Влияние технологических стрессовых факторов на экспрессию генов патогенности возбудителей пищевого кампилобактериоза Сampylobacter jejuni

Резюме

Изучение на генетическом и метаболическом уровнях ответов на холодовое воздействие Campylobacter jejuni - одного из наиболее распространенных возбудителей пищевых токсикоинфекций - имеет важное значение для выяснения механизмов приобретения продуктами, загрязненными кампилобактериями, опасных свойств, эти данные также необходимы для создания эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов. Проведен подбор 5 пар олигонуклеотидных праймеров для выявления экспрессии генов cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA, кодирующих основные факторы патогенности бактерий С. jejuni - способность к адгезии и инвазии эпителиальных клеток, продукции CDT-токсина и подвижности. Для количественной оценки уровней экспрессии целевых генов C. jejuni разработан сравнительный метод определения количества продуктов амплификации генов, кодирующих факторы патогенности Campylobacter spp., с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с интеркалирующими красителями. Для расчета и количественной оценки экспрессии генов получены математические модели, позволяющие проводить экстраполяцию значений пороговых циклов амплификации к исходному числу копий РНК/ДНК в тестируемых пробах. Установлено, что экспозиция бактерий C. jejuni под воздействием низких температур на уровне +4 °С не приводила к увеличению уровней экспрессии генов cdtB и сiaB. Однако в популяциях C. jejuni, подвергнутых замораживанию с последующей инкубацией при оптимальной для данного патогена температуре +42 °С, происходит усиление экспрессии мРНК, кодирующих синтез белковой субъединицы В цитолетального токсина и антигенных маркеров факторов инвазии этого возбудителя. Количество копий РНК у бактерий C. jejuni после стрессового воздействия увеличивалось на 1,14-2,6 логарифмических порядка в сравнении с интактными культурами. Экспрессия генов cdtB и сiaB у C. jejuni может служить индикатором клеточного ответа на стресс и способствует восстановлению функций бактериальной клетки после прекращения холодового воздействия и возвращения возбудителя в условия, благоприятные для реализации его патогенного потенциала.

Ключевые слова:Сampylobacter jejuni, стрессовые воздействия, факторы патогенности, экспрессия генов, устойчивость, количественная ОТ-ПЦР с флуоресцентно-гибридизационной детекцией

Вопр. питания. 2016. № 1. С. 66-74.

Жизнедеятельность микроорганизмов в той или иной экологической нише непосредственно связана с генетически закрепленной способностью включать регуляторные системы изменчивости на разных стадиях развития микробной клетки.

Перестройка популяционных структур патогенов в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при различных пищевых инфекциях, что требует углубленного изучения биохимических и генетических аспектов этой проблемы.

Наиболее признанной в настоящее время теорией возникновения новых свойств и генетических систем, регулирующих баланс микробных популяций и экспрессию факторов патогенности, является концепция стрессовых ответов микроорганизмов на химические, физические и биологические воздействия.

С учетом многообразия свойств микробных популяций, фенотипического полиморфизма контаминантов пищи, изменения традиционных технологий переработки сырья и способов хранения готовой продукции возникает необходимость углубленного изучения наиболее значимых стрессовых воздействий, обусловливающих деструкцию микроорганизмов или формирование толерантности к неблагоприятным условиям среды.

Изменения метаболических профилей пищевых патогенов в результате экспрессии генов патогенности (токсинов, инвазинов, адгезинов, мембраноразрушающих ферментов и др.) носят адаптивный характер и во многом зависят от физико-химических свойств пищевых субстратов и технологических параметров производства.

Изучение механизмов формирования стрессовой толерантности патогенов позволяет прогнозировать интенсивность размножения бактериальных популяций в пище, оценивать способность возбудителей к преодолению защитных барьеров макроорганизма и, соответственно, степень риска, связанную с применением новых видов технологических воздействий при изготовлении пищевых продуктов.

В процессе производства и хранения пищевых продуктов микроорганизмы подвергаются разнообразным внешним воздействиям, формируя соответствующие стрессовые ответы как на уровне повреждения клеточных оболочек, так и путем изменений ДНК, мембран и энзимов микробной клетки. Наиболее сильным стрессом считают нагревание, которое не только влияет на термотолерантность, но и может вызывать устойчивость к другим стрессовым факторам. Под влиянием низких температур в пищевых продуктах у бактерий также может возникать стрессовый ответ; такие воздействия могут варьировать от сравнительно мягких режимов до экстремальных, выживание при которых требует наличия ряда белков холодового шока [1, 2].

