Влияние рутина и гесперидина на экспрессию гена Nrf2 и активность гемоксигеназы-1 и NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы при их раздельном и совместном действии

РезюмеФлавоноиды рутин (Р) и гесперидин (Гес) обладают широким спектром биологической активности, основу которой составляют выраженные антирадикальные свойства и способность повышать активность антиоксидантных ферментов, в том числе активность гемоксигеназы-1 (ГО-1) и NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы (ХР). Полагают, что главным регулятором активности ГО-1 и ХР является транскрипционный фактор Nrf2. Целью настоящей работы было изучение влияния Р и Гес на экспрессию гена и белка Nrf2, на активность и экспрессию мРНК и белка ГО-1 и ХР при их раздельном и совместном действии. Включение в рацион крыс-самцов линии Вистар (с исходной массой тела 180-200 г) в течение 14 дней Р (400 мг на 1 кг массы тела) и Гес (400 мг на 1 кг массы тела) раздельно или совместно не оказывало токсического или прооксидантного действия, которое оценивали по уровню в печени малонового диальдегида, гидроперекисей липидов, восстановленного и окисленного глутатиона. Р и в меньшей степени Гес вызывали возрастание активности ГО-1 и ХР. Их совместное действие на активность ГО-1 практически не отличалось от раздельного эффекта флавоноидов. Комбинированное действие Р и Гес на активность ХР носило аддитивный характер. По данным вестерн-блоттинга, изменения уровня белка ГО-1, ХР и Nrf2 при действии Р и Гес раздельно или совместно не являлись статистически значимыми. Результаты полимеразной цепной реакции в режиме реального времени показали наличие небольших, хотя и статистически значимых, изменений уровня экспрессии генов Nrf2 (Nrf2), ГО-1 (Hmox1) и ХР (NQO1) как при раздельном, так и при совместном действии Р и Гес. Таким образом, полученные результаты показали, что высокие дозы Р и Гес раздельно или совместно не оказывают значительного влияния на экспрессию гена и белка транскрипционного фактора Nrf2 и что обнаруженное возрастание активности ГО-1 и ХР не связано с усилением экспрессии генов Hmоx1 и NQO1.

Ключевые слова:рутин, гесперидин, Nrf2, гемоксигеназа-1, хинонредуктаза

Вопр. питания. 2016. № 3. С. 18-27.

Рутин (Р) и гесперидин (Гес) являются основными представителями двух наиболее изученных подклассов флавоноидов - флавонолов и флаванонов.

Они имеют близкую структуру, оба содержат в качестве гликозильного остатка рутинозу (6-О-L-рамнозил-Dглюкозу), оба в толстой кишке подвергаются последовательному действию бактериальных ферментов - α-L-рамнозидазы и β-глюкозидазы - с образованием агликонов кверцетина и гесперидина, метаболизм которых в энтероцитах осуществляется одними и теми же ферментами - UDP-глюкуронозилтрансферазами и сульфотрансферазами [1, 2]. Р и Гес, как и их агликоны - кверцетин и гесперидин, обладают широким спектром биологической активности, в основе которой находятся выраженные антиоксидантные свойства [3-5]. В разных модельных системах in vitro Р и Гес проявляют антирадикальную активность, сравнимую или превосходящую активность таких природных антиоксидантов, как витамины Е и С [6]. В то же время в исследованиях in vivo в условиях окислительного стресса разной этиологии было обнаружено, что антиоксидантная активность Р и Гес связана не только с их антирадикальными свойствами, но и со способностью активировать антиоксидантные ферменты [4, 7-9].

