поверхностно-активных веществ. Методика генерации подробно описана в [18]. Использовался лазер на парах меди с длиной волны 510,6 нм, средней мощностью около 4 Вт и частотой повторения 15 нс величиной импульсов 15 кГц. После наработки достаточного количества наночастиц осуществлялась их фрагментация с помощью того же лазерного пучка, но в отсутствие мишени. Препарат НЧ был исследован методом трансмиссионной электронной микроскопии, с использованием электронного микроскопа CX100 ("Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографии в цифровой форме анализировали с помощью программы "Image Tool". Репрезентативная электронная микрофотография препарата и распределение наночастиц Se по размеру представлены на рисунке. Средний размер частиц составил 65,3±1,6 нм, диапазон изменений - от 8 до 218 нм, 90-й перцентиль - 100 нм; вид распределения был близок к нормальному.

Исследование проведено на 59 крысах самцах Вистар с исходной массой тела 50±2 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Животные были разделены на 5 групп. На протяжении всего эксперимента крысы 1-й группы (контрольной) получали полноценный по основным пищевым веществам, а также макро- и микронутриентам общевиварный рацион (ОВР). Животные остальных 4 групп получали полусинтетический селендефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США). Содержание Se в корме, по данным спектрофлюориметрического определения, составило 0,038 мкг/кг. Рационы и деионизованую воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа.

С 10-го дня эксперимента и на протяжении последующих 21 дня крысам 2-5-й (опытных) групп внутрижелудочно через зонд вводили: деионизованную воду (2-я группа); НЧ Se из расчета 0,04 мг Se на 1 кг массы тела (3-я группа); НЧ Se из расчета 0,4 мг/кг Se на 1 кг массы тела (4-я группа) или раствор селенита натрия (Na2SeO3) х.ч. в деионизованной воде из расчета 0,04 мг Se на 1 кг массы тела (5-я группа). Крыс всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах с точностью ±0,5 г и определяли динамику прироста массы тела.

По окончании эксперимента животных обескровливали под эфирной анестезией, подвергали патолого-анатомическому вскрытию, определяли абсолютную массу печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников путем взвешивания на электронных весах с точностью ±0,01 г.

Характеристика наночастиц элементарного Se методом просвечивающей электронной микроскопии: а - репрезентативная микрофотография, увеличение  12 000; б - распределение наночастиц по размеру

Ось абсцисс - диаметр по большой оси эллипсоида, нм; ось ординат - число частиц в интервале ±7 нм. Сплошной линией указана кривая нормального распределения частиц.

Se в сыворотке крови и в печени определяли микрофлюориметрическим методом [5]. Гематологические показатели (число эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрацию Hb в эритроците), общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе "Coulter ACTTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлюориметре "FC 500" (фирма "Beckman Coulter International S.A.", Австрия) по методу [10]. Для этого получали суспензию гепатоцитов с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" (фирма "Becton Dickenson and Company",США). Гепатоциты (концентрация клеток 1106 см-3) окрашивали конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) (фирма "Beckman Coulter Int.", США). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе обработки хранили на льду. Результаты представляли в виде процентного соотношения живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза в расчете на 10 тыс. просчитанных объектов в каждом образце. Клеточное звено иммунного статуса крыс определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания лимфоцитов цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep (Beckman Coulter, США). Активность глутатионпероксидазы плазмы крови (GPX) определяли ферментативным спектрофотометрическим методом согласно [8]. Всасывание в кровь введенного перорального белкового антигена - куриного овальбумина изучали иммуноферментным методом [17].

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета программ SPSS 18.0, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Абсолютный и относительный приросты массы тела животных во всех опытных группах на протяжении всего эксперимента не различались (р>0,05 при попарном сравнении всех групп по данным недельных прибавок массы тела). В целом за 30 дней опыта прирост массы крыс в опытных группах составил соответственно 60±4, 58±3, 51±4 и 57±5% от исходного (без достоверных различий между группами). Выявленные различия относительной массы некоторых внутренних органов (печени, почек, селезенки, семенников) были незначительными по величине и не могли быть однозначно соотнесены ни с формой, ни с дозой добавки Se.

Как следует из данных табл. 1, минимальный уровень Se в сыворотке крови отмечался у животных 2-й группы. По мере увеличения дозы НЧ Se его концентрация в сыворотке крови нарастала и при дозе 0,4 мг/кг массы тела значительно превышала уровень, наблюдавшийся у крыс 1-й группы, находившихся на ОВР. Вместе с тем у животных, получавших добавку селенита натрия, практически тот же уровень Se сыворотки отмечается уже при дозе НЧ Sе в 10 раз меньшей, т.е. при 0,04 мг/кг.