Изучение на генетическом и метаболическом уровнях ответов на холодовое воздействие Campylobacter jejuni - одного из наиболее распространенных возбудителей пищевых токсикоинфекций - имеет важное значение для выяснения механизмов приобретения продуктами, загрязненными кампилобактериями, опасных свойств, эти данные также необходимы для создания эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов. Бактерии C. jejuni обладают несколькими факторами вирулентности, которые определяются такими свойствами возбудителя, как хемотаксис и подвижность, адгезия и инвазия, наличие гликозилирующих систем, продукция цитолетального токсина CDT, капсулообразование, образование липоолигосахаридов [3-5].

При охлаждении происходят изменения в уровне экспрессии различных генов C. jejuni - появляются мембранные белки с массой более 70 кД, не экспрессируемые при температуре 37 °С, наблюдаются изменения микро- и макроморфологии клеток, когда форма меняется со спиралевидной на кокковидную, уменьшается размер жгутиков.

Ж.Н. Шурышевой в 2007 г. [6] было показано, что C. jejuni из птицепродуктов формируют колонии разного морфотипа (S или R) в зависимости от источника выделения - замороженного или охлажденного мяса кур соответственно. Поскольку микробный полиморфизм является одним из механизмов выживаемости микробов с паразитическими свойствами, это можно расценивать как звено в механизме сохранения возбудителя при ухудшении условий обитания.

В целом признается, что C. jejuni способны длительное время находиться при охлаждении в живом состоянии в высоких концентрациях.

Описанные отличия кампилобактеров от других пищевых патогенов и выраженная способность к полиморфизму позволяют им устоять против целого ряда мер, направленных на снижение микробного загрязнения в процессе производства пищевых продуктов. Это подтверждается в условиях предприятий по переработке птицепродуктов, где все технологические процессы происходят при низких температурах.

Практическое значение исследований по данной проблеме состоит в возможности создания более эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах производства и хранения пищевых продуктов, а также внедрения предупредительных мер для снижения риска контаминации продуктов наиболее опасными возбудителями пищевых токсикоинфекций C. jejuni.

В связи с изложенным целью данной работы являлось изучение влияния температурных стрессовых воздействий на экспрессию генов - регуляторов транскрипции и генов, кодирующих признаки патогенности у C. jejuni.

В качестве мишеней были выбраны 5 генов, участвующих в патогенезе кампилобактерий: cadF - кодирует поверхностный мембранный фибронектинсвязывающий белок, обусловливает адгезию и колонизацию C. jejuni, cdtB - синтез субъединицы В цитолетального токсина, ciaB и iamA - генные маркеры инвазивности возбудителя, flaA - синтез флагеллинов (подвижность). Выбранные генные детерминанты патогенности термотолерантных кампилобактеров были использованы в данной работе для изучения физиологических свойств штаммов C. jejuni, выделенных из сырых птицепродуктов методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени.

Материал и методы

В работе использованы 9 штаммов кампилобактерий, выделенных из охлажденных и замороженных птицепродуктов. Культуры были идентифицированы как C. jejuni, в том числе C. jejuni ssp. jejuni 1, C. jejuni ssp. jejuni 2, C. jejuni ssp. doylei (табл. 1).

Для изучения воздействия низких температур на уровни экспрессии различных факторов патогенности у штаммов C. jejuni использовали два температурных режима хранения: охлаждение до +4±1 °С и замораживание до -18±1 °С. Бульонную культуру C. jejuni вносили в пищевой продукт (куриное филе, куриный фарш) в соотношении 1:9, после чего зараженные субстраты термостатировали в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 2 ч. Плотность популяции микро- организмов в исследуемых пробах составляла 106-107 КОЕ/см3 (г). Далее тестируемые образцы быстро охлаждали до температур +4±1 и -18±1 °С; длительность воздействия составляла 2,5-4 ч. В качестве контроля использовали зараженные образцы, которые хранили при комнатной температуре (20±2 °С), а также исходную бульонную культуру.

Охлажденные до +4 °С пробы экстрагировали сразу после выдержки, замороженные образцы помещали в термостат и прогревали до +42 °С.

Куриный фарш до экстракции центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, для экстракции использовали супернатант.

