Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты

Резюме

Наноразмерное коллоидное серебро (НКС) с размером первичных наночастиц (НЧ) в интервале 10-80 нм в виде водной суспензии вводили крысам с исходной массой тела 80±10 г в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут с потребляемым рационом в дозах 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела в день в расчете на серебро (Ag). Животные контрольных групп получали деионизованную воду и носитель НЧ - водный раствор стабилизатора поливинилпирролидона (ПВП). В печени определяли активности (Vmax) микросомальных монооксигеназ со смешанной функцией изоформ CYP 1A1, 1A2 и 2B1 по их специфическим субстратам, активность конъюгирующих ферментов печени глутатион-S-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы в микросомальной фракции и цитозоле, общую и неседиментируемую активность лизосомальных гидролаз. В плазме крови оценивали содержание малонового диальдегида, диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот, а в эритроцитах - активность ферментов антиоксидантной защиты. Изучали комплекс стандартных биохимических показателей сыворотки крови. В результате проведенных исследований выявлены изменения ряда молекулярных маркеров токсического действия. В их числе - повышение активности ключевых ферментов I и II стадий системы детоксикации ксенобиотиков, свидетельствующее о ее функциональном перенапряжении, снижение активностей глутатионпероксидазы (ГП), общих арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы (при отсутствии изменений в их неседиментируемой активности), уровня мочевой кислоты, повышение активности щелочной фосфатазы. Указанные изменения наблюдались преимущественно при дозе НЧ Ag 10 мг на 1 кг массы тела, за исключением ГП, для которой пороговая дозасоставляла 1 мг на 1 кг массы тела. Достоверных изменений изученных маркеров при дозе Ag 0,1 мг на 1 кг массы тела не выявлено. Обсуждаются возможные механизмы токсического действия НЧ серебра.

Ключевые слова:серебро, наночастицы, крысы, подострая токсичность, микросомы, цитохром Р450, лизосомы, неседиментируемая активность, перекисное окисление липидов, микроэлементы

Вопр. питания. 2016. № 2. С. 14-23.

Наночастицы (НЧ) серебра (Ag) широко используются в медицине, быту и технике главным образом в качестве бактерицидного средства [1-3]. Согласно некоторым данным, их производство в 2015 г. может превысить 1000 т [4, 5], что соответствует около 140 мг на каждого жителя Земли. Экспонирование человека НЧ Ag возможно как непосредственно через потребительскую продукцию (биологически активные добавки к пище, косметика, фармацевтические препараты, текстиль), так и опосредованно, через пищевые продукты и воду, содержащие эти НЧ, мигрировавшие в объекты окружающей среды. Определенное значение в настоящее время приобретает и путь экспозиции отходами НЧ Ag, поступающими в сточные воды и далее на земли сельскохозяйственного назначения, откуда возможна их передача по пищевым цепям и через сельскохозяйственную продукцию к человеку.

Согласно данным многочисленных исследований [6-12], НЧ Ag обладают ингаляционной, эпикутанной и пероральной токсичностью для млекопитающих, однако оценки их токсических доз в эксперименте противоречивы. Поскольку механизм токсического действия НЧ Ag, по современным представлениям, состоит главным образом во внутриклеточном высвобождении ими ионов Ag+, являющихся ингибиторами многих ферментов и мембранных транспортных систем [13], наиболее лабильными биомаркерами неблагоприятного действия этих НЧ на организм могут быть активности ключевых ферментов, уровни важнейших метаболитов и показатели, связанные с процессами перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Ввиду этого целью настоящей работы является изучение влияния подострого 92-дневного перорального введения НЧ Ag лабораторным крысам на активность ряда критически важных микросомальных и лизосомальных ферментов, стабильность лизосомальных мембран, состояние системы антиоксидантной защиты и биохимические показатели сыворотки крови. В качестве объекта исследования выбран образец промышленно выпускаемого наноразмерного коллоидного Ag (НКС), стабилизированного нетоксичным биосовместимым полимером поливинилпирролидоном (ПВП), широко используемый в настоящее время в потребительской продукции.