Уровень Se в ткани печени практически не отличался от наблюдавшегося у крыс, получавших ОВР и селенодефицитный корм с добавкой наночастиц 0,04 мг/кг. В то же время у животных 2-й группы выявлена некоторая тенденция к снижению содержания Se в печени, свидетельствующая об уменьшении запасов микроэлемента в депо организма. У животных, получавших 10-кратно увеличенную дозу наночастиц или селенит натрия, этот показатель резко (более чем 2-кратно) и достоверно (p<0,001) возрастал. Различия в динамике накопления Se в крови и печени, по-видимому, связаны с тем, что концентрация Se в сыворотке крови зависит от селенопротеинов, экспрессия которых определяется нутритивным статусом этого микроэлемента. Указанное различие представляет лабильный показатель обеспеченности, в то время как уровень Se в ткани печени отражает, скорее, состояние его консервативного тканевого депо [14, 21].

Таблица 1. Показатели, характеризующие обеспеченность селеном крыс 1-5-й групп

Как следует из данных табл. 2, активность GPX в плазме крови крыс 1-5-й групп достоверно не различалась. Небольшое нарастание активности фермента у животных 3-й и 4-й групп по сравнению со 2-й группой имело характер тенденции (без статистического подтверждения). Эти результаты согласуются с представленными в литературе [19] о высокой степени консерватизма показателя активности данной формы GPX, претерпевающей значительное снижение, как правило, только при глубокой степени дефицита Se, которая, по-видимому, не была достигнута в ходе настоящего эксперимента. Вместе с тем, как следует из табл. 2, концентрация тканевых тиолов печени (представленных у крысы главным образом глутатионом) была достоверно понижена во 2-й группе (недостаточность Se) и полностью восстанавливалась до контрольного уровня во всех группах, получавших добавки Se. Показатель всасывания белкового антигена (овальбумина), по некоторым данным, отрицательно коррелирующий у крыс со статусом Se и восстановленного глутатиона [6, 7], в группах, получавших добавки Se, достоверно не отличался от показателя у животных 1-й и 2-й групп (см. табл. 2).

Исследование гематологических показателей животных 1-5-й групп показало, что все изученные параметры находились в пределах нормальных значений для данного пола и возраста животных. Различий, которые могли бы быть соотнесены с формой и дозой вводимых препаратов Se, не выявлено. Вместе с тем результаты оценки иммунного статуса, полученные методом проточной цитофлюориметрии (табл. 3), показали, что относительное содержание T-хелперов (CD3+CD4+) и иммунорегуляторный индекс (отношение CD4+/CD8+) были достоверно и резко снижены у животных 2-й группы (с дефицитом Se). Одновременно относительное число цитотоксических T-лимфоцитов (CD3+CD8+) в этой группе было столь же резко повышено. У крыс всех групп, получавших обе формы Se, в том числе НЧ (независимо от дозы последних) все эти показатели практически полностью возвращались к норме и недостоверно отличались от таковых в 1-й (контрольной) группе, что согласуется с данными литературы о влиянии обеспеченности Se на состояние системы иммунитета [13].

Исследование апоптоза клеток печени (табл. 4) выявило достоверное снижение относительного числа живых клеток в гейте гепатоцитов и повышение процента гепатоцитов в состоянии апоптоза у животных 2-й группы (с дефицитом Se). У всех крыс, получавших внутрижелудочно Se, относительное содержание клеток в состоянии апоптоза в гейте гепатоцитов было достоверно ниже (в 4-й группе наблюдалась лишь тенденция к снижению) по сравнению с таковыми в контрольной и Se-дефицитной группах.

Таблица 2. Уровень небелковых тиолов печени, активность глутатионпероксидазы (GPX) плазмы крови и всасывание антигенного овальбумина (ОВА) у крыс, потреблявших селенодефицитный рацион и получавших различные добавки Se

Таблица 3. Показатели лимфоцитов периферической крови, характеризующие иммунологический статус крыс 1-5-й групп

Таблица 4. Показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 1-5-й групп

Таким образом, полученные результаты показывают, что наночастицы элементарного Se, введенные в желудочно-кишечный тракт крыс, у которых была обнаружена недостаточность этого микроэлемента, могут усваиваться организмом, хотя, возможно, и несколько менее эффективно, чем селенит натрия. Вопрос о механизмах усвоения нульвалентного Se в организме в настоящее время далек от разрешения. Известно, что превращение селеноцистеина пищи в анион гидроселенида (основная метаболизируемая форма этого элемента в синтезе специфических селенопротеинов) осуществляется под действием фермента селеноцистеинлиазы через промежуточное образование нульвалентного Se [12, 19]. Это указывает на существующую в принципе возможность метаболизации нульвалентного Se, которая может протекать только гетерофазно (с учетом полной нерастворимости этой валентной формы Se в биологическом окружении) и резко ускоряться в наночастицах, обладающих наиболее высокой удельной поверхностью.