По окончании обработки проводили экстракцию нуклеиновых кислот с использованием автоматизированной станции "NucliSens easyMag" ("БиоМерье", Франция) и наборов для экстракции ("РИБО-преп", РФ). Очищенные пробы РНК/

ДНК после тщательного перемешивания делили на две части, с одной из которых ставили реакцию обратной транскрипции (ОТ) (30 мин при 37 °С, наборы "Реверта-L"), далее полученные пробы кДНК тестировали параллельно с экстрактами, содержащими интактную ДНК (без ОТ), методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) - вариант 1.

Аналогичной процедуре подвергали культуры C. jejuni и зараженный фарш, выдержанные при комнатной температуре +20 °С, - вариант 2.

В 3-м варианте эксперимента тестировали культуры C. jejuni и искусственно зараженные пищевые субстраты, подвергнутые замораживанию до -18 °С с последующим прогревом до +42 °С. Амплификацию проводили на приборе "ABI PRISM 7500 RealTime PCR" ("Applied Biosystems", США).

Полученные экстракты использовали для проведения сравнительных исследований уровней экспрессии генов, кодирующих основные факторы патогенности C. jejuni.

Для изучения выбранных генов-мишеней cadF, cdtB, ciaB, flaA, iamA был проведен подбор 5 пар олигонуклеотидных праймеров [7-12]. Олигонуклеотидные последовательности для ПЦР-детекции вышеуказанных генов приведены в табл. 2. В работе также использовали видоспецифическую для C. jejuni последовательность в области 16S рРНК [13, 14].

Для проведения амплификации вышеуказанных генов методом ПЦР были подобраны составы реакционных смесей и разработана программа амплификации (табл. 3).

Для постановки ПЦР использовали реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR+ROX ("Евроген", РФ), содержащую высокопроцессивную Taq ДНК-полимеразу со специфическими моноклональными антителами, интеркалирующий краситель SYBR Green I, референсный краситель ROX, смесь нуклеотидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер.

Результаты

Для количественной оценки уровней экспрессии выбранных целевых генов C. jejuni при выполнении экспериментальных исследований был разработан сравнительный метод определения продуктов амплификации генов - регуляторов транскрипции и генов, кодирующих факторы патогенности Campylobacter spp., с использованием ПЦР в реальном времени с флуоресцентно-гибридизационной детекцией, c учетом рекомендаций K.J. Livak, T.D. Schmittgen (2001) [15].

На первом этапе для получения сравнительных количественных зависимостей проводили постановку ПЦР, используя последовательный ряд десятикратных разведений штаммов C. jejuni с предварительно рассчитанной концентрацией живых клеток (КОЕ/мл) в исходной суспензии. Ориентировочную оценку исходного числа копий амплифицируемых фрагментов ДНК в исследуемых пробах получали на основании анализа результатов амплификации ДНК, которые регистрировали по каналу флуоресценции FAM/Green. Полученные данные, представленные в виде кривых накопления флуоресцентного сигнала (ΔRn), анализировали с помощью программного обеспечения системы "ABI PRISM 7500 RealTime PCR". Результаты интерпретировали по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствовало наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Сt.

Значение Сt для положительных проб, содержащих РНК или ДНК C. jejuni, в данной работе было установлено эмпирически на уровне 38-40 (по завершении термоциклирования); увеличение числа циклов амплификации до 45 не приводило к появлению соответствующих кривых накопления флуоресцентного сигнала, или характер флуоресценции не позволял оценивать полученные результаты как достоверные. Исходя из этого отрицательными считали пробы при отсутствии сигнала флуоресценции (neg) или при значениях Сt кривой амплификации более 38. Значения пороговых циклов для ряда разведений тест-штаммов в десятикратно убывающих концентрациях приведены в табл. 5.

Анализ полученных количественных зависимостей значений Сt для использованных генов-мишеней определил направленность дальнейших исследований: в качестве наиболее перспективных объектов детекции были выбраны геномные последовательности cdtB и ciaB, кодирующие продукцию основного токсического белка C. Jejuni и факторы инвазии возбудителя.

Характер кривых накопления ампликонов для генов cadF, flaA, iamA свидетельствовал о пригодности этих мишеней для целей детекции C. jejuni, однако не давал возможности для экстраполяции результатов от числа бактериальных клеток к концентрации целевых нуклеиновых кислот в исследуемой пробе. При постановке ОТ-ПЦР с целевыми генами cadF, flaA, iamA были получены те же закономерности скорости накопления флуоресцентного сигнала.

