Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. IV. Влияние на микробиоту кишечника, иммунологические показатели

РезюмеНаноразмерное коллоидное серебро (НКС) "Арговит®-С", стабилизированное поливинилпирролидоном (ПВП) и содержащее наночастицы (НЧ) серебра диаметром 10-80 нм, вводили растущим крысам-самцам (масса тела 80±10 г) в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут с потребляемым рационом в дозах 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела в день в расчете на серебро (Ag). Животные контрольных групп получали деионизованную воду и ПВП. В содержимом слепой кишки с помощью стандартных микробиологических методов определяли концентрацию основных и транзиторных компонентов кишечной микробиоты, антагонистическую активность симбиотических бифидобактерий. Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах (Лф) периферической крови определяли методом проточной цитофлуориметрии; уровень цитокинов IL-10, IL-13, TNFα в сыворотке крови изучали иммуноферментным методом. Показано, что подострое введение Ag во всех изученных дозах не приводит к значительным изменениям в составе нормальной микробиоты, оказывая тем не менее угнетающее действие на рост ряда транзиторных компонентов, представленных в том числе условно-патогенными видами микроорганизмов. В числе изученных иммунологических показателей отмечено снижение количества B-Лф при максимальной дозе НКС, тогда как изменения остальных параметров системы иммунитета не имели однозначной зависимости от дозы вводимого продукта. Полученные данные проанализированы в свете представленных в предыдущих публикациях данных о влиянии НКС на интегральные, морфологические, гематологические, биохимические и энзимологические показатели животных в 92-суточном эксперименте. Сделан вывод о том, что значимые признаки подострой пероральной токсичности НКС отмечаются начиная с дозы 1 мг на 1 кг массы тела по Ag, максимальная недействующая доза (NOAEL) может быть оценена величиной 0,1 мг на 1 кг массы тела.

Ключевые слова:серебро, наночастицы, крысы, подострая токсичность, кишечная микробиота, лимфоциты, цитокины, NOAEL

Вопр. питания. 2016. № 3. С. 27-38.

Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноразмерного коллоидного серебра (НКС), производимого в больших масштабах современной наноиндустрией, является важной задачей ввиду его присутствия в большом числе видов потребительской продукции (включая пищевые продукты и биологически активные добавки к пище) и возможности контаминации им различных объектов окружающей среды [1-3]. В цикле совместных исследований ФГБНУ "НИИ питания" и ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора решалась задача определения пороговых токсических доз и максимальных недействующих доз (NOAEL) промышленно выпускаемого НКС в условиях подострого 92-суточного перорального введения растущим крысам. Результаты оценки интегральных, морфологических, гематологических, цитологических, биохимических показателей организма животных в соответствии с методами, установленными в Российской Федерации (МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов"), были представлены в предыдущих публикациях [4-6]. Известно, что наночастицы (НЧ) серебра обладают в определенных условиях выраженным антимикробным действием, связанным, по современным представлениям, с их умеренной растворимостью в некоторых биологических средах [7, 8]. Ввиду этого целью данной работы явилось изучение состояния микробиома толстой кишки у крыс, перорально получающих НКС, в подостром 92-суточном эксперименте, а также тесно связанных с этим показателей клеточного иммунитета.

Материал и методы

В работе использован промышленно выпускаемый препарат НКС "Арговит®-C" (ООО НПЦ "Вектор-Вита", Новосибирск, РФ). Его подробная характеристика как наноматериала была представлена ранее [6]. По составу изучаемый образец представлял собой водную дисперсию НЧ металлического серебра, принадлежащих к фракциям с диаметром менее 5, 10-20 и 50-80 нм, стабилизированную поливинилпирролидоном (ПВП, пищевая добавка Е1201).

Эксперимент проведен в общей сложности на 75 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±10 г, полученных из питомника РАН "Столбовая".

На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Животные были случайным образом разделены на 5 групп по 15 особей. Крысам 1-й (контрольной) группы вводили деионизованную воду, 2-й группы - носитель ПВП в виде водного раствора в дозе 200 мг на 1 кг массы тела. Крысы 3, 4 и 5-й групп получали раствор НКС в дозе соответственно 0,1, 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в пересчете на серебро.