В настоящее время установлено, что главным регулятором активности антиоксидантных ферментов является транскрипционный фактор Nrf2 [10-13]. Он инициирует экспрессию генов, содержащих в промоторной области регуляторный элемент ARE (антиоксидант-респонсивный элемент). В цитоплазме клетки Nrf2 связан с репрессивным белком Keap1, который регулирует его убиквитинирование и деградацию и определяет его низкую базальную экспрессию, достаточную для поддержания внутриклеточного гомеостаза. В условиях окислительного стресса действие оксидантов и электрофилов приводит к модификации (окислению или алкилированию) специфических тиолов цистеина в молекулах Keap1 и Nrf2, подавлению убиквитинирования Nrf2, освобождению и транслокации его в ядро, где он связывается с ARE генов-мишеней.

К Nrf2/ARE-регулируемым генам относятся гены большого числа антиоксидантных ферментов и многих ферментов детоксикации (II фазы метаболизма ксенобиотиков), в том числе NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы (ХР) и гемоксигеназы-1 (ГО-1). ХР и ГО-1 часто относят к ферментам II фазы метаболизма ксенобиотиков, но они имеют важное значение и для антиоксидантной защиты клетки. Так, ХР представляет собой флавопротеин, который катализирует восстановление широкого спектра эндогенных и экзогенных хинонов, хинониминов и некоторых азотсодержащих соединений, используя в качестве доноров атома водорода NADH или NADPH.

Антиоксидантная активность ХР реализуется за счет ингибирования окислительно-восстановительных циклических трансформаций хинонов, что снижает возможность генерации активных форм кислорода (супероксидного аниона и перекиси водорода), и обеднения пула тиолов. Кроме того, ХР участвует в метаболизме двух природных хинонов-антиоксидантов - убихинона (коэнзима Q) (восстанавливая его в активный убихинол) и α-токоферола (восстанавливая его хинон в гидрохинон с высокой антиоксидантной активностью) [10, 14, 15].

ГО-1 является лимитирующим звеном превращения прооксидантного гема в билирубин, оказывающий антирадикальное действие в отношении супероксидных и пероксильных радикалов. Общее свойство индукторов этого фермента - способность вызывать окислительный стресс. Многие авторы отмечают, что активность ГО-1 является одним из самых чувствительных индикаторов клеточного повреждения и индукция ее приводит к усилению антиоксидантной и противовоспалительной функций клетки, тем самым определяя степень способности ее к выживанию [10, 11].

Природными индукторами сигнальной системы Nrf2/ARE являются многие полифенолы и в первую очередь соединения, содержащие -ОН группы в ортои пара-положении [16]. К их числу относят флавоноиды кверцетин, Гес, а также эпигаллокатехингаллат. Предполагают, что способностью активировать Nrf2 обладают не сами фенольные индукторы, а высокореактивные продукты их окисления - хиноны, активно взаимодействующие с тиоловыми группами, в том числе с критическими тиолами цистеина Keap1 [11, 17].

Следует отметить, что в настоящее время происходит интенсивное накопление данных о свойствах и молекулярных механизмах биологической активности отдельных флавоноидов и имеются лишь единичные сведения об их взаимодействии при совместном поступлении в организм. Учитывая близкую структуру, общие пути метаболизма и наличие общих мишеней действия Р и Гес, целью настоящей работы было изучение их влияния на экспрессию гена Nrf2, на активность ГО-1 и ХР, экспрессию мРНК и белка ГО-1 и ХР при их раздельном и совместном поступлении.

Материал и методы

Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 180-200 г. Крысы были разделены на 4 группы по 8 животных в каждой и содержались по 2-3 особи в клетке (“Techniplast”, Италия).

В работе придерживались нормативов содержания лабораторных животных в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.).

Крысы контрольной группы в течение 14 дней получали стандартный полусинтетический рацион, крысы 1-й опытной группы - тот же рацион с включением Р (“Sigma-Aldrich”, США) в количестве 400 мг на 1 кг массы тела, животные 2-й опытной группы получали рацион с включением Гес (“Sigma-Aldrich”, США) в том же количестве, крысы 3-й опытной группы - рацион, содержащий Р и Гес в количестве 400 мг каждого на 1 кг массы тела. Животные получали питьевую воду без ограничений и корм ежедневно в одно и то же время в режиме свободного доступа из расчета 15 г сухого корма на крысу. Контроль за поедаемостью корма и состоянием животных проводили ежедневно, контроль массы тела - через день.