Материал и методы

В работе использован препарата НКС (≪кластерного серебра≫) ≪Арговит-С≫ по ТУ 9310-03-7904425912 (ООО НПЦ ≪Вектор-Вита≫ (Авторы благодарят кандидата химических наук В.А. Бурмистрова за предоставленный для исследования образец коллоидного серебра.), г. Новосибирск, РФ). Изучаемый образец продукции представлял собой однородную жидкость коричневого цвета (в проходящем свете) с зеленовато-серым оттенком (в отраженном свете), с небольшой опалесценцией и максимумом поглощения в видимой области спектра λ=403,2 нм. Согласно данным анализа методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (Исследование проведено научным сотрудником лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" А.А. Шумаковой.)) на приборе ≪Agilent 7700 MS≫ (≪Agilent≫, Япония), общее содержание Ag в неразбавленном растворе НКС составляло 10,09±0,04 мг/см3, содержание ПВП, по данным изготовителя, - 190 мг/см3. Характеристика образца методами трансмиссионной электронной микроскопии и динамического лазерного светорассеяния показала, что в составе НКС присутствовали НЧ Ag с диаметрами менее 5, 10-20 и 50-80 нм; 80% частиц имели гидродинамический диаметр в интервале 10,6-61,8 нм; индивидуальные частицы размером более 100 нм практически отсутствовали.

Эксперимент выполнен на 5 группах по 15 крыссамцов линии Вистар с исходной массой тела 80±10 г, полученных из питомника РАН ≪Столбовая≫. На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа. Животные 1-й (контрольной) группы получали носитель - деионизованную воду, крысы 2-й группы - ПВП в виде водного раствора в дозе 200 мг на 1 кг массы тела, крысы групп с 3-й по 5-ю - эквивалентное количество ПВП и НКС в дозах соответственно 0,1; 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в расчете на Ag. В течение первых 30 сут введение тестируемых препаратов осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут НКС и ПВП добавляли к корму животных. Доза ПВП в группах животных со 2-й по 4-ю была выбрана, исходя из количества этого вещества, потребляемого с препаратом НКС крысами 5-й группы. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах (с точностью ± 1 г), фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения. На протяжении 2-го и 3-го месяцев эксперимента поедаемость корма животными всех групп была практически 100%, что позволило рассчитать дозу Ag и ПВП, исходя из фактически потребленного количества рациона.

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-и сутки декапитацией под эфирной анестезией. У 6 животных из каждой группы отбирали печень целиком, гомогенизировали ее в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 7,4, охлажденном до 0-+2 оС в соотношении 1:4 по массе. Гомогенат подвергали фракционированию методом дифференциального центрифугирования на препаративной ультрацентрифуге ≪Beckman L7-65≫ (≪Beckman≫, США) с получением микросомальной и цитозольной фракций. Содержание изоформ микросомальных монооксигеназ оценивали по величине активности: этоксирезоруфин-деалкилазной (изоформа CYP1A1), 7-метоксирезоруфин-Одеметилазной (CYP1A2) и 7-пентоксирезоруфин-Одеалкилазной (CYP2B1), используя специфические субстраты [14, 15].

Активность лизосомальных ферментов β-глюкуронидазы, β-галактозидазы, арилсульфатаз А и В исследовали согласно [16] в цельном гомогенате печени (общая активность) и во фракции цитозоля (неседиментируемая активность). Общую активность конъюгирующих ферментов глутатионS-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы определяли в цитозоле и в микросомах по методам [17, 18] соответственно. Все измерения ферментативных активностей проводили в условиях насыщения ферментов субстратами ([S]>>Km).

Биохимические показатели сыворотки крови (общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, мочевина), активность трансаминаз печени [аланинами нотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)], а также суммарной щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе (≪Konelab≫, Финляндия).

Исследования показателей ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в эритроцитах и плазме крови проводили на биохимическом анализаторе"ФП-901" ("Labsystems OY", Финляндия). Активность глутатионредуктазы эритроцитов определяли по методу Tillotson и соавт. (1971) в адаптации, согласно [19], глутатионпероксидазы (ГП) эритроцитов - на основе метода Mille в модификации [20], каталазы - по методу Oshino с соавт. в модификации [21], супероксиддисмутазы эритроцитов - на основе метода Niashikimi и соавт. в модификации [21]. Содержание малонового диальдегида в гомогенате печени оценивали по методу Mihara и соавт. [22]. Содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в гомогенатах печени определяли спектрофотометрическим методом [23].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни и критерию ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ). Различия признавали статистически значимыми при уровне p<0,05.