Животным 3-й и 4-й групп дополнительно вводили ПВП в количестве, соответствующем его поступлению с препаратом НКС в 5-й группе. В течение первых 30 сут введение тестируемых препаратов осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут НКС и ПВП добавляли к корму животных; дозу при этом рассчитывали, исходя из количества фактически потребленного рациона.

На 92-е сутки животных обескровливали под глубокой эфирной анестезией. Кровь собирали с добавлением антикоагулянта (трикалиевая соль ЭДТА) в количестве 0,01% по массе. Содержимое слепой кишки отбирали в асептических условиях в стерильные контейнеры, разводили фосфатно-тиогликолевом буферным раствором и количественно засевали в дифференциальнодиагностические и селективные среды в соответствии со стандартной методикой (МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза").

Содержание бифидобактерий определяли на тиогликолевой среде; лактобацилл - на среде MRS; бактерий семейства Enterobacteriaceae - на среде Эндо и цитратном агаре, бактерий рода Staphylococcus - на желточносолевом агаре и среде Байрд-Паркера; Streptococcus spp. - на кровяном агаре; Enterococcus spp. - на молочно-ингибиторной среде (МИС), Bacteroides spp. - на кровяном агаре с неомицином, сульфитредуцирующих клостридий - на модифицированной железосульфитной среде; плесневых грибов - на среде Чапека. Содержание микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий.

Оценку антагонистической (кислотообразующей) активности популяций бифидобактерий проводили путем определения снижения рН культуральной жидкости (тиогликолевой среды) на 5-е сутки инкубации с помощью рН-метра. Критериями служили пределы рН: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности.

Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах (Лф) периферической крови определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями (“Beckman Coulter”, США). Измерения выполняли на проточном цитофлуориметре “FC-500” (“Beckman Coulter”, США) по программе Cytomics CXP Software. Общее содержание CD45RA+ (B-Лф), CD3+ (Т-Лф) и CD161a+ (естественных киллеров) выражали в % от общего числа проанализированных.

Содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических Лф) определяли как их процентную долю в общем количестве CD3+-клеток.

Определение цитокинов IL-10 и TNFα в сыворотке крови крыс проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов “Bioscience” (“Bender MedSystems GmbH”, Австрия), IL-13 - набора (“Cloud Clone Corp.”, США). Оптическую плотность измеряли на автоматическом планшетном фотометре "ЭФОС 9605" ("Сапфир", РФ).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни, критериям ANOVA и Краскела-Уоллиса (однофакторный дисперсионный анализ). Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Как следует из данных, представленных в табл. 1, поступление в течение 92 сут НКС во всех изученных дозах оказывало сравнительно слабое воздействие на основные популяции микробиоты слепой кишки крыс. Общее количество аэробов и анаэробов, численность лактобактерий и энтеробактерий оставалась без изменения у животных всех опытных групп.

Содержание бифидобактерий у крыс 3-й группы оказалось достоверно (p2-3<0,05), но незначительно по абсолютной величине (менее чем в 2 раза) снижено по сравнению с уровнем у животных 2-й группы, получавших ПВП. У животных 4-й и 5-й групп, получавших бол_ ьшие дозы НКС, подобный эффект не наблюдался. Содержание бактероидов у крыс 3-й и 4-й групп было, напротив, достоверно повышено в сравнении с животными 1-й группы, но не 2-й, из чего следует, что данное воздействие является, по-видимому, неспецифическим, связанным с воздействием ПВП на эту группу организмов. Это же, по всей видимости, относится к наблюдаемому достоверному снижению численности энтерококков у крыс 3-й группы в сравнении с животными 1-й группы. Количество общих стрептококков и стафилококков у животных 5-й группы, получавших НКС в наибольшей дозе, оказалось достоверно и значительно (более чем на порядок величины) сниженным в сравнении с показателем для животных 1-й группы (p1-4,1-5<0,05), имело тенденцию (p>0,05) к снижению по сравнению с таковым у животных 2-й группы. Данное изменение, по-видимому, нельзя рассматривать как неблагоприятное, поскольку известно, что в составе данных групп организмов присутствуют некоторые условно-патогенные виды.

Антагонистическая кислотообразующая активность бифидобактерий слепой кишки у всех крыс опытных групп, получавших НКС, достоверно не отличалась от контроля.