В гомогенатах печени определяли содержание малонового диальдегида (МДА) [18], гидроперекисей липидов [19], восстановленного и окисленного глутатиона [20]. В микросомальной и цитозольной фракциях, выделенных из печени, определяли, соответственно, активность ГО-1 [21] и ХР [22].

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени

При подготовке к проведению обратной транскрипции (ОТ) из печени выделяли общую РНК по методу [23] с помощью реагента “TRI Reagent” (“Sigma-Aldrich”, США).

Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре “NanoDrop 1000” (“Thermo Scientific”, США).

Для проведения ОТ готовили смесь общим объемом 25 мкл, состоящую из 5 мкл 5-кратного буфера для M-MuLV обратной транскриптазы ("СибЭнзим", РФ), 5 мкл смеси дезоксинуклеотид-трифосфатов (2,5 мМ каждый) ("СибЭнзим", РФ), 4 мкл 83 мкМ oligo(dT)праймера ("Литех", РФ), 4,57 мкл DEPC-воды (“Thermo Scientific”, США), 0,63 мкл (25Е) ингибитора РНКаз RiboLock (“Thermo Scientific”, США), 0,8 мкл (160Е) M-MuLV обратной транскриптазы ("СибЭнзим", РФ) и 5 мкл РНК (0,4 мкг/мкл). Реакцию ОТ проводили на приборе “CFX 96” (“Bio-Rad”, США) при 37 °С в течение 1 ч. Полученную в реакции ОТ комплементарную ДНК (кДНК) использовали для оценки экспрессии генов ХР (NQO1), ГО-1 (Hmox1), Nrf2 (Nrf2) и β-актина (Actb) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Реакционная смесь для ПЦР общим объемом 25 мкл содержала 12,5 мкл 2-кратного iQ SYBR Green Supermix (“Bio-Rad”, США) (100 мМ KCl, 40 мМ Трис-HCl pH 8,4, 0,4 мМ дезоксинуклеотид-трифосфаты, 50 ед/мл iTaq ДНК-полимераза, 6 мМ MgCl2, интеркалирующий краситель SYBR Green I, 20 нМ флюоресцеин и стабилизаторы), по 2,5 мкл прямого и обратного праймеров к исследуемому гену (концентрация праймеров 1 ОЕ/мл) ("Литех", РФ), 5 мкл воды без нуклеаз (“Thermo Scientific”, США) и 2,5 мкл кДНК в разведении 1:10. Последовательность праймеров представлена в табл. 1.

Амплификацию проводили на приборе "CFX 96" (“BioRad”, США). Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: активация iTaq ДНКполимеразы при 95 °С в течение 3 мин; 40 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 95 °С в течение 15 с для Actb и Nrf2; 20 с - NQO1 и 5 с - Hmox1, отжига праймеров (58 °С, 15 с для Actb; 58 °С, 20 с - Nrf2; 60 °С, 30 с - NQO1 и Hmox1) и синтеза продукта при 72 °С в течение 45 с - для Actb, 27 с - Nrf2; 30 с - NQO1 и 10 с - Hmox1; после окончания циклов проводили контроль специфичности праймеров с помощью анализа кривой плавления (melt curve) в диапазоне 50-95 °С (шаг 0,5 °С по 10 с каждый).

Уровни экспрессии изучаемых генов нормализовали относительно уровня экспрессии гена сравнения β-актина (Actb) и рассчитывали по значению порогового цикла (Ct - cycle threshold) с использованием программы “Relative expression software tool” (REST) v.2.0.13 (“Qiagen”, Германия). Данные представляли как средние значения (n=6), амплификацию для каждого значения проводили в трех повторах.