Для экстраполяции значений Сt к исходному числу копий РНК/ДНК в пробах учитывали экспоненциальную зависимость, используемую для расчета теоретической концентрации ампликонов при многократном повторении температурного цикла, которая выражается как:

Xn=X0×2n, (1)

где X0 - стартовое количество ДНК-мишени, Xn - концентрация ампликонов после n циклов.

При этом концентрация копий рассчитывается следующим образом:

RT=A×X0k×(1+Ek)Сtk, (2)

где RT - пороговое значение флуоресценции, А - константа (коэффициент пропорциональности), k - исследуемый образец.

С учетом зависимостей, полученных при тестировании десятикратных разведений суспензий штаммов C. jejuni, скорость накопления ампликонов в ходе ПЦР при тестировании целевого гена cdtB оценивали в соответствии с формулой (3):

Сt=-2,644lgКОЕ+34,355. (3)

Скорость накопления ампликонов при тестировании целевого гена ciaB оценивали в соответствии с формулой (4):

Сt=-2,589lgКОЕ+39,504. (4)

Для определения количества копий исследуемых генов и нормализации значений относительно числа исходных бактериальных клеток использовали фрагмент хромосомной последовательности 16S рРНК (рис. 1).

Значения Сt, полученные для cdtB и ciaB методом ПЦР без ОТ, использовали в качестве базовых величин для выявления относительной экспрессии генов непосредственно по концентрации мРНК в клетках и сравнительной оценки количества транскриптов кДНК в контрольных и опытных образцах C. jejuni, а также в экспериментально зараженных ими пробах пищевых продуктов.

Результаты амплификации фрагментов сdtB и сiaB, кодирующих продукцию цитолетального токсина и факторы инвазии C. jejuni, а также последовательности 16S рРНК в исследуемых пробах, подвергнутых различным температурным воздействиям, приведены в табл. 6-8.

Обсуждение

Известно, что стрессовый ответ Campylobacter spp. на охлаждение не идентичен таковому у других пищевых патогенов, таких как сальмонеллы и E. coli, и не сопровождается выработкой белков теплового шока, в связи с чем охлажденные клетки кампилобактерий не становятся термотолерантными. У C. jejuni также не найдены белки холодового шока, что частично объясняет их неспособность расти ниже 30 °С. Известно, что разные виды Campylobacter spp. обладают разными профилями выживаемости при низких температурах, но механизм адаптации к этим факторам остается неизвест ным [16]. В то же время установлено, что при низких температурах C. jejuni проявляют значительную метаболическую активность, в том числе способны к синтезу некоторых белков и хемотаксису. При 4 °С неоднократно фиксировали увеличение плотности популяции на 0,5-1,0lg, хотя это может свидетельствовать не столько о способности C. jejuni расти при охлаждении, сколько об осуществлении перехода между жизнеспособным культивируемым и некультивируемым состоянием [16].

Полученные в данной работе результаты показали, что в большинстве случаев культуры C. Jejuni после охлаждения не экспрессировали факторы патогенности, кодируемые генами сdtB и сiaB, в сравнении с культурами, хранившимися при +20 °С. Полученные средние значения Сt после обратной транскрипции РНК в ДНК свидетельствуют о том, что количество исходных копий мРНК в подвергнутых холодовому шоку бактериальных суспензиях было на 10-20% ниже, чем в пробах, инкубированных при комнатной температуре. Эта закономерность наблюдалась как для чистых культур C. jejuni, так и при тестировании образцов сырого куриного фарша, экспериментально зараженного тест-штаммами в соответствующих концентрациях.

Выявленные количественные различия по числу амплифицированных копий фрагментов генов сdtB и сiaB в охлажденных и неохлажденных образцах, по всей вероятности, были связаны с угнетением основных физиологических функций кампилобак- терий под действием холодового шока и увеличением времени генерации исследуемых популяций.

В случае тестирования нуклеиновых кислот опытных и контрольных проб по фрагменту хромосомной последовательности 16S рРНК однозначной тенденции не выявлено, различия по числу копий РНК в охлажденных и контрольных пробах находились в пределах статистических колебаний и рассматривались как недостоверные. Следует отметить, что полученные данные подтвердили пригодность использования геномной последовательности 16S рРНК в качестве внутреннего контроля для постановки количественной ПЦР при исследовании C. jejuni.

В целом анализ полученных результатов позволил заключить, что экспозиция жизнеспособных клеток C. jejuni под воздействием неблагоприятных для данного вида бактерий низких температур на уровне +4 оС приводит к снижению уровней экспрессии токсических белковых субъединиц CdtB и факторов инвазии, кодируемых геном сiaB.