Результаты

Как следует из данных, представленных в табл. 1, активность микросомальных монооксигеназ изоформ CYP1A1, CYP1A2 и CYP2B1 по отношению к их специфическим субстратам в печени животных опытных групп изменялась в сравнении с контролем сходным образом. А именно, у крыс 2-й группы, получавших стабилизатор ПВП, активности снижались (максимально в случае CYP1A1, на 30%, p1-2<0,05), а у животных, получавших НКС в возрастающих дозах (с 3-й по 5-ю группу), дозозависимо возрастали. Максимальный прирост активности (в сравнении со 2-й группой) наблюдался в 5-й группе (на 34, 32 и 19% для 3 изоформ соответственно в сравнении со 2-й группой; p2-5<0,05 во всех случаях). Достоверное возрастание активности CYP1A2 и CYP2B1 наблюдалось также в сравнении с крысами 2-й группы также и у животных 4-й группы.

Внутрижелудочное введение НКС оказало влияние на активность конъюгирующих ферментов II стадии детоксикации ксенобиотиков. Так, активность глутатионтрансферазы в печени крыс 5-й группы возрастала на 22% в сравнении с 1-й группой и на 13% по сравнению со 2-й группой (p1-5,2-5<0,05), активность УДФ-глюкуронозилтрансферазы - на 60 и 42% соответственно (p1-5,2-5<0,05). Таким образом, прием НЧ Ag в течение 92 сут в дозе более 1 мг на 1 кг массы тела не только не оказал угнетающего действияна систему детоксикации ксенобиотиков, но и повысил активность некоторых ее ключевых компонентов.

Противоположным по направленности оказалось воздействие НКС на активность лизосомальных ферментов. Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что общие активности арилсульфатаз А и В, а также β-галактозидазы были достоверно снижены у крыс 5-й группы в сравнении с животными 2-й группы (p2-5<0,05), а в первом случае - также и с животными 1-й группы (p1-5<0,05). На активность β-глюкуронидазы прием НКС не оказал видимого воздействия. Неседиментируемая активность перечисленных лизосомальных гидролаз, маркирующая стабильность мембран лизосом гепатоцитов, во всех опытных группах животных (с 3-й по 5-ю) недостоверно отличалась от контроля.

Анализ биохимических показателей сыворотки крови (табл. 3) показывает, что активность АЛТ достоверно не отличалась от контроля во всех опытных группах животных. Активность АСТ была достоверно повышена в сравнении с контролем у крыс, получавших ПВП (2-я группа), но практически не изменена у животных, которым вводили НКС (3-5-я группы). При этом во всех случаях средняя активность первой из этих трансаминаз находились в пределах погрешности анализа внутри коридора референтных значений для крыс данного пола и возраста (39,9-59,1 ед/л согласно [24]), а второй - ниже установленной нижней границы нормы (101,0-160,6 ед/л). Таким образом, признаков токсического действия НКС животных по показателям активности трансаминаз в сыворотке крови не выявлено. При этом у животных 5-й группы, получавших НКС в наибольшей дозе, отмечено достоверное (p1-5<0,05) возрастание активности ЩФ на 51% в сравнении с животными контрольной группы. Среднее значение активности ЩФ у крыс 5-й группы превышало верхнюю границу нормы (85,8-166,8 ед/л, [24]). Ни ПВП, ни НКС в меньших дозах не оказывали видимого воздействия на этот показатель.

Среди показателей азотистого обмена уровень креатинина сыворотки крови был достоверно повышен у крыс 5-й группы в сравнении с животными 1-й группы, а уровень мочевой кислоты - достоверно снижен в сравнении как с животными 1-й группы, так и 2-й. Остальные изученные биохимические показатели (общий белок, альбумин, мочевина, глюкоза) значимо не различались во всех группах животных.

Показатели ПОЛ и активности ферментов системы антиоксидантной защиты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о наличии ряда эффектов со стороны приема НКС. Так, уровень малонового диальдегида оказывался достоверно снижен в 4-й группе по сравнению со 2-й группой, тогда как концентрация диеновых конъюгатов практически не изменялась в зависимости от дозы наноматериала. Активность супероксиддисмутазы достоверно снизилась в 4-й группе (p2-4<0,05), однако этот эффект не фиксируется при наибольшей дозе наноматериала. Активности глутатионредуктазы и каталазы значимо не различалисьмежду группами животных. Наиболее выраженным и дозозависимым является воздействие приема НКС на активность глутатионпероксидазы, активность которой в 2 и более раза снижена у крыс 5-й группы в сравнении с животными 1-й и 2-й групп. Минимальная доза Ag, при которой отмечается этот эффект, составляет, как показывают полученные данные, 1 мг на 1 кг массы тела.