Вестерн-блоттинг

Субклеточное фракционирование проводили по стандартному методу. Ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком в троекратном объеме раствора 0,25 М сахарозы и 0,001 М ЭДТА, pH 7,2-7,4, при 1200 об/мин в течение 90 с. Для освобождения от неразрушившихся клеток гомогенат центрифугировали при 100g в течение 5 мин. Полученную надосадочную фракцию центрифугировали при 1000g в течение 10 мин. Осадок дважды ресуспендировали в троекратном объеме буфера и центрифугировали при 600g в течение 10 мин.

Объединенные надосадочные фракции после каждого центрифугирования составили цитоплазматическую фракцию. Ядерную фракцию получали путем ресуспендирования осадка в 4-кратном объеме буфера при 900 об/мин в течение 60 с. Полученные фракции хранили при -20 °С. В цитоплазматической фракции определяли уровень белков ГО-1, ХР, Nrf2, в ядерной - уровень белка Nrf2.

Общее содержание белка в пробах определяли по методу Брэдфорда с использованием коммерческого реагента согласно инструкции производителя (“SigmaAldrich”, США). Образцы ядерной и цитоплазматической фракции, содержащие соответственно по 10 и 20 мкг белка, подвергали электрофоретическому разделению в 10% полиакриламидном геле при 200В в течение 50 мин (“Mini-Protean Tetra Cell”, “Bio-Rad”, США) с последующим переносом на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану при 20В в течение 30 мин (“Trans-Blot SD Cell”, “Bio-Rad”, США). Мембраны инкубировали в 5% растворе обезжиренного сухого молока ("Bio-Rad", США) в TBST буфере (“Bio-Rad”, США) в течение 50 мин при комнатной температуре, затем оставляли на ночь при 4 °С в растворе соответствующих антител в TBST буфере [разведение Nrf2 (“Santa Cruz Biotechology”, США) - 1:100, SP-1 (“Sigma-Aldrich”, США) - 1:250, ГO-1 (“Sigma-Aldrich”, США) - 1:100, ХР (“Sigma-Aldrich”, США) - 1:400, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ) (“Sigma-Aldrich”, США) - 1:10000, актина (“Sigma-Aldrich”, США) - 1:250]. После 5-кратного промывания в TBST буфере мембраны обрабатывали раствором IgG-HRP (“Bio-Rad”, США) (разведение 1:3000) и Streptactin-HRP (“Bio-Rad”, США) (разведение 1:20 000) в TBST буфере в течение 45 мин при комнатной температуре. После 6-кратного промывания в TBST буфере мембраны обрабатывали в течение 5 мин смесью субстратов “Immun-Star HRP” (“Bio-Rad”, США) и далее оценивали интенсивность хемилюминесценции на системе гельдокументирования “ChemiDoc XRS” (“Bio-Rad”, США) с помощью программы Quantity One (“Bio-Rad”, США).

При этом уровни экспрессии белков Nrf2, ГО-1 и ХР нормализовали относительно уровня экспрессии белков сравнения: актина, ГАФДГ и SP-1. Данные представили в виде средних значений из трех независимых определений.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics Ver. 20 (“SPSS Inc.”, США). Данные представляли в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки среднего (m): M±m. Для выявления статистически значимых (р<0,05) различий между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ с использованием в качестве апостериорного критерия LSD-теста.

Результаты и обсуждение

Включение в рацион Р и Гес как по отдельности, так и совместно не оказывало какого-либо влияния на общее состояние животных, массу тела и относительную массу печени. C целью выявления возможного прооксидантного действия Р и Гес, точнее продуктов их окисления, в печени крыс определяли содержание некоторых маркеров окислительного стресса. Полученные результаты показали, что индивидуальное или совместное воздействие Р и Гес не приводило к достоверным изменениям уровня МДА, гидроперекисей липидов, количества восстановленного и окисленного глутатиона и их соотношения (табл. 2).