При решении вопроса о выборе пищевого источника Se следует учитывать, что биодоступность его неорганических солей (селенатов и селенитов), является, по-видимому, максимальной [2]. Вместе с тем высокая токсичность неорганических соединений Se значительно ограничивает возможность их использования. В этом отношении гораздо лучшие перспективы для профилактики недостаточности Se имеют его органически связанные формы (селенометионин, селенсодержащая спирулина, автолизат селеносодержащих дрожжей), которые обладают несколько меньшей усвояемостью и менее токсичны, чем неорганические соли Se [4]. В этом ряду возможных источников Se находятся, как следует из полученных данных, и наночастицы нульвалентного Se, токсичность которых, согласно работам [15, 20, 22], ниже, чем у его неорганических производных. Настоящая работа частично выполнена за счет средств Федерального бюджета по государственному контракту с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 гг.".

Литература

1. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

2. Гмошинский И.В., Мазо В.К. // Вопр. питания. - 2006. - Т. 75, № 5. - С. 15-21.

3. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Сб. науч. тр. "Экология моря". - Севастополь: Национальная академия наук Украины, 2000. - Вып. 54. - С. 5-19.

4. Гмошинский И.В., Мазо В.К. // Medicina Altera. - 1999. - № 4. - С. 18-22.

5. Голубкина Н .А. // Журн. аналитической химии. - 1995. - Т. 50, № 8. - С. 492-497.

6. Голубкина Н.А., Гмошинский И.В., Зорин С.Н. и др. // Вопр. питания. - 1998. - Т. 67, № 3. - С. 18-22.

7. Голубкина Н.А., Мазо В.К., Зорин С.Н. и др. // Вопр. мед. химии. - 2000. - Т. 46. № 1. - С. 22-27.

8. Ивахненко В.И., Мальцев Г.Ю., Васильев А.В., Гмошинский И.В. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 11-17.

9. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / Под ред. В.А. Тутельяна, В.А. Княжева, С.А. Хотимченко и др. - М.: Изд-во РАМН, 2002. - 260 с.

10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии: клиническое применение. - Челябинск, 2008. - 112 с.

11. Combs G.F., Garbisu C., Yee B.C. et al. // Biol. Trace Elem. Res. - 1996. - Vol. 52, N 3. - P. 209-225.

12. Deagen J.T., Butler J.A., Beilstein M.A. et al. // J. Nutr. - 1987. - Vol. 117, N 1. - P. 91-98.

13. Hoffmann P.R., Berry M.J. // Mol. Nutr. Food Res. - 2008. - Vol. 52, N 11. - P. 1273-1280.

14. Janghorbani M., Martin R.F., Kasper L.J. et al. // Am. J. Clin. Nutr. - 1990. - Vol. 51. - P. 670-677.

15. Jia X., Li N., Chen J. // Life Sci. - 2005. - Vol. 76, N 17. - P. 19 8 9 - 2 0 0 3 .

16. Peng D., Zhang J., Liu Q., Taylor E.W. // J. Inorg. Biochem. - 2007. - Vol. 101, N 10. - P. 1457-1463.

17. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

18. Shafeev G.A. Nanoparticles: New Research / Ed. Simone Luca Lombardi. - New York: Nova Science Publishers, 2008. - 978 р.

19. Sunde R .A. // Annu. Rev. Nutr. - 1990. - Vol. 10. - P. 451-474.

20. Wang H., Zhang J., Yu H. // Free Radic. Biol. Med. - 2007. - Vol. 42, N 10. - P. 1524-1533.

21. Waschulewski I.H., Sunde R.A. // J. Nutr. - 1988. - Vol. 118, N 3. - P. 367-374.

22. Zhang J., Wang H., Yan X., Zhang L. // Life Sci. - 2005. - Vol. 76, N 10. - P. 1099-1109.

23. Zhang J., Wang X., Xu T. // Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 101, N 1. - P. 22-31.