Обсуждение

В ряде работ, посвященных изучению токсических свойств НЧ Ag, его неблагоприятное воздействие на организм лабораторных животных не было выявлено вплоть до весьма высоких доз, порядка 100 мг на 1 кг массы тела и более [7, 12, 13]. На основании этого высказывались предположения, что токсичность НКС для организма высших животных невелика. Противоречия в оценке токсичности НЧ Ag наряду с очевидными причинами, состоящими в использовании в различных работах образцов НЧ с разными размерами и функционализацией поверхности, может состоять и в выборе недостаточно лабильных маркеров токсического действия. Из того, что в основе предполагаемого токсического эффекта НКС, по современным представлениям, лежит взаимодействие высвобождаемых из НЧ ионов Ag+ с тиоловыми группами ферментов и мембранных белков, следует предположение, что чувствительными мишенями воздействия этого наноматериала могут быть ключевые для метаболизма ферментные системы и клеточные мембраны. Большой интерес в этом отношении представляет оценка влияния нанотоксического фактора на ферментные системы I и II фазы детоксикации ксенобиотиков в печени (белки семейства цитохрома Р450, конъюгирующие трансферазы), поскольку от их функционального состояния критическим образом зависит гомеостаз клетки. При оценке влияния на мембраны информативным показателем является доля неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз, так как именно с дестабилизацией лизосомальных мембран, по современным представлениям, связаны ранние этапы гибели клетки.

При выявлении всех этих эффектов нельзя исключить возможность того, что стабилизатор наноматериала - ПВП, считающийся инертным биосовместимым полимером, в условиях длительного поступления в организм способен тем не менее повлиять на изучаемые биомаркеры токсичности. В частности ранее была отмечена его способность незначительно угнетать активность изоформ цитохрома Р 450 CYP1A2 и CYP2B1 [25], подтвержденная данными, полученными в настоящем исследовании. На этом фоне НЧ Ag, вводимые вместе с ПВП, оказывают противоположное ему действие, приводя к повышению активности всех изученных изоформ микросомальных монооксигеназ начиная с дозы НКС 1 мг на 1 кг массы тела. Активность конъюгирующих ферментов печени глутатионтрансферазы и УДФглюкуронозилтрансферазы также специфически повышается у животных, получавших НКС, причем данный эффект является значимым при дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Можно предположить, что выявленные изменения свидетельствуют о функциональном перенапряжении систем I и II стадий детоксикации ксенобиотиков.

Другими чувствительными энзиматическими маркерами воздействия НЧ Ag, как показали проведенные исследования, являются лизосомальные ферменты арилсульфатазы А, В и β-галактозидаза. Известно, что при недостаточности арилсульфатаз возможно развитие некоторых лизосомных болезней накопления, проявляющихся, в частности, в отложении в тканях животных липофусцина [26]. Лизосомальная β-галактозидаза выполняет важную биологическую функцию, участвуя в контроле роста клеток и, в частности, в феномене их репликативного старения [27]. Доза НКС, при которой отмечаются изменения активности обоих маркерных ферментов, составляет не менее 10 мг на 1 кг массы тела. При этом важно отметить, что даже в наибольшей дозе НКС значимо не влияет на величину неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз, и, следовательно, наблюдаемые изменения не связаны с изменением под действием НЧ Ag стабильности лизосомальных мембран.

В литературе имеются данные о том, что НЧ Ag являются индукторами оксидантного стресса в клеточных культурах in vitro и в организмах гидробионтов [13, 28]. Эти эффекты наблюдаются, однако, только при достаточно высоких концентрациях НЧ (0,1 мг/см3 по Ag), причем покрытие ПВП препятствует их проявлению. По-видимому, благодаря этому стандартные показатели ПОЛ, изученные в настоящем эксперименте (уровни малонового диальдегида и диеновых конъюгатов сыворотки крови животных) не возрастают даже при наибольшей дозе НКС.