У крыс, получавших рацион с Р или с Гес, обнаруживали умеренное возрастание активности ГО-1 - на 28% (р<0,05) и на 24% (р>0,05) соответственно (табл. 3).


У животных 3-й опытной группы, получавших Р вместе с Гес, активность ГО-1 превышала контрольный уровень на 16% (р>0,05) и была ниже активности фермента у крыс 1-й и 2-й опытных групп. Р (1-я опытная группа) вызывал увеличение активности ХР на 61% (р<0,05), а Гес (2-я опытная группа) - на 28% (р>0,05). При совместном воздействии Р и Гес (3-я опытная группа) активность ХР возрастала на 78% (р<0,05) от контроля, что превышало активность фермента у крыс 1-й (на 10%) и 2-й опытных групп (на 39%).

Результаты вестерн-блот-анализа показали, что уровень белка ГО-1 в печени увеличивался в равной степени (в 1,5 раза) при введении Р или Гес в рацион, и более чем в 2 раза при их совместном введении (рис. 1). Содержание белка ХР также возрастало при действии Р (на 57%), но не изменялось существенно относительно контроля у крыс, получавших с рационом Гес или Гес вместе с Р (рис. 2).

Не обнаружено каких-либо различий между группами в уровне белка Nrf2 в ядерной фракции печени крыс (рис. 3а). В то же время во фракции цитозоля отмечалось умеренное возрастание содержания белка Nrf2: у крыс, получавших Р, на 32%, у получавших Гес - на 40% и у получавших Р и Гес - на 46% (рис. 3б). Во всех случаях изменения уровня белка Nrf2 и изученных ферментов оставались статистически недостоверными.
По данным ПЦР, содержание мРНК Hmox1 в печени крыс, получавших рацион с Р, возрастало на 35% и практически не отличалось от контрольного уровня у крыс, получавших рацион с Гес (рис. 4). Несмотря на возрастание количества белка ГO-1 при совместном включении в рацион Р и Гес, экспрессия мРНК Hmox1 снижалась на 26% относительно контроля и на 45% относительно уровня в печени крыс, получавших только Р (рис. 4). Содержание мРНК NQO1 в печени уменьшалось значительно - на 36% относительно контроля при включении в рацион Р, но не отличалось существенно от контрольного уровня у крыс, получавших Гес или совместно Р с Гес (см. рис. 4). Как Р, так и Гес снижали незначительно, хотя и достоверно, уровень мРНК Nrf2 в печени соответственно на 27 и 20%. При совместном действии Р и Гес уровень экспрессии мРНК Nrf2 не отличался от контрольного и был достоверно выше уровня у крыс, получавших только Р (см. рис. 4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что даже в больших дозах Р и Гес не оказывают токсического или прооксидантного действия на крыс, что подтверждает наши предыдущие данные и данные других авторов [24-26]. При этом Р и в меньшей степени Гес вызывали возрастание активности ГО-1 и ХР. Способность Р и кверцетина индуцировать активность ГО-1 у здоровых интактных крыс показана лишь в единичных исследованиях. Так, дозозависимое возрастание активности ГО-1 обнаруживали у крыс, получавших с рационом Р в дозе 40 и 400 мг на 1 кг массы тела [24]. Длительное введение крысам кверцетина в количестве 100 мг/кг массы тела вызывало избирательное увеличение более чем в 2 раза активности ГО-1 в печени [27]. В то же время в ряде исследований, проведенных как in vivo, так и in vitro с использованием разных линий клеток, показано, что в условиях окислительного стресса антиоксидантное и противовоспалительное действие Р и кверцетина связано непосредственно с их способностью индуцировать активность ГО-1 [8, 28, 29].