Результаты оценки содержания транзиторных компонентов кишечной микробиоты, представленные в табл. 2, на качественном уровне позволяют заключить, что НКС, во всяком случае в наибольшей дозе (10 мг/кг, 5-я группа), оказывает подавляющее действие на развитие таких из них, как S. aureus, гемолитические стрептококки и протей. В отношении двух последних популяций эффект подавления роста наблюдается по сравнению с 1-й группой и при меньших дозах НКС (0,1-1 мг на 1 кг массы тела). Таким образом, не оказывая значительного воздействия на большинство основных групп симбиотической микрофлоры, НКС, по-видимому, способно ингибировать развитие ряда транзиторных популяций, в составе которых могут присутствовать условно-патогенные виды, что является благоприятным фактором для организма в целом.

Отсутствие дисбиотических изменений в толстой кишке крыс, получавших НЧ серебра, может быть связано с тем, что эти НЧ, согласно новым данным [7, 8], имеют сами по себе незначительную антимикробную активность, а их бактерицидный потенциал обусловлен в основном эмиссией из них ионов Ag+ в присутствии окислителей. В анаэробных условиях толстой кишки растворение НЧ серебра происходит в очень малой степени, что и определяет, по-видимому, их относительно слабо выраженное действие в отношении наиболее многочисленных популяций нормофлоры.

При оценке изменений в показателях клеточного иммунитета (табл. 3) следует принимать во внимание, что введение носителя наноматериала - ПВП - само по себе оказывает на них определенное воздействие.

Так, у животных 2-й группы отмечено достоверное (p1-2<0,05) повышение количества В-Лф (на 36%) и снижение общих Т-Лф (на 23%). У крыс 5-й группы, получавшей НКС в наибольшей дозе, эти показатели в основном возвращались к уровню, характерному для 1-й группы (p1-5>0,05; p2-5<0,05). При этом зависимость количества Т-Лф от дозы НКС является немонотонной: наблюдается также снижение их количества у животных 3-й группы по сравнению со 2-й. Число NK-клеток при введении НКС достигало минимума в 4-й группе (доза серебра 1 мг на 1 кг массы тела).

Такие важные показатели, как число Т-хелперов и Т-цитотоксических Лф и их соотношение у животных, получавших НКС, достоверно не отличались от контроля.

Влияние приема НКС на продукцию цитокинов также не демонстрирует однозначной зависимости от дозы. Как следует из данных рисунка, концентрация IL-10 достоверно снижалась у животных 3-й группы в сравнении со 2-й группой; аналогичная тенденция отмечается и для крыс 5-й группы. TNFα в пределах чувствительности метода выявлен только у 4 из 9 тестированных животных 4-й группы (данные не показаны).

Достоверных различий в уровне IL-13 между группами животных не наблюдается. В целом эти данные свидетельствуют об отсутствии значимого нарастания воспалительных процессов с увеличением дозы вводимого НКС.

Таким образом, влияние перорального приема НКС на показатели клеточного иммунитета является неоднозначным; единственным индикатором, позволяющим установить пороговую дозу, является, по-видимому, содержание В-Лф, для которого какие-либо достоверные изменения отсутствуют вплоть до дозы 1 мг на 1 кг массы тела включительно.

Основные итоги экспериментов [4-6] по определению пероральной NOAEL для НЧ серебра, стабилизированных ПВП, представленные в табл. 4, показывают, что данный наноматериал может оказывать различные неблагоприятные воздействия на организм, число и степень проявления которых монотонно нарастают в зависимости от дозы. При дозе 1 мг на 1 кг массы тела (4-я группа) наряду с выраженными морфологическими изменениями в печени отмечаются сдвиги в активности микросомальных монооксигеназ печени изоформ CYP1A2 и 2B1, глутатионпероксидазы эритроцитов. При дозе 10 мг на 1 кг массы тела (5-я группа) дополнительно к этому отмечаются изменения в активности CYP 1A1, глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы печени, общей лизосомальной β-галактозидазы и арилсульфатаз А и В, ряда гематологических показателей эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, числа B-лимфоцитов, относительной массы легких. Прибавка массы тела у крыс 5-й группы к концу эксперимента достоверно возрастает, что, возможно, связано со снижением уровня двигательной активности у животных данного возраста. В течение 3-месячного периода введения НКС в 5-й группе погибли 4 животных; в остальных группах летальность отсутствовала. Таким образом, НКС токсичен для крыс при пероральном ежедневном введении в дозе 1 мг на 1 кг массы тела и более. Причиной такого действия по современным представлениям является главным образом эмиссия токсичных ионов Ag+ из НЧ во внутренней среде организма [9], однако не исключается и прямой механизм токсичности НЧ, связанный с каталитической генерацией кислородсодержащих свободных радикалов [10]. Альтернативное объяснение наблюдаемых эффектов может состоять во влиянии вводимого серебра на состояние микроэлементного гомеостаза [11], в частности на бионакопление и экскрецию эссенциальных микроэлементов (цинк, селен и др.).