Анализ данных, полученных в 3-м варианте эксперимента (замораживание и прогрев до +42 оС проб суспензий C. jejuni и контаминированных образцов продукта), позволил выявить иной характер изменений интенсивности накопления транскриптов.

Сопоставление значений Сt в амплифицированных пробах в вариантах ОТ-ПЦР и прямой ПЦР показало, что в популяциях C. jejuni, инкубированных при оптимальных для данного патогена температурах после воздействия холодового шока, происходит усиление экспрессии процессов транскрипции и синтеза белковых метаболитов, кодируемых генами cdtB и сiaB. Различия в количестве циклов для cdtB составили 8,8, для сiaB - 3,8 Ct.

С учетом рассчитанных ранее закономерностей накопления ампликонов в ходе ПЦР для тестштаммов C. jejuni можно предполагать, что различия в числе копий РНК в исходных пробах для целевой последовательности cdtB, установленные в данном исследовании, составляли 2,64lg, для гена сiaB - 1,14lg (рис. 2).

Заключение

Получены данные, подтверждающие увеличение экспрессии мРНК, кодирующих синтез белковой субъединицы В цитолетального токсина C. Jejuni и антигенных маркеров факторов инвазии этого возбудителя, при кратковременном температурном воздействии с последующим интенсивным прогреванием. Эти результаты позволяют предполагать, что экспрессия генов cdtB и сiaB у C. jejuni может служить индикатором клеточного ответа на стресс и способствует восстановлению функций бактериальной клетки после прекращения холодового воздействия и возвращения возбудителя в условия, благоприятные для реализации его патогенного потенциала.

Вместе с тем очевидно, что для подтверждения вышеописанного эффекта необходимы более детальные исследования метаболических процессов, участвующих в формировании стрессовых ответов Campylobacter spp. и их роли как потенциальных транскрипционных регуляторов.

В целом полученные данные свидетельствуют о необходимости углубленного изучения процессов формирования толерантности возбудителей пищевых токсикоинфекций C. jejuni, основанного на определении полного генетического и протеомного профилей патогенов, включая изучение внутриклеточных механизмов регуляции и экспрессии факторов патогенности.

Авторы выражают благодарность за помощь в разработке методических подходов, использованных для изучения экспрессии генов патогенности C. jejuni, кандидату биологических наук А.В. Булахову.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).

Литература

1. Stintzi A. Gene expression profile of Campylobacter jejuni in response to growth temperature variation // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185, N 6. P. 2009-2016.

2. Weber M.H.W., Marahiel M.A. Bacterial cold shock responses // Sci. Prog. 2003. Vol. 86. P. 9-75.

3. Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010. 592 p.

4. On S.L.W., Dorrell N., Petersen L., Bang D.D. et al. Numerical analysis of DNA microarray data of Campylobacter jejuni strains correlated with survival, cytolethal distending toxin and haemolysin analysis // Int. J. Med. Microbiol. 2006. Vol. 296, issue 6. P. 353-363.

5. Poly F., Guerry P. Pathogenesis of Campylobacter // Curr. Opin. Gastroenterol. 2008. Vol. 24, issue 1. P. 27-31.

6. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н, Пискарева И.И. Загрязненность пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. № 6. С. 38-44.

7. Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 12. P. 2637-2647.

8. Hassane D., Lee R., Mendenhall M., Picket C. Cytholetal distending toxin demonstrates genotoxic activity in a yeast model // Infect. Immun. 2001. Vol. 69, Is. 9. P. 5752-5759.

9. Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, N 3. P. 510-517.

10. Line J., Hiett K., Conlan A. Comparison of challenge models for determining the colonization dose of Campylobacter jejuni in broiler chicks // Poult. Sci. 2008. Vol. 87. P. 1700-1706.

11. van Vliet A.H., Ketley J.M. Pathogenesis of enteric Campylobacter infection // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 90, issue S6. P. 45S-56S.

12. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5, N 9. P. 665-679.

13. Josefsen M.H., Cook N., D’Agostino M. et al. Validation of a PCR-based method for detection of food-borne thermotolerant Campylobacters in a multicenter collaborative trial // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4379-4383.

14. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in chicken rinse samples by using flotation prior to real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 10. P. 5759-5764.

15. Livak K. J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Ст Method // Methods. 2001. Vol. 25. P. 402-408.

16. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, issue 03. P. 237-257.