Результаты изучения молекулярных механизмов индуцирующего действия кверцетина на активность ГО-1, полученные в исследованиях in vitro, свидетельствуют о том, что оно опосредовано главным образом активирующим влиянием кверцетина на транскрипционный фактор Nrf2. Так, в клетках нормальной печени человека L02 при индуцированном окислительном стрессе разной этиологии наблюдали усиление транслокации Nrf2 в ядро наряду с усилением экспрессии гена Hmox1 [30]. Аналогично, в клетках злокачественной мезотелиомы кверцетин индуцировал экспрессию белка Nrf2 и гена Nrf2, усиливал его транслокацию в ядро, что сопровождалось индукцией экспрессии мРНК Hmox1 и белка ГО-1 [31].

Индуцирующее действие Р (400 мг на 1 кг массы тела) на активность ХР при его включении в рацион крыс было обнаружено и в наших предыдущих исследованиях [25].

Способность кверцетина индуцировать активность, экспрессию белка ХР и мРНК NQO1 также показана in vitro на культурах клеток MCF-7 и HepG2 [15, 32]. В этих же экспериментах in vitro получены доказательства связи индуцированной кверцетином активации ХР с усилением экспрессии гена и белка Nrf2.

В отличие от результатов, полученных in vitro, в настоящей работе не выявлена зависимость индуцирующего действия Р на активность ГO-1 и ХР от его влияния на фактор Nrf2 как на уровне экспрессии мРНК Nrf2, так и на уровне экспрессии белка Nrf2 в цитоплазме и ядерной фракции.

Значительно менее изученным остается влияние Гес на активность Nrf2 и Nrf2-регулируемых ферментов.

В исследовании у старых крыс со сниженными (по сравнению с молодыми) показателями антиоксидантного статуса введение Гес в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в течение 90 дней восстанавливало уровень активности антиоксидантных ферментов миокарда до уровня у молодых крыс, что сопровождалось усилением экспрессии мРНК Nrf2 и белка Nrf2 [33]. При этом Гес не оказывал какого-либо влияния на изученные показатели у молодых крыс.

Наличие связи между индуцирующим действием Гес на активность ГО-1 и Nrf2 показано в двух работах, проведенных на клетках нормальной печени человека L02 [34, 35]. В клетках, подвергавшихся действию Н2О2 или трет-бутил гидропероксида, Гес усиливал транслокацию Nrf2 в ядро и индуцировал активность ГО-1 и экспрессию мРНК Hmox1 и ферментного белка.

В отличие от данных, полученных на клеточных культурах, в наших исследованиях у крыс, получавших Гес в течение 2 нед, выявлено небольшое недостоверное возрастание активности ГО-1 и ХР при отсутствии существенного изменения экспрессии их генов и экспрессии гена и белка Nrf2.

Данные о комбинированном действии Р и Гес на активность ГО-1 и ХР и других антиоксидантных ферментов, так же как и сведения о взаимном влиянии этих флавоноидов на их биодоступность и метаболизм в организме, фактически отсутствуют. Полученные нами результаты показали, что совместное действие Р и Гес приводит к небольшому уменьшению индивидуальных эффектов Р и Гес на активность ГО-1 и экспрессию гена Hmox1. В отличие от ГО-1 активность ХР при совместном поступлении Р и Гес превышала активность фермента у крыс, получавших только Р или Гес, что можно оценить как аддитивность их эффектов. Это взаимодействие, однако, не прослеживалось на уровне экспрессии мРНК NQO1 и белка ХР.

Таким образом, можно заключить, что in vivo Р и Гес в высоких дозах как при раздельном, так и при совместном включении в рацион крыс не проявляли прооксидантную активность и не оказывали значительного влияния на экспрессию гена и белка транскрипционного фактора Nrf2 и обнаруженное при этом возрастание активности ГО-1 и ХР не связано с усилением экспрессии генов Hmox1 и NQO1. Эти результаты значительно отличаются от данных, полученных in vitro. Можно предположить, что, наряду с различиями в действующих концентрациях in vitro и in vivo, важную роль играет тот факт, что, попадая в организм, Р и Гес быстро метаболизируются и в крови выявляют почти исключительно их метаболиты: кверцетин и гесперитин [1, 36, 37], биологическая активность которых не изучена.