Представленные в литературе оценки для NOAEL при подостром (1 мес и более) пероральном введении НКС частично противоречивы. Авторы исследования [12] не выявили признаков токсичности НЧ серебра, модифицированных ПВП, в дозе 90 мг на 1 кг массы тела. С другой стороны, в работе [13] отмечалось наличие токсического действия НКС на печень крыс в дозе 125 мг на 1 кг массы тела и более. У мышей, получавших НЧ серебра в дозах свыше 1 мг на 1 кг массы тела, происходили гистопатологические изменения в печени и почках [14]. В исследовании [15] отмечали ряд неблагоприятных сдвигов интегральных и биохимических показателей в организме крыс при дозе НКС, стабилизированного ПВП, 1 мг на 1 кг массы тела. Для НЧ серебра с немодифицированной поверхностью пороговая доза токсического действия, согласно [16], составила менее 0,01 мг/кг.

На основе данных, представленных в цикле работ [4-6], можно заключить, что для НЧ серебра, модифицированных ПВП, значимые признаки токсичности отмечаются, начиная с дозы 1 мг на 1 кг массы тела, вводимой перорально, и NOAEL может быть оценена величиной 0,1 мг на 1 кг массы тела. При переходе на человека, с учетом введения двух 10-кратных коэффициентов запаса, безопасная доза НЧ в расчете на серебро должна составить 0,001 мг/кг, что соответствует дозе 70 мкг в день для человека с массой тела 70 кг. Следует отметить, что данная оценка совпадает с принятым в настоящее время в России верхним допустимым уровнем потребления серебра как химического элемента [17].

Литература

1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Наночастицы серебра в природе, промышленности, упаковочных материалах, предназначенных для пищевых продуктов: характеристика возможных рисков// Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 6. С. 13-20.

2. Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation of cumulative aquatic expo-sure and risk due to silver: contribution of nano-functionalized plastics and textiles// Sci. Total Environ. 2008. Vol. 390, N 2-3. P. 396-409.

3. Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S., Lead JR. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment // Environ. Int. 2011. Vol. 37, N 2. P. 517-531.

4. Шумакова А.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С., Трушина Э.Н. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92дневном эксперименте на крысах. I. Характеристика наноматериала, интегральные, гематологические показатели, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 6. С. 46-57.

5. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Довбыш А.А. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92дневном эксперименте на крысах. II. Морфология внутренних органов // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 1. С. 47-55.

6. Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Ворожко И.В., Сенцова Т.Б. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92-дневном эксперименте на крысах. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 2. С.14-23.

7. Sheehy K., Casey A., Murphy A., Chambers G. Antimicrobial properties of nano-silver: A cautionary approach to ionic interference // J. Colloid Interface Sci. 2015. Vol. 443, N 1. P. 56-64.

8. Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala H.L., Colvin V.L., Alvarez P.J.J. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles// Nano Lett. 2012. Vol. 12, N 8. P. 4271-4275.

9. Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging// Nanomedicine (London). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.

10. Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms// Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59.

11. Benetti F., Bregoli L., Olivato I., Sabbioni E. Effects of metal(loid)based nanomaterials on essential element homeostasis: the central role of nanometallomics for nanotoxicology// Metallomics. 2014. Vol. 6, N 4. P. 729-747.

12. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure// ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 7427-7442.

13. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 575-583.

14. Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 162-168.

15. Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 9-18.

16. Ходыкина Н.В., Горшенин А.В., Клаучек В.В., Почепцов А.Я. и др. Экспериментальное изучение хронической пероральной токсичности сферических нефункционализированных наночастиц серебра // Нанотоксикология: достижения, проблемы, перспективы. Волгоград , 2014. С. 65-66.

17. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1. 19150-04.