В числе чувствительных маркеров воздействия НКС на организм животных следует указать также на активность ферментов ЩФ и ГП. Достоверное и выраженное повышение активности ЩФ под действием введения НКС в дозе 10 мг на 1 кг массы тела не может быть, по-видимому, объяснено повреждением гепатоцитов, поскольку не сопровождается соответствующим ростом активности АЛТ и АСТ. Активность ГП эритроцитов, напротив, с ростом дозы НКС монотонно снижается, причем пороговой дозой НКС для проявления этого эффекта является 1 мг на 1 кг массы тела. При объяснении этих эффектов следует иметьв виду, что активность обоих этих ферментов в организме зависит от микроэлементного статуса: ЩФ - от обеспеченности цинком, а ГП - селеном. Это позволяет предположить, что в механизме действия на организм НЧ Ag определенную роль может играть взаимодействие Ag с другими микроэлементами.

Таким образом, проведенный эксперимент позволил выявить ряд чувствительных энзиматических маркеров воздействия на организм экспериментальных животных НЧ Ag в составе препарата НКС, стабилизированного ПВП. В числе этих маркеров - активности изоформ цитохрома Р450 CYP1A1, 1A2 и 2B1, конъюгирующих ферментов, ЩФ, ГП. Изменения всех перечисленных маркеров, а также показателей азотистого обмена (креатинин, мочевая кислота) отмечаются в интервале доз НКС от 1,0 до 10,0 мг на 1 кг массы тела в условиях 92-суточного перорального поступления. В дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела никаких изменений в активности исследованных маркеров не выявлено.

Литература

1. Fabrega J., Fawcett S., Renshaw J., Lead J. Silver nanoparticle impact on bac-terial growth: effect of pH, concentration, and organic matter // Environ. Sci. Technol. 2009. Vol. 43, N 19. P. 7285-7290.

2. Savage N., Diallo M.S. Nanomate-rials and water purification: opportunities and challenges // J. Nanopart. Res. 2005. Vol. 7, N 4-5. P. 331-342.

3. Zodrow K., Brunet L., Mahendra S., Li D. et al. Polysulfone ultrafiltration membranes impregnated with silver nanoparticles show improved biofouling resistance and virus removal // Water Res. 2009. Vol. 43, N 3. P. 715-723.

4. Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging // Nanomedicine (London). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.

5. The future demand of silver: industrial demand. The Silver Institute. Washington DC, 2011. P. 27-32. URL: www.silverinstitute.org/site/wp-content/uploads/ 2012/11/ OutlookSilverDemand.pdf

6. Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E. et al. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with the reproduction/devel-opmental toxicity screening test // Nanotoxicology. 2014. Vol. 8, N 4. P. 349-362.

7. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 575-583.

8. Korani M., Rezayat S.M., Gilani K., Arbabi Bidgoli S. et al. Acute and subchronic dermal toxicity of nanosilver in guinea pig // Int. J. Nanomed. 2011. Vol. 6. P. 855-862.

9. Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 162-168.

10. Sung J.H., Ji J.H., Park J.D., Yoon J.U. et al. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles // Toxicol. Sci. 2009. Vol. 108, N 2. P. 452-461.

11. Sung J.H., Ji J.H., Yoon J.U., Kim D.S. et al. Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 567-574.

12. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure // ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 7427-7442.

13. Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms // Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59.

14. Burke M.D., Thompson S., Elcombe C.R., Halpert J. et al. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450 // Biochem. Pharmacol. 1985. Vol. 34, N 18. P. 3337-3345.

15. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xeno-biotic metabolism // Biochemical Toxicologe - a Practical Approach / eds K. Snell, B. Mullock Oxford, UK : IRL Press, 1987. P. 183-215.

16. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования : пер. с англ. М. : Мир, 1980. 342 с.

17. Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuroniltransferase (rat liver) // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169-176.

18. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol.Chem. 1974. Vol. 249, N 22. P. 7130-7139.

19. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 59-61.

20. Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Гиг. и сан. 2002. № 2. С. 69-72.

21. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 56-58.

22. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh ho-mogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging , CCl4 intoxication and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol. 23, N 3. P. 302-311.

23. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. 1983. № 3. С. 33-35.

24. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q. et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex // Asian J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2004; Vol. 4, N 3. P. 215-218.

25. Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 9-18.

26. Jolly R.D., Walkley S.U. Lysosomal storage diseases of animals: an essay in comparative pathology // Vet. Pathol. 1997. Vol. 34, N 6. P. 527-548.

27. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M. et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92, N 20. P. 9363-9367.

28. Farkas J., Christian P., Gallego-Urrea J.A., Roos N. et al. Uptake and effects of manufactured silver nanoparticles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill cells // Aquat. Toxicol. 2011. Vol. 101, N 1. P. 117-125.