Литература

1. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. Флаваноны: пищевые источники, биодоступность, влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 4-23.

2. Amaretti A., Raimondi S., Leonardi A. et al. Hydrolysis of the rutinoseconjugates flavonoids rutin and hesperidin by the gut microbiota and bifidobacteria // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 4. P. 2788-2800.

3. Chua L.S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities // J. Ethnopharmacol. 2013. Vol. 150, N 3. P. 805-817.

4. Parhiz H., Roohbakhsh A., Soltani F. et al. Antioxidant and antiinflammatory properties of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin: an updated review of their molecular mechanisms and experimental models // Phytother. Res. 2015. Vol. 29, N 3. P. 323-331.

5. Roohbakhsh A., Parhiz H., Soltani F. et al. Molecular mechanisms behind the biological effects of hesperidin and hesperetin for the prevention of cancer and cardiovascular diseases // Life Sci. 2015. Vol. 124. P. 64-74.

6. Yang J., Guo J., Yuan J. In vitro antioxidant properties of rutin // LWT Food Sci. Technol. 2008. Vol. 41. P. 1060-1066.

7. Kamel K.M., Abd El-Raouf O.M., Metwally S.A. et al. Hesperidin and rutin, antioxidant citrus flavonoids, attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in rats // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2014. Vol. 28, N 7. P. 312-319.

8. Liu S., Hou W., Yao P. et al. Heme oxygenase-1 mediates the protective role of quercetin against ethanol-induced rat hepatocytes oxidative damage // Toxicol. In Vitro. 2012. Vol. 26, N 1. P 74-80.

9. Wang J., Zhu H., Yang Z., Liu Z. Antioxidative effects of hesperetin against lead acetate-induced oxidative stress in rats // Indian J. Pharmacol. 2013. Vol. 45, N 4. P. 395-398.

10. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант - респонсивный элемент // Биохимия. 2006. Т. 71, № 9. С. 1183-1197.

11. Турпаев К.Т. Сигнальная система Keaр1-Nrf2. Механизм регуляции и значение для защиты клеток от токсического действия ксенобиотиков и электрофильных соединений // Биохимия. 2013. Т. 78, №. 2. С. 147-166.

12. Kobayashi A., Kang M.I., Watai Y. et al. Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of Keap1 // Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 26, N 1. P. 221-229.

13. Ma Q., He X. Molecular basis of electrophilic and oxidative defense: promises and perils of Nrf2 // Pharmacol. Rev. 2012. Vol. 64, N 4. P. 1055-1081.

14. Dinkova-Kostova A.T., Talalay P. NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1 (NQO1), a multifunctional antioxidant enzyme and exceptionally versatile cytoprotector // Arch. Biochem. Biophys. 2010. Vol. 501, N 1. P. 116-123.

15. Tanigawa S., Fujii M., Hou D.X. Action of Nrf2 and Keap1 in AREmediated NQO1 expression by quercetin // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 42, N 11. P. 1690-1703.

16. Dinkova-Kostova A.T., Wang X.J. Induction of the Keap1/Nrf2/ARE pathway by oxidizable diphenols // Chem. Biol. Interact. 2011. Vol. 192, N 1-2. P. 101-106.

17. Lemmens K.J., Vrolijk M.F., Bouwman F.G. et al. The minor structural difference between the antioxidants quercetin and 4’Omethylquercetin has a major impact on their selective thiol toxicity // Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, N 5. P. 7475-7484.

18. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem. 1979. Vol. 95, N 2. P. 351-358.

19. Hermes-Lima M., Willmore W.G., Storey K.B. Quantification of lipid peroxidation in tissue extracts based on Fe(III)xylenol orange complex formation // Free Radic. Biol. Med. 1995. Vol. 19, N 3. P. 271-280.

20. Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples // Methods Enzymol. 1985. Vol. 113. P. 548-555.

21. McNally S.J., Ross J.A., James Garden O., Wigmore S.J. Optimization of the paired enzyme assay for heme oxygenase activity // Anal. Biochem. 2004. Vol. 332, N 2. P. 398-400.

22. Benson A.M., Hunkeler M.J., Talalay P. Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77, N 9. P. 5216-5220.

23. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step of RNA isolation by aced guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.

24. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Аксенов И.В и др. Изучение влияния рутина на защитный потенциал крыс // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 3. С. 22-30.

25. Ускова М.А., Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Влияние пробиотика Lactobacillus casei 114001 на биологическую активность рутина // Бюл. экспер. биол. 2010. Т. 149, № 5. С. 510-515.

26. Wiegand H., Boesch-Saadatmandi C., Regos I. et al. Effects of quercetin and catechin on hepatic glutathione-S transferase (GST), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), and antioxidant enzyme activity levels in rats // Nutr. Cancer. 2009. Vol. 61, N 5. P. 717-722.

27. Tang Y., Tian H., Shi Y. et al. Quercetin suppressed CYP2E1dependent ethanol hepatotoxicity via depleting heme pool and releasing CO // Phytomedicine. 2013. Vol. 20, N 8-9. P. 699-704.

28. Liu C.M., Ma J.Q., Xie W.R. et al. Quercetin protects mouse liver against nickel-induced DNA methylation and inflammation associated with the Nrf2/HO-1 and p38/STAT1/NF-κB pathway // Food Chem. Toxicol. 2015. Vol. 82. P. 19-26.

29. Pan P.H., Lin S.Y., Wang Y.Y. et al. Protective effects of rutin on liver injury induced by biliary obstruction in rats // Free Radic. Biol. Med. 2014. Vol. 73. P. 106-116.

30. Ji L.L., Sheng Y.C., Zheng Z.Y. et al. The involvement of p62-Keap1Nrf2 antioxidative signaling pathway and JNK in the protection of natural flavonoid quercetin against hepatotoxicity // Free Radic. Biol. Med. 2015. Vol. 85. P. 12-23.

31. Lee Y.J., Lee D.M., Lee S.H. Nrf2 expression and apoptosis in quercetin-treated malignant mesothelioma cells // Mol. Cells. 2015. Vol. 38, N 5. P. 416-425.

32. Valerio L.G. Jr, Kepa J.K., Pickwell G.V., Quattrochi L.C. Induction of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) gene expression by the flavonol quercetin // Toxicol. Lett. 2001. Vol. 119, N 1. P. 49-57.

33. Elavarasan J., Velusamy P., Ganesan T. et al. Hesperidin-mediated expression of Nrf2 and upregulation of antioxidant status in senescent rat heart // J. Pharm. Pharmacol. 2012. Vol. 64, N 10. P. 1472-1482.

34. Chen M., Gu H., Ye Y. et al. Protective effects of hesperidin against oxidative stress of tert-butyl hydroperoxide in human hepatocytes // Food Chem. Toxicol. 2010. Vol. 48, N 10. P. 2980-2987.

35. Chen M.C., Ye Y.Y., Ji G., Liu J.W. Hesperidin upregulates heme oxygenase1 to attenuate hydrogen peroxide-induced cell damage in hepatic L02 cells // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 6. P. 3330-3335.

36. Manach C., Morand C., Demignt C. et al. Bioavailability of rutin and quercetin in rats // FEBS Lett. 1997. Vol. 409. P. 12-16.

37. Matsumoto H., Ikoma Y., Sugiura M. et al. Identification and quantification of the conjugated metabolites derived from orally administered hesperidin in rat plasma // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, N 21. P. 6653-6659.